La protéine de capside du virus de la mosaïque de la papaye (PapMV CP) s’assemble autour d’un ARN simple brin pour former des nanoparticules. Nous avons montré que ces nanoparticules peuvent être fusionnées à des épitopes peptidiques permettant le développement d’une réponse immunitaire protectrice. Le C-terminal de la protéine a été utilisé comme site de fusion dans nos études précédentes. Récemment, nous avons découvert que des fusions après le résidu 12 ou 187 de la CP démontrent aussi un potentiel pour fusionner les épitopes d’intérêt. Le but de ce projet de recherche est de déterminer la capacité d’induire une réponse cellulaire en utilisant des nanoparticules PapMV CP fusionnées à un épitope cellulaire sur différents sites de fusion. L’immunisation de souris avec les particules recombinantes a permis de démontrer qu’une fusion au N-terminus était plus efficace pour induire la prolifération des lymphocytes T CD8+ spécifiques. De plus, les résultats révèlent que la multimérisation de la CP sous forme de nanoparticules est un critère requis pour induire une réponse cellulaire.

Le lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL, Diffuse Large B-Cell Lymphoma) constitue le lymphome non Hodgkinien le plus fréquemment diagnostiqué. Les DLBCL sont composés principalement de deux sous groupes : l’entité nommée ABC (Activated B Cell-like) qui est la plus agressive, avec un taux de survie de 30% après traitement, et l’entité GCB (Germinal-Center B Cell). Contrairement aux GCB DLBCL, les ABC DLBCL se caractérisent par une signature génique similaire aux lymphocytes B activés par leur récepteur antigénique (BCR, B Cell Receptor) à cause de l'accumulation de mutations génétiques. Ceci a pour conséquence une activation constitutive du facteur de transcription NF-κB pour laquelle les lymphomes ABC DLBCL ont développé une profonde addiction. Toutefois, la nature pléiotrope de NF-κB rend son ciblage thérapeutique inenvisageable. Mon projet de thèse visait à caractériser de nouveaux régulateurs de la voie d’activation du facteur NF-κB par les récepteurs antigéniques en condition physiologique et pathologique. Dans un premier temps, grâce à un crible protéomique par spectrométrie de masse, nous avons identifié un complexe ternaire nommé LUBAC (Linear Ubiquitin Chain Assembly Complex) comme un acteur majeur de l’activation de NF-κB par le TCR et le BCR, et de la survie des lymphomes ABC DLBCL. Dans un second temps, le crible d’une librairie de mille deux cents molécules chimiques nous a permis d’isoler un composé sélectivement toxique in vitro pour les lymphomes ABC DLBCL. Nous montrons que ce composé entraine la mort apoptotique des ABC DLBCL sans toutefois affecter la signalisation NF-κB. Un tel composé pourrait, dans le futur, être utilisé comme une nouvelle molécule thérapeutique pour le traitement du lymphome ABC DLBCL. / The diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) is the most common non Hodgkinien lymphoma. Two main different entities composed the DLBCL : the Activated B Cell-like subtype (ABC DLBCL) witch is the most aggressive and associated with a poor survival prognostic, and the Germinal-Center B Cell subtype (GCB DLBCL). Unlike the GCB DLBCL, ABC DLBCL are characterized by a genetic signature similar to activated B lymphocytes stimulated by their antigen receptor (BCR, B cell receptor) which results from mutations accumulation. As a consequence, ABC DLBCL survival and proliferation requires the constitutive activation of NF-κB transcription factors. Because NF-κB has pleiotropic effect on different tissues, strategies aiming at targeting NF-κB heterodimers might have deleterious consequences on an organism.My project focuses on identifying new modulators involved in antigen receptor mediated NF-κB activation in physiological and pathological condition.We first performed a mass spectrometry analysis and identified the LUBAC (Linear Ubiquitin Chain Assembly Complex) as a new regulator of antigen receptor mediated a NF-κB ctivation and ABC DLBCL survival. Then, we screened a library of one thousand two hundred chemical compounds on DLBCL viability and identified one compound selectively toxic in vitro for the ABC DLBCL subtype. This compound induced ABC DLBCL apoptosis without affected NF-κB signaling. In the future, this compound could be used as a new therapeutic compound for ABC DLBCL.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Malgré le succès de l’utilisation des lymphocytes T modifiées par des récepteur antigéniques chimériques (CAR) contre les leucémies, celles-ci présentent des limites comme leur risque de CRS et leur inefficacité dans les tumeurs solides. Plusieurs autres immunothérapies cellulaires ont été proposées pour pallier à ces inconvénients. Les cellules natural killer (NK) ont plusieurs propriétés qui en font une alternative avantageuse aux cellules T dans les immunothérapies. Cependant, les cellules NK restent difficiles à modifier avec les outils actuels et leur efficacité reste limitée par les mécanismes immunosuppresseurs des tumeurs. Nous avons réussi à augmenter l’efficacité de transduction avec une nouvelle glycoprotéine, le BaEVRless. Nous avons aussi démontré que cette enveloppe ne provoque