Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les lymphocytes T régulateurs CD4+Foxp3+ (Treg) sont indispensables au contrôle des cellules T auto-réactives et au maintien de la tolérance immune en périphérie. Ils sont sélectionnés positivement dans le thymus, possèdent un répertoire TCR extrêmement diversifié suggérant une reconnaissance d’antigènes variés, requièrent une signalisation continue via leur TCR pour maintenir leurs fonctions en périphérie, fonctions qu’ils exercent avec une certaine spécificité de tissu. Ils contrôleraient donc spécifiquement les lymphocytes T auto-réactives en reconnaissant comme eux des antigènes du soi. Mon travail de thèse s’est articulé autour de deux axes visant à revisiter ce paradigme de l’autoréactivité des Treg, un point essentiel qui concerne les propriétés de reconnaissance antigénique de ces cellules. Afin de ne pas biaiser nos résultats avec des TCR artificiels, non issus de Treg, nous avons choisi d’étudier les Treg polyclonaux de souris normales. Dans une première série d’expériences, nous avons pu montrer que l’activation de lymphocytes T auto-réactifs anti-mâle dans une souris mâle conduisait à un remodelage du répertoire TCR des Treg, avec un usage préférentiel des Vβ5 et Vβ12. L’absence d’amplification clonale ainsi que des données récentes de la littérature démontrant l’amplification de sous-populations de Treg par des rétrovirus endogènes au cours de réponses immunitaires chroniques, nous ont conduit à conclure que l’activation de lymphocytes T auto-réactifs pourrait réactiver des rétrovirus endogènes et donc l’expression de super-antigènes capables d’amplifier les Treg portant certains Vβ. Dans le second volet de mon travail de thèse, nous avons caractérisé le niveau d’autoréactivité des Treg in vivo. En procédant à une comparaison systématique avec des Treg ayant des niveaux d’allo-réactivité différents et connus, nous avons montré que, de manière inattendue, les Treg polyclonaux possèdent un niveau étonnamment faible d’autoréactivité. Seule une fraction d’entre eux était capable de recevoir un signal TCR et des expériences de quantification ont révélé que cette fraction de cellules auto-réactives ne devait pas excéder 1% du répertoire total des Treg. L’ensemble de nos résultats suggèrent donc que les Treg sont faiblement réactifs en périphérie et/ou sont dirigés contre des antigènes endogènes rarement représentés. / No abstract available

Le paludisme est une maladie causée par un parasite Apicomplexe du genre Plasmodium pouvant aboutir à de graves complications. Les modèles murins ont révélé un rôle des lymphocytes T CD4 (LT CD4) dans la réponse immunitaire protectrice et pathologique. Les LT CD4 peuvent être protecteurs en limitant la croissance parasitaire et pathogénique au cours du neuropaludisme expérimental (NPE) : une complication cérébrale que développent les souris sensibles après infection par PbA. Au cours du NPE, l'interféron gamma (IFN gamma) produit par lesLT CD4 participe à la séquestration des LT CD8 dans les capillaires cérébraux, provoquant des dommages vasculaires qui aboutissent à la mort de l'animal. A ce jour, aucun antigène reconnu par les LT CD4 dans ce modèle n'est caractérisé et les cellules présentatrices d'antigènes (CPA) impliquées dans la mise en place de ces réponses ne sont pas connues. Nous avons utilisé la protéomique pour caractériser l'immunopeptidome dérivé de PbA et présenté par le CMH II au cours de l'infection. Nous avons identifié 14 peptides issus de 13 protéines antigéniques et avons établi leur immunodominance. Nous avons observé que les trois épitopes dominants représentent 1/3 des réponses LT CD4 spécifiques au cours de l'infection à PbA et que ces réponses sont détectées dans un contexte d'infection naturelle. Afin de mieux comprendre les mécanismes de présentation antigénique, nous avons développé des LT CD4 rapporteurs appelés hybridomes. Ces outils ont montré que les Cdc1 de souris infectées à J6 sont meilleures présentatrices d'antigènes de PbA mais aussi d'antigènes non-parasitaires. De plus, la déplétion de cDC1 in vivo a souligné l'importance jusqu'alors insoupçonnée des cDC1 dans le