No description available.

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης, μέλη της υπερ-οικογένειας των ιοντικών διαύλων ενεργοποιούμενων από προσδέτη, είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες μεγέθους ~290 kDa. Ανάλογα με την τοπολογία και τα φαρμακολογικά τους χαρακτηριστικά οι νικοτινικοί υποδοχείς διακρίνονται σε νευρικούς και μυϊκούς υποδοχείς. Οι νευρικοί υποδοχείς εκφράζονται κυρίως στα περιφερειακά γάγγλια και σε συγκεκριμένα τμήματα του εγκεφάλου, καθώς και σε μη νευρικούς ιστούς όπως είναι τα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Οι μυϊκοί υποδοχείς απαντώνται στις μετασυναπτικές μεμβράνες των νευρομυϊκών συνάψεων των σπονδυλωτών, όπου ενέχονται στη διαβίβαση της νευρικής ώσης στους μυς και στα ηλεκτρικά όργανα ορισμένων ψαριών. Επιπλέον από το φυσιολογικό του ρόλο, ο μυϊκός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης αποτελεί στόχο για πολλά κληρονομικά και επίκτητα νοσήματα, με σημαντικότερο και καλύτερα μελετημένο το αυτοάνοσο νόσημα μυασθένεια. Στο μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών με μυασθένεια (~80%) ανιχνεύονται στο ορό αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (αντί-υποδοχέα αντισώματα) τα οποία οδηγούν στην ελάττωση των διαθέσιμων λειτουργικών υποδοχέων στη νευρομυϊκή σύναψη. Η μείωση του αριθμού των υποδοχέων προκαλεί αδυναμία δέσμευσης της ακετυλοχολίνης από τη μετασυναπτική μεμβράνη, αναστολή της σύσπασης του μυ και εκδήλωση μυϊκής κόπωσης και αδυναμίας, συμπτώματα χαρακτηριστικά της μυασθένειας. Οι υποδοχείς της μετασυναπτικής μεμβράνης δύνανται να ελαττωθούν μέσω δράσης του συμπληρώματος, αντιγονικής τροποποίησης ή λειτουργικής παρεμπόδισης. Οι σύγχρονες θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη μυασθένεια είναι μη ειδικές και περιλαμβάνουν τη χορήγηση ουσιών που αναστέλλουν τη δράση της ακετυλοχολινεστεράσης, ανοσοκατασταλτικών και ανοσορυθμιστικών φαρμάκων, ενδοφλέβιων ανοσοσφαιρινών καθώς και την πλασμαφαίρεση. Μια υποσχόμενη αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για την μυασθένεια αποτελεί η μέθοδος της αναοσοπροσρόφησης. Η βασική αρχή αυτή της προσέγγισης έγκειται στην ακινητοποίηση των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητών σε ένα σταθερό υπόστρωμα, κατασκευάζοντας έτσι ανοσοπροσροφητικές στήλες. Για την προσέγγιση αυτή απαραίτητη είναι η απόκτηση ενός ανοσοπροσροφητή με διαμόρφωση που να προσομοιάζει αυτή του αντιγόνου-στόχου. Ωστόσο, η απόκτηση μεγάλων ποσοτήτων του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης καθίσταται εξαιρετικά δύσκολη εξαιτίας του μεγάλου μεγέθους του, του υδρόφοβου χαρακτήρα του και της αδυναμίας απομόνωσης του σε μεγάλες ποσότητες από φυσικές πηγές. Για τους λόγους αυτούς, η έρευνα προσανατολίζεται στην μελέτη των εξωκυτταρικών περιοχών (ΕΚΠ) του ανθρώπινου νικοτινικού υποδοχέα στις οποίες προσδένεται η πλειονότητα των αυτοαντισωμάτων των μυασθενών. Η καθήλωση ανασυνδυασμένων ΕΚΠ των υπομονάδων α1, β, γ, δ και ε του υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητών εκφρασμένων στο ετερόλογο σύστημα Pichia pastoris είχε περιγραφεί και προηγουμένως από το εργαστήριό μας. Ωστόσο, αν και η χρήση των πρωτεϊνών αυτών ως ανοσοπροσροφητών κατάφερε την