A new analytical methodology was developed in order to investigate the presence of five psychoactive drugs (anxiolytic and antiepileptics), namely, bromazepam, carbamazepine, clonazepam, diazepam, and lorazepam in the effluent of the University Hospital of Santa Maria (HUSM) of the Federal University of Santa Maria (UFSM), since these compounds are widely used in the treatment of anxiety and epilepsy. Samples were collected from two points to check the concentration of the compounds: Point A (Emergency) and point B (General Effluent - which covers the Central Library and HUSM). The method of clean-up/pre-concentration by solid phase extraction (SPE) was used to assess the occurrence of anxiolytic and antiepileptic drugs in the effluent of HUSM. Three methods were developed and validated to determine these compounds: i) high performance liquid chromatography with ultraviolet detection (HPLCUV), ii) high performance liquid chromatography with detection by mass spectrometry (LC-MS), and iii) liquid chromatography-ion trap-tandem mass spectrometry with electrospray ionization (LCMS/ MS_Qtrap). Among the methods evaluated, LC-MS/MS_Qtrap with electrospray in positive mode yielded better results. The detection limit (LOD, S/N ≥3) for lorazepam and bromazepam was 4.90±0.95 ng L-1 and for carbamazepine, clonazepam and diazepam, 6.10±1.50 ng L-1. The limit of quantification (LOQ, S/N ≥10) was 30.00±1.10 ng L-1 bromazepam , clonazepam and lorazepam; 50.00±1.81 ng L-1, carbamazepine; and 40.00±0.98 ng L-1 diazepam. The linear range of the assay (LC-MS/MS_Qtrap) was 30-1500 ng L-1 for bromazepam; 50-2500 ng L-1, carbamazepine; 30-2500 ng L-1, clonazepam; 40-2500 ng L-1, diazepam; and 30 - 2000 ng L-1, lorazepam. The correlation coefficient (R2>0.997) for all compounds. The effectiveness of the methodology was verified by recovery with the fortification of three concentration levels in triplicate samples of hospital effluent. The average recovery rates observed were: 93.9±2.1% for bromazepam; 92.6±4.2%, carbamazepine; 93.9%±3.0 clonazepam; 91.8%±6.0 for diazepam; and 93.8%±4.3 for lorazepam. The mean concentrations of psychiatric drugs detected in the effluent of the Emergency and General Effluent were respectively: 195.0±6.4 ng L-1 and 137.1±7.0 ng L-1 for bromazepam; 589.6±6.1 ng L-1, and 460.7±9.3 ng L-1, carbamazepine; 645.0±0.3 ng L-1 and 571.0± 9.9ng L-1, diazepam; 95.7±6.7 ng L-1 and 42.4±4.2 ng L-1 lorazepam; and 134.3 ± 9.8 ng L-1 and 56.9 ± 9.9 ng L-1 clonazepam. The identification of metabolites in the hospital effluent was made through (LCMS/ MS_Qtrap). The metabolites identified were: 3-hydroxybromazepam (bromazepam), 7- aminoclonazepam (clonazepam), carbamazepine 10,11-epoxide, 10-dihydroxy-10,11- dihydrocarbamazepine, iminoquinone, 2-hydroxy-carbamazepine and acridone (carbamazepine), and nordiazepam, oxazepam and temazepam (diazepam), and their fragmentation pathways were proposed. Was performed a preliminary risk assessment of anxiolytic and antiepileptic drugs with the aid of literature data and found that the carbamazepine and diazepam compounds showed the highest risk (0.85 and 0.90, respectively) among the compounds analyzed. According to the results we can say that they present medium risk requiring more attention in terms of toxicity. However, no literature data were found on the Predicted No Effect Concentration (PNEC) for bromazepam, lorazepam, clonazepam, not allowing the calculation of risk quotient (RQ) for these compounds.Therefore, we observed the occurrence of anxiolytic and antiepileptic drugs in the effluent of HUSM at concentrations in the order of ng L-1. The analytical method for LC-MS/MS_Qtrap developed for the determination of psychoactive drugs (bromazepam, carbamazepine, clonazepam, diazepam and lorazepam) in hospital effluent proved to be sensitive and selective, eliminating laborious sample handling and requiring chromatographic run of just 15 minutes. The occurrence of these drugs and environmental risks associated demonstrate the need for more efficient treatment for the hospital effluent. / Uma nova metodologia analítica foi desenvolvida com a finalidade de