développement des réponses Th1 effectrices au cours du paludisme sévère. Cette étude apporte un nouvel éclairage sur les mécanismes qui conduisent à l'immunité effectrice par les LT CD4. Elle pourrait être utile pour améliorer l'aide apportée aux LB par les LT CD4 au cours de stratégies vaccinales. / Malaria is a blood-borne disease caused by parasites of the genus plasmodium that can lead to severe manifestations. Mouse models have revealed the dual role of t cells in limiting parasite growth and in mediating immune pathology, especially during experimental cerebral malaria (ECM), a cerebral complication that develops in susceptible mice infected by plasmodium Berghei (Pb) anka (PbA) parasites. During ECM, IFN gamma produced by CD4 t cells promotes sequestration of cd8 t cells in brain capillaries, resulting in vascular damage and early mouse death. As of now, the antigens from PbA recognized by CD4 t cells are unknown and the phagocytes involved in uptake of parasitized erythrocytes and priming and differentiation of cd4 t cells are poorly understood. Here we used mass spectrometry to characterize the PbA-derived MHC II peptidome presented by dc during blood stage malaria. we identified 14 peptides from 13 antigenic proteins and established the immunodominance hierarchy of the peptide-specific CD4 responses. We found that t cells specific for the three dominant epitopes represented 1/3 of the entire parasite-specific response. Interestingly, these dominant responses were detectable after natural infection. To gain insights into the antigen presentation mechanisms, we generated ß-gal-inducible reporter cd4 t cell hybridomas. After 6 days of infection the cDC1 subset was the most potent to present PbA and non-PbA antigens to CD4 t cells. In accordance, cDC1 depletion in vivo impaired the development of effector th1 responses in PbA-infected mice. This study sheds light on the mechanisms eliciting CD4 t cell immunity to blood stage malaria and may help improve CD4 t cell-mediated b cell help in vaccination strategies.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La présentation antigénique par le complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) I est un processus ubiquitaire permettant la présentation de protéines endogènes qui reflètent l'état de la cellule à la surface cellulaire aux lymphocytes T CD8+ dans le contexte de la surveillance et la réponse immunitaires. Ainsi, l'expression des molécules du MHC I classiques est induite en réponse aux stimuli inflammatoires afin de favoriser la reconnaissance immunitaire et l'élimination des pathogènes. HFE est une molécule du MHC Ib non-classique qui sert de régulateur négatif de l'absorption du fer. HFE est associé au développement de l'hémochromatose héréditaire (HH), maladie associée au métabolisme du fer mais souvent accompagnée de défauts immunitaires. Ainsi, nous avons en premier lieu étudié l'impact de HFE sur la présentation antigénique par MHC I, afin d'expliquer en partie les défauts immunitaires liés à l'HH associée à HFEC282Y. Puis, compte tenu de l'impact de l'inflammation sur l'expression des molécules du MHC I classiques, nous avons étudié la régulation de l'expression de HFE en réponse aux stimuli inflammatoires induits par les cellules du sang périphérique mononucléées (PBMC). Nous avons mis au point un système d’expression antigénique dans lequel nous contrôlons l’expression de MHC I, de HFE et d’un antigène pour lequel nous avons généré des lymphocytes T CD8+ spécifiques. Nos résultats démontrent que la forme sauvage de HFE (HFEWT), contrairement à sa forme mutée (HFEC282Y), inhibe la reconnaissance de complexes MHC I/peptide (pMHC). Nous avons également démontré que l'inhibition de la reconnaissance est maintenue, indépendamment des niveaux d'expression de MHC I à la surface, d'une compétition pour la β2-microglobuline, de la capacité de HFE d'interagir avec le récepteur de la transferrine, de l'origine de l'antigène ou de l'affinité de celui-ci. Par ailleurs, nous avons identifié les domaines α1-2 de HFEWT comme étant responsables de l'inhibition de la reconnaissance antigénique. Par contre, la reconnaissance de peptides chargés