pas de modification du phénotype ou de l’activité intrinsèque des cellules NK. Dans un modèle de leucémie, nous avons déterminé que l’utilisation du BaEVRless permet la production de cellules CAR-NK fonctionnelles. Les cellules NK peuvent aussi être transduites efficacement par des constructions lentivirales portant les séquences codant pour deux constructions CAR simultanément. Nous avons aussi démontré que l’édition génomique des NK par la technologie Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats (CRISPR) est possible en utilisant une livraison non-virale. Avec cette méthode, nous avons pu réduire l’expression de NKG2A. Les cellules NK avec une expresssion réduite de NKG2A étaient résistantes à l’inhibition par HLA-E, exprimé sur des lignées de cancer du sein et du colon. Cet effet a été confirmé in vivo dans un modèle préclinique xenogénique. Ces résultats montrent deux stratégies qui pourraient permettre d’améliorer les immunothérapies à base de cellules NK. / Despite the overwhelming success of chimeric antigen receptor (CAR)-modified T lymphocytes against leukemias, some limitations have been observed, such as the risk of developing CRS and the lack of efficiency in solid tumor settings. Many other cell-based immunotherapies have been explored to circumvent those caveats. Natural killer (NK) cells present many advantageous properties that could make them a very promising alternative to T cells in immunotherapies. However, NK cells have some caveats, mainly they are hard to modify using conventional tools and they are sensitive to many inhibitory signals expressed by cancer cells. We managed to greatly improve the efficiency of transduction using a novel viral glycoprotein, BaEVRless. In the process, we determined that this novel enveloppe glycoprotein did not modify the phenotype or intrinsic activity of the transduced NK cells. In a leukemia model, we also showed that the BaEVRless can be used to generate functionnal CAR-NK cells. Moreover, the NK cells can be transduced with larger lentiviral constructions bearing two simultaneous CAR-coding sequences. We also demonstrated that Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats (CRISPR) modification of NK cells using a non-viral approach was possible. Using this approach, we generated NK cells with lower NKG2A expression, that were resistant to the inhibitory effects of HLA-E. This affect was seen in a breast cancer model and a colon cancer model. The in vitro results were confirmed in an in vivo preclinical xenogeneic model. Together, those results represent two improvements applicable to NK cell-based immunotherapies.

La synthèse d’oligosides complexes reste difficilement réalisable par voie chimique. Le recours aux catalyseurs enzymatiques permettrait de pallier aux contraintes de la chimie mais les enzymes naturelles ne présentent pas toujours les propriétés adéquates et nécessitent d’être optimisées par ingénierie moléculaire. Le couplage de la chimie et de biocatalyseurs conçus « sur mesure », peut offrir une alternative prometteuse pour explorer de nouvelles voies de synthèse des sucres, notamment pour la mise au point de glycovaccins. L’objectif de cette thèse a ainsi visé à mettre en œuvre des stratégies d’ingénierie semi-rationnelles de l’amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (ASNp), une α-transglucosylase utilisant le saccharose comme substrat, afin de concevoir de nouvelles spécificités de substrats et d’étendre le potentiel de cette enzyme à catalyser de nouvelles réactions, permettant ainsi d’aller bien au-delà de ce que la Nature peut offrir. Dans une première étude, une approche assistée par ordinateur a été suivie afin de remodeler le site actif de l’enzyme (sous-sites +1, +2 et +3) pour la reconnaissance et la glucosylation en α-1,4 d’un accepteur disaccharidique non-naturel (l’allyl 2-deoxy-2-N-trichloroacetyl-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranose). Le produit attendu, un trisaccharide, est un précurseur dans la synthèse chimio-enzymatique des oligosaccharides mimant les unités répétitives des lipopolysaccharides de Shigella flexneri, dont l’utilisation ultime est le développement de vaccins contre la Shigellose. Une approche computationnelle faisant appel à des outils dédiés au design automatisé de protéines et à une analyse des séquences a conduit au design d’une librairie d’environ 2.7x104 séquences, qui a ensuite été construite expérimentalement puis criblée. Au final, 55 variants actifs sur saccharose (le substrat donneur) ont été identifiés, et un mutant, appelé F3, a révélé sa capacité à glucosyler en α-1,4 le disaccharide cible. De manière étonnante, ce mutant possède 7 mutations au sein de son site actif, nécessaires au déploiement de sa nouvelle spécificité tout en maintenant son aptitude à utiliser le saccharose comme donneur d'unité glucosyle. Dans une deuxième étude, trois variants ont été identifiés lors du criblage de la librairie semi-rationnelle sur saccharose comme présentant de nouvelles spécificités de produits. Ces mutants ont été caractérisés plus en détails, ainsi que leurs produits, sur un plan biochimique et structural. Ces mutants, appelés 37G4, 39A8 et 47A10, contiennent entre 7 et 11 