investigar a presença de cinco fármacos psicoativos (ansiolíticos e antiepilépticos): bromazepam, carbamazepina, clonazepam, diazepam e lorazepam no efluente do Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), visto que estes compostos são amplamente utilizados no tratamento da ansiedade e da epilepsia. As amostras foram coletadas de dois pontos para a verificação da concentração dos compostos: o Ponto A (efluente do PAHUSM) e o ponto B (efluente geral que abrange o HUSM e a Biblioteca Central). Utilizou-se um método de clean-up/pré-concentração por extração em fase sólida, para avaliar a ocorrência de ansiolíticos e antiepilépticos no efluente do HUSM. Deste modo, três métodos para determinar estes compostos foram desenvolvidos e validados: i) cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por ultravioleta (HPLC-UV), ii) cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por espectrometria de massa (LC-MS) e iii) cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa com ionização por eletronebulização e armadilha de íons (LC-MS/MS_Qtrap). Dentre os métodos avaliados, o LC-MS/MS_Qtrap com eletronebulização no modo positivo obteve melhores resultados. O limite de detecção (LOD, S/N ≥3) para bromazepam e lorazepam foi 4,90±0,95 ng L-1 e, para carbamazepina, clonazepam e diazepam, 6,10±1,50 ng L-1. O limite de quantificação (LOQ, S/N ≥10) foi de 30,00±1,10 ng L-1, para bromazepam, clonazepam e lorazepam; carbamazepina, 50,00±1,81 ng L-1 e, diazepam, 40,00±0,98 ng L-1. A faixa linear do método (LC-MS/MS_Qtrap) para bromazepam foi de 30-1500 ng L-1, para carbamazepina 50-2500 ng L-1; clonazepam de 30-2500 ng L-1, diazepam 40-2500 ng L-1 e para lorazepam foi de 30-2000 ng L-1. O coeficiente de correlação (R2 >0,997) para todos os compostos. A eficiência da metodologia foi verificada através da recuperação com a fortificação em três níveis de concentração em triplicata de amostras de efluente hospitalar. As taxas de recuperação média constatadas foram: para bromazepam 93,9%±2,1; carbamazepina 92,6%±4,2; clonazepam 93,9%±3,0; diazepam 91,8%±6,0 e lorazepam foi de 93,8%±4,3. As concentrações médias das drogas psiquiátricas detectadas no efluente do PA-HUSM e efluente geral foram respectivamente: bromazepam, 195,0±6,4 ng L-1 e 137,1±7,0 ng L-1; carbamazepina, 589,6±6,1 ng L-1 e 460,7±9,3 ng L-1, diazepam, 645,0±0,3 ng L-1 e 571,0±9,9 ng L-1, lorazepam, 95,7±6,7 ng L-1 e 42,4±4,2 ng L-1 e clonazepam, 134,3±9,8 ng L-1 e 56,9±9,9 ng L-1. A identificação dos metabólitos no efluente hospitalar foi realizada através de LC-MS/MS_Qtrap. Os metabólitos identificados foram: 3-hidroxi-bromazepam (bromazepam), 7-amino-clonazepam (clonazepam), carbamazepina 10,11-epóxido, 10-dihidroxi-10,11-dihidrocarbamazepina, iminoquinona, 2-hidroxi-carbamazepina e acridona (carbamazepina), nordiazepam, oxazepam e temazepam (diazepam) e, seus caminhos de fragmentação foram propostos. Foi realizada uma avaliação de risco preliminar de ansiolíticos e antiepilépticos com o auxílio de dados da literatura e foi verificado que os compostos carbamazepina e diazepam apresentaram maior risco com Quociente de Risco teórico (0,85 e 0,90, respectivamente) entre os compostos analisados. De acordo com os resultados obtidos pode-se dizer que apresentam risco médio, requerendo maior atenção em termos de toxicidade. Entretanto, dados na literatura não foram encontrados sobre a Concentração Prevista que Não Causa Efeito (PNEC) para bromazepam, clonazepam e lorazepam, impossibilitando o cálculo do quociente de risco (QR) para estes compostos. Portanto, foi evidenciada a ocorrência de ansiolíticos e antiepilépticos no efluente do HUSM em concentrações na ordem de ng L-1. O método analítico por LC-MS/MS_Qtrap desenvolvido para a determinação das drogas psicoativas (bromazepam, carbamazepina, clonazepam, diazepam e lorazepam) no efluente hospitalar provou ser sensível, seletivo, dispensando manipulação laboriosa da amostra e exigindo corrida cromatográfica de apenas 15 minutos. A ocorrência destes fármacos e os riscos ambientais associados demonstram a necessidade de sistema mais eficiente de tratamento para o efluente hospitalar.