de manière externe sur les molécules du MHC I présentes à la surface n'a démontré aucune inhibition en présence de HFEWT, suggérant que HFEWT pourrait affecter la reconnaissance en interférant avec le processus d'apprêtement antigénique intracellulaire. À l’inverse, nous avons souhaité déterminer si les lymphocytes T activés pouvaient influencer les niveaux d'expression de HFE. En termes de régulation de l'expression de HFE, nous avons établi que HFE est exprimé dans les tissus sains chez l'humain et induit chez les lignées de cancers du colon, du sein, du poumon, du rein et du mélanome. Par ailleurs, en co-cultivant des lymphocytes T activés avec ces lignées tumorales, nous avons démontré que l'expression de HFE est fortement inhibée dans toutes ces lignées tumorales lorsqu'exposées à des lymphocytes T activés. Finalement, la modulation de l'expression de HFE est indépendante du contact cellulaire et semble médiée en partie par le GM-CSF, l'IFN-γ et le TNF. En somme, ces résultats suggèrent que les lymphocytes T de l'hôte modulent l'expression de HFE dans le microenvironnement inflammatoire, ce qui pourrait promouvoir la reconnaissance des antigènes présentés sur les molécules du MHC I présentées aux lymphocytes T CD8+ antigène-spécifiques. De plus, ces études soulèvent la possibilité d'un nouveau rôle physiologique de HFEWT dans la voie de présentation antigénique par MHC I, qui pourrait moduler l'immunogénicité des antigènes et la réponse immunitaire cellulaire chez l'hôte. / MHC class I antigen presentation is an ubiquitous process by which cells present endogenous proteins to CD8+ T lymphocytes during immune surveillance and response. Accordingly, classical MHC I molecules are up-regulated in response to inflammatory stimuli to favor immune recognition and pathogen clearance. HFE is a non-classical, MHC Ib molecule which acts as a negative regulator of iron absorption. HFE has been linked to the development of hereditary hemochromatosis (HH), an iron overload disease often associated to immune defects. Firstly, we studied the impact of HFE expression on MHC I antigen presentation, as a hypothesis for HH-associated immunological defects observed in HFEC282Y-mutated HH patients. Secondly, we evaluated whether, like its classical MHC I counterparts, HFE expression could be modulated in response to peripheral blood mononuclear cell (PBMC) inflammation. We developed an antigen presentation system in which we control MHC I expression, HFE expression, and expression of a model antigen for which we have generated antigen-specific CD8+ T lymphocytes. Our results demonstrate that wild-type HFE (HFEWT), but not C282Y-mutated HFE (HFEC282Y), inhibits recognition of MHC I antigens. We further demonstrate that inhibition of antigen recognition is maintained regardless of MHC I surface levels, β2-microglobulin competition, HFE ability to interact with transferrin receptor, antigen origin, or epitope affinity. We identified the α1-2 domains of HFEWT as being responsible for inhibiting antigen recognition. However, recognition of externally peptide-pulsed 293-A2 remained uninhibited in presence of HFEWT, indicating that HFE may affect T cell recognition by interfering with intracellular antigen processing. We also questioned whether activated T lymphocytes may influence HFE expression. We established that HFE is widely expressed in healthy human tissues and induced in colon cancer, breast cancer, lung cancer, kidney cancer and melanoma cell lines. Furthermore, HFE mRNA expression was drastically inhibited in all tumor cell lines when exposed to activated T lymphocytes. Down-regulation of HFE mRNA expression was independent of cell contact and appears to be partially mediated by GM-CSF, IFN-γ, and TNF. Overall, these data suggest that host T lymphocytes may alter HFE expression levels in the inflammatory microenvironment, which could, in turn, promote recognition of MHC I antigens presented to antigen-specific CD8+ T lymphocytes. Accordingly, this could suggest a new physiological role for HFEWT in the MHC I antigen presentation pathway, which could modulate antigen immunogenicity and the cellular immune response.