αφαίρεση ενός ποσοστού αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, δεν επετεύχθη η ικανοποιητική απομάκρυνσή τους. Η παρούσα εργασία, είχε ως στόχο την έκφραση και το χαρακτηρισμό των συνδεδεμένων ΕΚΠ των υπομονάδων α1, β, γ ή ε και δ του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης στο σύστημα έκφρασης P. pastoris. Στοχεύοντας στη δημιουργία ενός βελτιωμένου ανοσοπροσροφητή, πραγματοποιήθηκε η σύνδεση όλων των ΕΚΠ των υπομονάδων του υποδοχέα χρησιμοποιώντας έναν πεπτιδικό συνδέτη. Τα πενταμερή β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ και β-δ-α1-ε-α1 ΕΚΠ, κατασκευάστηκαν σε μία προσπάθεια μίμησης της διαμόρφωσης ολόκληρου του υποδοχέα σε ένα μοναδικό πολυπεπτίδιο. Τα πενταμερή, θεωρητικά φέρουν το σύνολο των αντιγονικών επιτόπων που αναγνωρίζουν τα αντισώματα αλλά και τις διεπιφάνειες των υπομονάδων που πιθανολογείται ότι είναι επίσης ανοσογόνες. Παράλληλα, μελετήθηκαν και τα διμερή α1-β ΕΚΠ και β-α1 ΕΚΠ, τα οποία προέκυψαν ως ενδιάμεσα στάδια στην κατασκευή των πενταμερών και φέρουν την πλειονότητα των επιτόπων έναντι των οποίων κατευθύνονται τα αυτοαντισώματα. Τα πενταμερή β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ και β-δ-α1-ε-α1 ΕΚΠ εκφράστηκαν επιτυχώς στο ετερόλογο σύστημα P. pastoris σε διαλυτή μορφή αλλά με ιδιαίτερα χαμηλό επίπεδο έκφρασης. Επιπλέον η ανοσοπροσροφητική τους ικανότητα ως προς την αφαίρεση αυτοαντισωμάτων όχι μόνο δεν βελτιώθηκε αλλά παρουσιάστηκε μειωμένη σε σχέση με τις επιμέρους υπομονάδες. Αντίθετα, όσο αφορά στη χρήση συγκαταμερών στη θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, το διμερές α1-β ΕΚΠ φαίνεται να τηρεί ένα σύνολο προϋποθέσεων έναντι των πενταμερών β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ, β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ και β-α1 ΕΚΠ που το καθιστούν καλό υποψήφιο ανοσοπροσροφητή. Σε αυτές συγκαταλέγονται το σχετικά υψηλό επίπεδο παραγωγής του από το ετερόλογο σύστημα έκφρασης του P. pastoris καθώς και το γεγονός ότι απομονώνεται σε καθαρή μορφή. Σε ότι αφορά το ανοσοπροσροφητικό του προφίλ, φέρει την πλειονότητα των επιτόπων έναντι των οποίων κατευθύνονται τα αυτοαντισώματα και τα απομακρύνει εξίσου αποδοτικά όσο και το μείγμα των μεμονωμένων α1 και β ΕΚΠ. Επιπλέον, το α1-β ΕΚΠ ως ένα πολυπεπτίδιο, υπερτερεί έναντι των μεμονωμένων α1 ΕΚΠ και β ΕΚΠ καθώς ο χαρακτηρισμός του όσο αφορά τις δοκιμασίες με στόχο την έγκριση για κλινική χρήση αναμένεται να είναι ευκολότερος έναντι των δύο πρωτεϊνών. Τέλος, η υψηλή χωρητικότητά του ως προς την αφαίρεση αυτοαντισωμάτων μπορεί να εξασφαλίσει χαμηλό κόστος παραγωγής, έναν παράγοντα σημαντικό για την εφαρμογή της αντιγονοειδικής θεραπευτικής προσέγγισης σε μεγάλη κλίμακα. Ο επιτυχής χαρακτηρισμός του α1-β ΕΚΠ σχετικά με παραμέτρους σταθερότητας, τοξικότητας και ασφάλειας θα μπορούσε να σηματοδοτήσει την έναρξη των κλινικών δοκιμών για τη χρήση του ως ανοσοπροσροφητή στην εφαρμογή της νέας θεραπευτικής προσέγγισης για τη μυασθένεια σε ανθρώπους. / Myasthenia gravis is an antibody mediated autoimmune disease that affects the neuromuscular junction. The muscle nicotinic acetylcholine receptor (AChR) is the main antigen in myasthenia gravis. Circulating antibodies against the