A lamotrigina é um fármaco relativamente novo que tem se mostrado útil no tratamento de diferentes crises epilépticas. Este fármaco encontra-se no mercado na forma de comprimidos e, apesar de seu amplo uso na terapêutica, não há descrição de métodos analíticos em códigos oficiais para o controle de qualidade da lamotrigina em sua forma farmacêutica. Estudos de estabilidade não foram encontrados na literatura científica, apenas dados fornecidos pela indústria. No FDA (2006) estão descritas as condições para o teste de dissolução dos comprimidos de lamotrigina, mas não há relatos sobre a forma de quantificação dos mesmos. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivos o desenvolvimento e validação de métodos analíticos qualitativos e quantitativos, realização de estudo preliminar de estabilidade e o desenvolvimento e validação de método de dissolução para o controle de qualidade da lamotrigina em comprimidos.A caracterização da substância química de referência foi realizada através de calorimetria diferencial exploratória (DSC) e espectrofotometria na região do infravermelho (IV). A cromatografia em camada delgada (CCD), espectrofotometria de absorção no ultravioleta (UV) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram utilizadas para identificação da lamotrigina em comprimidos. Para a quantificação dos comprimidos, foram utilizadas a espectrofotometria de absorção no ultravioleta (UV) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O estudo preliminar de estabilidade térmica foi realizado submetendo-se as amostras ao calor seco de 80ºC. A fotoestabilidade foi avaliada em soluções de lamotrigina armazenadas em câmara de luz a 254 nm por um período de até quinze dias, demonstrando que o fármaco é sensível à luz. As amostras também foram submetidas à hidrólise ácida por um período de 54 horas, observando-se decaimento no teor do fármaco. Foi desenvolvido e validado um método de dissolução simples e rápido para o controle de qualidade dos comprimidos de lamotrigina. / Lamotrigine is a relative new antiepileptic drug that seems useful in the treatment of different seizures. Lamotrigine can be found in the market in tablets. Despite being used in therapeutics, methods for quality control of lamotrigine in tablets are not available in the official codes. Stability studies were just informed by the producer. FDA (2006) described the conditions of dissolution test to lamotrigine in tablets, but there is nothing about the quantification method. In this way, the aim of this work was the development and validation of analytical methods, preliminary study of stability and the development and validation of a dissolution method to quality control of lamotrigine in tablets. The characterization of the reference standard was carried out by differential scanning calorimetry (DSC) and infrared spectroscopy (IR). Thin-layer chromatography (CCD), ultraviolet spectroscopy (UV) and high performance liquid chromatography (HPLC) was performed to lamotrigine qualitative analysis. UV and HPLC were performed to lamotrigine quantitative analysis. The sample solutions were submitted under UV-light at 254 nm during 15 days, showing degradation and decrease in the labeled amount. Thermal degradation was carried by dry heat at 80°C in solid powder. The solution samples was also submitted to acid condition with HCL 1 M during 54 hours. Rapid and simple dissolution method to routine quality control of lamotrigine was developed and validated.