mutations dans leur site actif. Il a été montré qu’ils étaient capables de reconnaitre le saccharose et le maltose (un produit de la réaction avec le saccharose) comme donneur et accepteur pour synthétiser en quantités variables de l’erlose (α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-α-D-Glucopyranosyl-(1→2)-β-D-Fructose) et du panose (α-D-Glucopyranosyl-(1→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-α-D-glucose), des molécules non produites par l’enzyme sauvage. Des taux de production relativement élevés ont été obtenus pour ces molécules, dont les propriétés acariogènes et le pouvoir sucrant pourraient présenter un intérêt applicatif pour l’industrie alimentaire. Dans une dernière partie, un autre mutant, appelé 30H3, a été isolé lors du criblage primaire de la librairie de par son activité élevée sur saccharose (une amélioration d’un facteur 6.5 comparé à l’enzyme sauvage). Après caractérisation, le mutant s’est avéré synthétiser un profil unique de produits en comparaison de l’enzyme sauvage ASNp. Il s’est ainsi montré très efficace pour la synthèse de maltooligosaccharides solubles, de taille de chaînes contrôlée allant d’un DP 3 à 21, et de faible polydispersité. Aucun polymère insoluble n’a été identifié. La structure 3D du mutant résolue par cristallographie des rayons X a révélé un agrandissement de la poche catalytique en raison de la présence de 9 mutations introduites dans la première sphère.... / Chemical synthesis of complex oligosaccharides still remains critical. Enzymes have emerged as powerful tools to circumvent chemical boundaries of glycochemistry. However, natural enzymes do not necessarily display the required properties and need to be optimized by molecular engineering. Combined use of chemistry and tailored biocatalysts may thus be attractive for exploring novel synthetic routes, especially for glyco-based vaccines development. The objective of this thesis was thus to apply semi-rational engineering strategies to Neisseria polysaccharea amylosucrase (NpAS), a sucrose-utilizing α-transglucosylase, in order to conceive novel substrate specificities and extend the potential of this enzyme to catalyze novel reactions, going beyond what nature has to offer. In a first study, a computer aided-approach was followed to reshape the active site of the enzyme (subsites +1, +2 and +3) for the recognition and α-1,4 glucosylation of a non-natural disaccharide acceptor molecule (allyl 2-deoxy-2-N-trichloroacetyl-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranose). The trisaccharide product is a building block for the chemo-enzymatic synthesis of oligosaccharides mimicking the repetitive units of the Shigella flexneri lipopolysaccharides, and ultimately, for the production of a vaccine against Shigellosis disease. Using computational tools dedicated to the automated protein design, combined with sequence analysis, a library of about 2.7x104 sequences was designed and experimentally constructed and screened. Altogether, 55 mutants were identified to be active on sucrose (the donor substrate), and one, called mutant F3, was subsequently found able to catalyze the α-1,4 glucosylation of the target disaccharide. Impressively, this mutant contained seven mutations in the first shell of the active site leading to a drastic reshaping of the catalytic pocket without significantly perturbing the original specificity for sucrose donor substrate. In a second study, three variants were identified from the screening of the semi-rational library on sole sucrose as displaying totally novel product specificities. They were further characterized, as well as their products, at both biochemical and structural level. These mutants, called 37G4, 39A8 and 47A10, contained between 7 and 11 mutations into their active site. They were found able to use sucrose and maltose (a reaction product from sucrose) as both donor and acceptor substrates to produce in varying amounts erlose (α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-α-D-Glucopyranosyl-(1→2)-β-D-Fructose) and panose (α-D-Glucopyranosyl-(1→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-α-D-glucose) trisaccharides, which are not produced at all by parental wild-type enzyme. Relatively high yields were obtained for the production of these molecules, which are known to have acariogenic and sweetening properties and could be of interest for food applications. In a last part, another mutant 30H3 was isolated due to its high activity on sucrose (6.5-fold improvement compared to wild-type activity) from primary screening of the library. When characterized, the mutant revealed a singular product profile compared to that of wild-type NpAS. It appeared highly efficient for the synthesis of soluble maltooligosaccharides of controlled size chains, from DP 3 to 21, and with a low polydispersity. No formation of insoluble polymer was found. The X-ray structure of the mutant was determined and revealed the opening of the catalytic pocket due to the presence of 9 mutations in the first sphere. Molecular dynamics simulations suggested a role of mutations onto flexibility of domain B’ that might interfere with oligosaccharide binding and explain product specificity of the mutant.