Les protéines solubles sont généralement faiblement immunogènes, ce qui constitue unelimite pour le développement de vaccins sous unitaires à base de protéines. Mes travaux de thèseont eu pour objectif de décrypter certains mécanismes moléculaires et cellulaires qui contribuent àl'immunogénicité et d'en tirer partie pour développer des approches originales permettantd'améliorer la capacité des protéines à déclencher la réponse immunitaire. Pour cela, j'aiprincipalement utilisé le transactivateur transcriptionnel (Tat) du VIH-1. J'ai montré quel'oligomérisation de Tat permet à un mécanisme de collaboration B-TH-2 d'induire la réponseimmunitaire en absence d'adjuvant. J'ai identifié le déterminant minimal responsable de l'effet etmontré qu'il confère la propriété adjuvante à d'autres antigènes. J'ai ensuite montré que laprésentation aux cellules T restreinte aux CMH I et CMH II est accrue lorsque les protéines sontdotées de la capacité à lier des sucres sulfatés d'expression ubiquitaire: les héparanes sulfate. Cestravaux ont permis de définir de nouvelles approches pour améliorer l'immunogénicité de protéinessusceptibles d'être intégrées dans des préparations vaccinales.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La reconnaissance des antigènes du soi et du non soi par les lymphocytes B et T est à l'origine des maladies auto-immunes et inflammatoires. Les anticorps et les auto-anticorps produits par les plasmocytes dérivés des lymphocytes B sont utiles à des fins diagnostiques, mais contribuent également à la physiopathologie de ces maladies. La déplétion des lymphocytes B au cours des maladies auto-immunes chez l'homme a recentré l'attention sur les rôles des lymphocytes B comme modulateurs de la fonction des lymphocytes T, en plus de leur rôle de cellules productrices d'anticorps. L'utilisation d'anticorps anti-CD20 chez la souris révèle le rôle fondamental des lymphocytes B comme adjuvants cellulaires pour l'activation des lymphocytes T CD4+ in vivo (lymphocytes B effecteurs) mais également le rôle régulateur inattendu d'une sous-population de lymphocytes B spléniques CD1dhighCD5+ qui produit de l'interleukine 10 (lymphocytes B10). Le rôle de ces lymphocytes B effecteurs est montré dans un modèle chez la souris NOD (Non Obese Diabetic) alors que le rôle des lymphocytes B régulateurs est montré dans un modèle murin d'eczéma de contact. Au cours de l'encéphalite auto-immune expérimentale, la déplétion précoce des lymphocytes B aggrave les signes neurologiques tandis que la déplétion tardive des lymphocytes B les améliore, reflétant la dualité fonctionnelle des lymphocytes B au cours des maladies inflammatoires / Autoimmunity results from abnormal B and T cell recognition of self antigens, which leads to autoantibody production in many cases. Autoantibodies produced by B cell-derived plasma cells provide diagnostic markers for autoimmunity, but also contribute significantly to disease pathogenesis. The therapeutic benefit of depleting B cells in mice and humans has refocused attention on B cells and their role in autoimmunity beyond autoantibody production. B cells specifically serveas cellular adjuvants for CD4+ T cell activation, while regulatory B cells, including those that produce IL-10 (B10 cells), function as negative regulators of inflammatory immune responses. The role of effector B cells is shown in the non obese diabetic mouse model (NOD) whereas the role of regulatory B cells is demonstrated in a contact dermatitis model. During experimental autoimmune encephalomyelitis, early B cell depletion makes the disease worst whereas B cell depletion after disease onset improves clinical symptoms, reflecting counter regulatory B cell functions during autoimmunity