O fígado desempenha um papel central na disposição metabólica de vários agentes químicos endógenos e exógenos, incluindo quase todos os fármacos. Neste processo de biotransformação pode ocorrer a formação de metabólitos intermediários altamente reativos que se não forem convenientemente eliminados podem interagir com macromoléculas celulares lesando o órgão. A hepatotoxicidade idiossincrática associada ao uso de antiepilépticos aromáticos (AEA) é bem conhecida e tem sido atribuída ao acúmulo de intermediários tóxicos (areno-óxidos) formados durante a bioativação hepática. Embora a participação de processos imunológicos no mecanismo de ação tóxica dos AEA tenha sido demonstrada, existe a possibilidade de mecanismos adjuvantes envolvendo a toxicidade mitocondrial, evento ainda não explorado na literatura científica. Neste estudo avaliou-se, in vitro, o efeito dos AEA: carbamazepina, fenitoína e fenobarbital, bem como dos seus respectivos metabólitos na função mitocondrial e na indução do estresse oxidativo em mitocôndrias de fígado de rato, como possível mecanismo de ação hepatotóxica desses fármacos. Sistema microssomal hepático de rato foi utilizado para bioativação dos fármacos e produção dos respectivos metabólitos in vitro. Sem a bioativação, somente o fenobarbital (em concentrações elevadas) apresentou efeitos inibidores sobre o estado 3 da respiração, síntese de ATP e potencial de membrana, sem, contudo induzir o estresse oxidativo. Quando bioativados, todos os fármacos apresentaram efeitos sobre a função mitocondrial através de processo mediado por estresse oxidativo. Todos os fármacos bioativados afetaram a respiração mitocondrial, causando diminuição do consumo de oxigênio no estado 3, diminuição do RCR e aumento do consumo de oxigênio no estado 4. Foram também evidenciadas alterações na captação/liberação de cálcio, inibição da síntese de ATP, diminuição do potencial de membrana e inibição do intumescimento mitocondrial induzido pelo cálcio. A oxidação de proteínas e lipídeos mitocondriais foi demonstrada pela formação de proteínas carboniladas, diminuição de proteínas com grupamentos sulfidrila, aumento de malondialdeído (MDA) e pela oxidação da cardiolipina. O sistema de defesa antioxidante mitocondrial também foi afetado, como evidenciado pela diminuição da relação GSH/GSSG (glutationa reduzida/glutationa oxidada). Os resultados sugerem fortemente a participação do dano mitocondrial, mediado pelo estresse oxidativo causado pelos metabólitos dos AEA, no desenvolvimento da hepatotoxicidade idiossincrática induzida por esses fármacos. / The liver plays a central role in the metabolic disposition of various endogenous and exogenous chemicals, including almost all drugs. During the biotransformation process, highly reactive metabolites can be produced, and if they are not detoxified, they can interact with cellular macromolecules and cause organ injury. Idiosyncratic hepatotoxicity is a well-known complication associated with aromatic antiepileptic drugs (AAED), and it has been suggested to occur due to the accumulation of toxic arene oxide metabolites. Although the participation of an immune process in the toxic action mechanism of AAED has been demonstrated, adjuvant mechanisms involving mitochondrial toxicity is also possible and such event has not been studied yet. Therefore, we investigated, in vitro, the effects of carbamazepine (CB), phenytoin (PT), phenobarbital (PB) and their respective metabolites on the hepatic mitochondrial function as well as their ability to induce oxidative stress in rat liver mitochondria, as a possible hepatotoxic action mechanism. The murine hepatic microsomal system was used to bioactivate the drugs and to produce the anticonvulsant metabolites in vitro. As an unaltered drug, only phenobarbital (in high concentrations) presented inhibitory effects on state 3 respiration, ATP synthesis, and membrane potential; however, it did not induce oxidative stress. All the bioactivated drugs affected mitochondrial function through an oxidative stress-mediated process. All the bioactivated drugs affected mitochondrial function causing decrease in state 3 respiration, decrease in RCR and increase in state 4 respiration. They also caused impairment of Ca+2 uptake /release, decrease in ATP synthesis, decrease in membrane potential and inhibition of calcium-induced swelling. Oxidation of proteins and lipids was evidenced by carbonil proteins formation, decrease in thiol proteins, increase in malonaldehyde (MDA) and cardiolipin oxidation. The mitochondrial antioxidant defense system was also affected, as evidenced by the decreased GSH/GSSG ratio (reduced glutathione/oxidized glutathione). Results strongly suggest the involvement of mitochondrial damage, which is mediated by the oxidative stress caused by the AAED metabolites, in the development of AAED-induced idiosyncratic hepatotoxicity.