acetylcholine receptor are the main pathogenic factors, causing loss of the available functional receptors at the neuromuscular junction with the consequent impairment of signal transduction. Muscle nicotinic acetylcholine receptors are transmembrane proteins formed by 5 homologous subunits: two α subunits and three β, γ (in the embryo and replaced by ε in the adult) and δ. Typically, each subunit consists of an N-terminal extracellular domain (ECD), a transmembrane region and a cytoplasmic loop. The ECDs carry most of the epitopes for MG autoantibodies ,with subunit α baring the main immunogenic region. Current MG treatments include the use of anticholinesterase drugs, immunosuppressants or immunomodulators, plasmapheresis and thymectomy with none of these approaches being specific. The selective removal of anti-AChR antibodies from the blood of MG patients with an extracorporeal technique similar to plasmapheresis could be a therapeutic option. In our laboratory, we aim to develop this method using recombinant extracellular domains (ECDs) of the AChR subunits (α, β, γ, δ and ε) as immunoadsorbents immobilized on CN-Br Sepharose. We have previously described the expression of the individual ECDs in P. pastoris system and their characterization. The aim of this dissertation was to study and characterize the linked ECDs of the α, β, γ, δ and ε subunits expressed in the yeast P. pastoris system. In an attempt to improve immunoadsorption efficiency we expressed the AChR subunits linked with a flexible peptide linker 24 amino acids long. More specifically we designed and characterized two pentameric constucts namely β-δ-α1-γ-α1 ECD & β-δ-α1-ε-α1 ECD to mimic the whole pentameric extracellular domain of the AChR in a native conformation. We also examined two dimeric constructs (α1-β ECD & β1-α ECD) since these subunits carry the majority of MG epitopes. Regarding the pentamers, they were successfully expressed in the P.pastoris system but with the expression yield being relatively low. Furthermore their immunoadsorbing ability was limited in comparison with the mixture of all five ECDs. This fact, combined with their small expression yield, poses a serious obstacle for their use in therapy. On the other hand, both expression yield and antibody binding of the α1-β dimer were satisfactory, at least as good as the mixture of individual α and β ECDs. In addiction, the high capacity of thee α1-β ECD in combination with its expression yield suggests that few milligrams of protein could be sufficient for the clearance of the plasma from an average titer patient. Such a quantity could be easily obtained, allowing the large scale application of the method, while reducing the cost. Therefore, the α1-β dimer constitutes a suitable candidate to be used as efficient immunoadsorbent in the development of a specific therapy against MG. Further characterization of the α1-β ECD, with respect to stability, toxicity and safety aspects, could mark the initiation of animal studies. The successful completion of these studies is crucial for the advancement into clinical trials, for the use of the α1-β ECD as immunoadsorbent in the antigen-specific therapy for myasthenia gravis.

During homeostatic expansion, peripheral T cells proliferate in response to lymphopenia, in the absence of cognate antigen or costimulatory signals. Host CD8 reconstitution following hematopoietic cell transplantation (HCT) involves the de novo-generation of T cells in addition to the homeostatic expansion of mature donor T cells present in the graft and donor lymphocyte infusion as well as host T cells that survive conditioning. Although it is well appreciated that CD8 homeostatic expansion contributes to host CD8 reconstitution following HCT, the factors governing the extent of the contribution by donor CD8 homeostatic expansion to host reconstitution have not been precisely and systematically examined. The ex vivo generation of memory CD8 T cells specific for an epitope of the immunodominant minor histocompatibility antigen H60 was demonstrated. By adapting a previously described culture system designed to generate large numbers of transgenic memory CD8 T cells, memory CD8 cells (TM) specific for a physiological antigen were elicited from a heterogeneous population of CD8 T cells. The ex vivo-generated antigen-specific memory CD8 cells were then expanded under conditions of lymphopenia in ablatively conditioned syngeneic transplant recipients and found to persist greater than 2 months post-transplant. These findings support the notion that the transplantation of small numbers ex vivo-generated memory CD8 cells, specific for a physiologically relevant antigen, can help restore host immune function following HCT. Transplant conditions were found to modulate the contribution of homeostatically expanded donor CD8 TM to the host CD8 compartment. Varying the conditioning intensity, timing of infusion, and infusion dose affected the kinetics of expansion as well as the homeostatic set-point. In my HCT model, delayed infusions of 3 weeks and transplantation of small numbers of donor CD8 T cells resulted in significant contributions to host CD8 T cell compartment. These findings could be applied clinically to enhance the effectiveness of clinical immunotherapy in restoring host immune function post-transplant. Moreover, transplantation of varying doses of donor CD8 TM demonstrated there was maximal donor contribution to host CD8 reconstitution. Finally, the homeostatic expansion, persistence, and function of transgenic memory and naïve CD8 populations were investigated following transplantation into ablatively conditioned syngeneic recipients. Both donor CD8 populations underwent 2 weeks of expansion post-transplant. The naïve CD8 population reproducibly achieved higher homeostatic numbers than the memory CD8 population. By one month post-HCT, the transplanted naïve CD8 populations also exhibited a memory CD8 phenotype. Moreover, the CD8 TN→TM population mediated an effective response to a primary challenge, comparable to the antigen-experienced memory CD8 population. Thus, regardless of the state of differentiation of the donor CD8 population at the time of transplant, donor CD8 homeostatic expansion contributes a memory CD8 cells population, able to mediating effective immune responses, to host reconstitution.

Allergic asthma is a chronic inflammatory airway disease that is dominated by Th2 immune responses, with accumulation of eosinophils, IgE and IgG1 production, and airway hyperresponsiveness. We reported previously that treatment of OVA-asthmatic mice with allergen-presenting IL-10-differentiated dendritic cells (DC) (DC10) leads to progressive and long-lasting full-spectrum asthma tolerance. However, little has been done in investigating a role for antigen-specific B cells in DC10-induced tolerance. In this study, we characterized the surface markers of DC10 and found that these cells expressed lower levels of CD40, CD80, MHC II, PD-L1 and PD-L2 relative to immunostimulatory LPS-differentiated DCs (DCLPS). Co-culturing DC10 or DC10-induced regulatory T cells (iTreg) with CD4+ Th2 effector T cells from asthmatic mice led to a marked suppression of DCLPS-induced T effector cell proliferation. Moreover, DC10 treatment of asthma phenotype mice down-regulated airway eosinophilic inflammation as determined 48 h after a recall allergen challenge, and reduced pulmonary parenchymal tissue OVA-specific IgG1-secreting (OVA-IgG1) plasma cell numbers. The number of lung OVA-specific IgG1 plasma cells decreased by 46.7% over a 2 week period in the absence of repeated allergen challenge, while the numbers of bone marrow OVA-specific IgG1 plasma cells stayed relatively stable over a 6 week period, as determined 48 h after a single allergen challenge of asthmatic mice. DC10 treatment had a significant impact on the serum of IgG1/IgE response. To address the question of how DC10 influence OVA-IgG1 plasma cells responses, we co-cultured enzymatically-dispersed lung total cells from asthmatic mice with or without DC10, and found that the DC10 significantly suppressed OVA-IgG1 plasma cell antibody production. To determine whether DC10 required input from T cells to accomplish this, we co-cultured CD4 T cell-depleted, B cell-enriched populations from the lungs of asthmatic mice with or without DC10, and found that DC10 strongly (65.4+/-3.5%) suppressed OVA-IgG1 plasma cells in CD4 T cell-depleted lung cell cultures. To assess whether DC10-induced Treg also suppress IgG1-secretion, we co-cultured lung CD4+ T cells from untreated or DC10-tolerized asthmatic mice with total lung cells from asthmatic donors, and found that the DC10-induced Tregs effectively (52.2+/-8.7%) suppressed OVA-IgG1 plasma cell responses. In summary, DC10 treatment strongly down-regulate OVA-specific IgG1 plasma cell responses of asthmatic mice, both in vivo and in vitro by at least two mechanisms: directly via DC10 as well as indirectly through DC10-induced Tregs.

The field of immunology has advanced tremendously over the last 40 years, with seminal findings that have guided the development of powerful new therapies. However, the ability to induce safe and long-lasting antigen-specific tolerance has remained elusive. A therapy that could prevent the immune system from aberrantly destroying self-tissues, without impairing its capacity to eliminate dangerous pathogens, would be transformative for the treatment of autoimmune diseases. In addition, such a therapy could also greatly advance the field of organ transplantation by inducing antigen-specific tolerance to prevent graft rejection. / Engineering and Applied Sciences

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13356号 / 論医博第2202号 / 新制||医||1044(附属図書館) / (主査)教授 生田 宏一, 教授 濵﨑 洋子, 教授 竹内 理 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20256号 / 医博第4215号 / 新制||医||1020(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 生田 宏一, 教授 三森 経世, 教授 前川 平 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Das Knochenmark (BM) beherbergt wesentliche Komponenten des adaptiven Immunsystems, die einen langfristigen Schutz gegen wiederkehrende Pathogene vermitteln können, sodass es sich als Reservoir für ein immunologisches Gedächtnis qualifiziert. Neben langlebiger Antikörper-produzierender Plasmazellen bleiben auch Antigen (Ag)-spezifische CD8+ und CD4+ T-Gedächtniszellen dauerhaft im Knochenmark erhalten, auch wenn sie in den sekundären lymphoiden Organen (SLOs) und im Blut abwesend sind. Es wird angenommen, dass diese T-Gedächtniszellen bei erneutem Kontakt mit den gleichen systemischen Pathogenen schnell reagieren können. Allerdings sind die biologischen Mechanismen für ihre langfristige Aufrechterhaltung immer noch umstritten und demnach ungeklärt. Unklar ist auch, wie die T-Gedächtniszellen des Knochenmarks bei erneuter Konfrontation mit demselben Antigen reagieren. Hier wird dieser Frage begegnet, indem durch klassiche Immunisierung mit definieren Antigenen eine stabile Population Ag-spezifischer CD8+ und CD4+ T-Gedächtniszellen im Knochenmark erzeugt wird. / The bone marrow (BM) harbors critical components of the adaptive immune system being able to provide long-lasting protection against previously encountered pathogens, thus qualifying as a reservoir of immunological memory. In addition to long-lived antibody producing plasma cells, antigen (Ag)-specific CD8+ and CD4+ memory T lymphocytes are maintained long-term in the BM even when they are absent from secondary lymphoid organs (SLOs) and blood. Those memory T cells are thought to respond fast upon re-encounter of systemic pathogens. However, the biological mechanisms behind their long-term maintenance in the BM are still a matter of debate and thus remain unclear. Similarly, it is also unclear how the memory T cells of the BM react to antigenic re-challenge. Here we address these issues by generating a stable pool of Ag-specific CD8+ and CD4+ memory T lymphocytes in the BM by classical immunizations with defined antigens.

In this PhD thesis the potential of T-cells as therapy for disease are explored. The applications of genetically modified T-cells for treatment of cancer and autoimmune disease; the functionality and optimal activation of T-cells are discussed. Successful treatment of cancer with T-cell receptor (TCR)-modified T-cells was first reported in 2006, and is based on recognition of a specific peptide by the TCR in the context of the MHC molecule. As antigen presentation in tumors is often defective and to avoid MHC-restriction, chimeric antigen receptors (CAR) molecules containing an antibody part for recognition of cell surface antigens and TCR and co-receptor signaling domains have been developed. Activated T-cells mount an efficient immune response resulting in the killing of the cancer cell and initiating T-cell proliferation. The rationale for using genetically modified T-cells instead of isolating tumor infiltrating lymphocytes from the tumor and expanding them (TIL therapy) is that it is often very difficult to obtain viable lymphocytes that are able to expand enough in order to use them for therapy. This thesis explores the possibility of using prostate-specific antigens to target T-cells towards prostate cancer. The prostate has many unique tissue antigens but most patients with metastatic prostate cancer have undergone prostatectomy and consequently have “prostate antigen” expression only in cancer cells. We targeted the prostate antigens TARP and PSCA with a HLA-A2 restricted TCR and a CAR respectively. In both cases the tumor-specific T-cells were able to generate potent proliferative and cytotoxic responses in vitro. The PSCA CAR-modified T-cells delayed subcutaneous tumor growth in vivo. It is evident from our in vivo experiments that the PSCA CAR T-cells were unable to completely cure the mice. Therefore, we aimed to improve the quality of the transferred T-cells and their resistance to the immunosuppressive tumor microenvironment. Stimulation with allogeneic lymphocyte-licensed DCs improved the resistance to oxidative stress and antitumor activity of the T-cells. We further investigated the potential of genetically modified regulatory T-cells (Tregs) to suppress effector cells in an antigen-specific manner. Using a strong TCR we hypothesize that the phenotype of the TCR-transduced Tregs may be affected by antigen activation of those cells. We found that the engineered Tregs produced cytokines consistent with Th1, Th2 and Treg phenotypes.

Mit durchflusszytometrischen und molekularbiologischen Verfahren wurden verschiedene Subpopulationen peripherer T-Lymphozyten bei gesunden Spendern und Nierentransplantatempfängern phänotypisch und funktionell untersucht. Wir fanden, dass eine T-Zell-Population, welche unter anderem die Oberflächenmarker LFA-1 und CD57 exprimierte, nicht aber CD28, terminale Effektorzellen enthielt. Wegen der bekannten Assoziation der Expansion CD57-positiver CD8-positiver T-Zellen mit einer Infektion mit dem Zytomegalievirus (CMV), wollten wir untersuchen, ob auch CMV-spezifische Effektorzellen darin enthalten waren. Um diesen möglichen Zusammenhang zwischen Phänotyp und Spezifität zu untersuchen, wurde ein bekanntes durchflusszytometrisches Verfahren zur Erfassung antigen-spezifischer CD4-T-Zellen so modifiziert, dass damit auch antigen-spezifische CD8-T-Zellen erfasst werden konnten. Dazu wurden frisch isolierte periphere mononukleäre Zellen in vitro mit löslichen Peptiden oder Peptidgemischen inkubiert (anstelle von Erregerlysaten oder Proteinantigenen wie im bekannten Verfahren), so dass durch direkte externe Beladung von MHC-I- und MHC-II- Molekülen nicht nur CD4- sondern auch CD8-T-Zellen stimuliert wurden. Anschließend konnten CD4 - und/oder CD8-positive T-Zellen nachgewiesen werden, in welchen es zur Synthese von Interferon-gamma gekommen war (intrazelluläre Färbung), wodurch diese Zellen als antigen-spezifisch identifiziert wurden. Diese Zellen konnten dann weiter phänotypisch analysiert werden. Unter Verwendung bekannter CD8-T-Zellen-stimulierender CMV-Peptide konnte der Phänotyp CMV-spezifischer CD8-T-Zellen untersucht werden, wobei sich zeigte, dass das CD57-positive Subset tatsächlich den gößeren Teil der CMV-spezifischen CD8 T-Zellen enthielt. Andererseits konnte das neue Verfahren verwendet werden, um weitere Peptide zu identifizieren, welche eine T-Zellstimulation bewirkten (Epitopkartierung). In zwei von uns untersuchten Proteinen des CMV (pp65 und IE-1) wurden so mehrere neue CD4- und CD8-T-Zellepitope beschrieben. Die Vewendung komplexer Peptidgemische erlaubte darüber hinaus die Untersuchung der T-Zellantwort gegen ganze Proteine (repräsentiert durch die Gesamtheit aller denkbaren Epitope), was insbesondere für die Untersuchung von CD8-T-Zellen eine große Bereicherung darstellte und vom MHC-Typ unabhängig war. Wir verwendeten dieses neue Verfahren bisher zur Analyse und zum Monitoring der T-Zellantwort gegen bestimmte Erregerproteine oder -peptide (z.B. aus CMV oder HIV). Es eignet sich darüber hinaus auch zur Untersuchung der Immunantwort gegen Impfstoffe, welche zur Induktion von T-Zellen führen sollen. / Using flow-cytometric and molecular-biology methods subpopulations of peripheral blood T-lymphocytes were examined in healthy donors and renal transplant recipients with respect to phenotype and function. We found that a T-cell population that expressed the surface markers LFA-1 and CD57 (among others), but not CD28, contained terminal effector cells. Because of the known association of an expansion of CD57-positive CD8-positive T-cells with an infection with Cytomegalovirus (CMV), we wanted to examine if CMV-specific effector cells were also contained in this subset. In order to investigate this association between phenotype and specificity, we modified a known flow-cytometric method for the detection of antigen-specific CD4 T-cells in such a way that antigen-specific CD8 T-cells could also be detected. For this purpose freshly isolated mononuclear cells were incubated in vitro with soluble peptides or peptide mixes (instead of pathogen lysates or protein antigens as used in the original method) so that following direct external loading of MHC-I and MHC-II molecules not only CD4 T-cells but also CD8-T-cells were stimulated. Subsequently, CD4 and/or CD8 T-cells that had synthesized Interferon-gamma (intracellular staining), which identified them as being antigen-specific, could be detected. These cells could then be analyzed with regard to phenotype. Using known CD8-T-cell stimulating CMV-peptides, the phenotype of CMV-specific CD8 T-cells could be analyzed. Thus it was demonstrated that the majority of CMV-specific CD8 T-cells was indeed contained in the CD57-positive subset. On the other hand, this new approach allowed the identification of additional peptides that stimulated T-cells (epitope mapping). In two CMV-proteins that we examined (pp65 and IE-1) several new CD4 and CD8-T-cell epitopes were described. The use of complex peptide mixes in this approach allowed the analysis of T-cell responses to complete proteins (represented by the entirety of all possible epitopes), which was a great benefit to the analysis of CD8 T-cells and independent of MHC-type. Until now, we have used this new method for the analysis and the monitoring of the T-cell response to specific pathogen proteins or peptides (e.g. from CMV or HIV). It is suitable, moreover, for the analysis of the immune response to vaccinations that aim at the induction of T-cells.