Made available in DSpace on 2014-06-12T16:33:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9577_1.pdf: 1768743 bytes, checksum: c046c2e599c3352eafc1b44851f7e9bb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / As infecções parasitárias causadas por protozoários patogênicos afetam mais de 3 bilhões de pessoas em todo o mundo e representam um importante fardo de saúde e econômico. Apesar do empenho no desenvolvimento de vacinas, a quimioterapia permanece o meio isolado mais efetivo e barato de controlar a maioria das infecções microbianas e parasitarias. Um derivado nitrofurano, a Nitrofurazona (5-nitro-2- furfurilidenosemicarbazona) estudado inicialmente na década de 40, tem merecido destaque por se tratar de um composto que possui atividade antimicrobiana de largo espectro de ação contra microorganismos Gram-positivos e Gram-negativos, como também potente ação para a forma aguda da doença de Chagas. Entretanto, este composto apresenta efeitos tóxicos, além de baixa lipossolubilidade, o que requer maiores concentrações para obter efeitos terapêuticos desejáveis. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi sintetizar, mediante emprego da modificação molecular, fundamentada na homologação do protótipo (Nitrofurazona), a obtenção e caracterização de novos derivados mais potentes e menos tóxicos. Os novos derivados da Nitrofurazona foram sintetizados mediante a inédita alquilação em meio aprótico, na posição N2 e N2,N4 da porção semicarbazona, com bons rendimentos e grau de pureza. Os derivados N2-monoalquilados foram os mais ativos da série, quanto à atividade antimicrobiana em ensaio in vitro frente a microorganismos patogénos, revelando-se mais potente que o protótipo, principalmente para bactérias Grampositivos, incluindo cepas de S. aureus multi-resistentes (MRSA). A atividade antichagásica foi determinada in vitro frente a forma epimastigota do T. cruzi, cepas Y, nos quais os derivados N2,N4-dialquilados foram mais potentes que o protótipo. A toxicidade aguda preliminar in vivo foi realizada para o derivado N2-monobutil (mais potente derivado antimicrobiano), com DL50 = 186mg/kg, se revelando ligeiramente mais tóxico que o protótipo; no entanto por ser este derivado mais lipossolúvel, seu transporte é facilitado com maior poder de penetração celular. Os resultados obtidos foram bons, tanto no método desenvolvido e rendimentos obtidos aos novos derivados, como também o aumento da lipofília e a potencialização destes, frente a microrganismos e ao parasita T. cruzi

Bacteriocinas são peptídeos com atividade bactericida ou bacteriostática para espécies sensíveis ao produto bacteriano. Estas substâncias são compostos heterogêneos em relação à massa molecular, propriedades bioquímicas, espectro inibitório e mecanismos de ação. Apesar dos trabalhos realizados quanto à biodiversidade da Amazônia, poucos estudos são desenvolvidos com o objetivo de investigar a complexidade genética e o potencial biotecnológico desta região, principalmente quando se trata de micro-organismos. Neste âmbito, o presente trabalho teve como objetivo verificar a presença de genes de bacteriocinas produzidas por diferentes linhagens de Bacillus isoladas de intestino de peixes da Região Amazônica, Brasil. Os PCRs mostraram que as cinco linhagens testadas apresentam o gene funcional codificante de malonil Coa transacilase (ituD), para o gene codificador da pré-subtilosina A (sboA) e para o gene codificador da pré-subtilina (spaS). Quatro isolados possuem também o suposto gene terminador transcricional (sfp). A inibição do crescimento de fungos fitopatogênicos caracterizou a atividade antimicótica dos isolados. A caracterização da atividade biossurfactante foi realizada pela presença de zonas de hemólise ao redor de cada colônia e atividade emulsificante. Análises realizadas por MALDI-TOF confirmam a produção de surfactina, iturina A, subtilina, subtilosina A e isoformas. Ao comparar as linhagens de Bacillus Amazônicos com Bacillus subtilis ATCC 19659 em relação ao nível de expressão de sboA e ituD, observou-se, de forma geral, um nível de expressão de sboA pelos isolados Amazônicos inferior a B. subtillis ATCC 19659. Em contraste, quando os níveis de ituD foram avaliados, percebeu-se que as linhagens Amazônicas exibiram altos níveis de expressão deste gene. Acredita-se que independente do controle regulatório a que estão subordinados os operons de iturina A e subtilosina A nas condições de estresse utilizadas por este estudo, os isolados de Bacillus possuem um nível basal de expressão diferenciado entre si e em relação à B. subtilis ATCC 19659. / Bacteriocins are peptides with bactericidal or bacteriostatic activity for species closely related to bacterial product. These substances are heterogeneous compounds in relation to molecular weight, biochemical properties, inhibitory spectrum and mechanisms of action. Despite the work done on the biodiversity of the Amazon, few studies were developed with the objective of investigating the genetic complexity and biotechnology potential in this region, especially when it comes to microorganisms. In this context, this study aimed to verify the presence of genes of bacteriocins produced by five strains of Bacillus isolated from aquatic environment of the Amazon region, Brazil. The PCRs showed that strains tested exhibit potential for the functional gene encoding for malonyl CoA transacilase (ituD), for the gene encoding prosubtilosin A (sboA), and the gene encoding prosubtilin (spaS). Four isolates also have potential for the putative transcriptional terminator gene (sfp). Inhibiting the growth of pathogenic fungi characterizes the antimycotic activity of the isolates. The characterization of biosurfactant activity is undertaken by the presence of zones of hemolysis around each colony, as well the emulsifying activity. Analyses carried out by MALDI-TOF mass spectrometry confirmed the production of surfactin, iturin A subtilin, subtilosin A and isoforms. By comparing Bacillus strains isolated from the Amazon region with Bacillus subtilis ATCC 19659 on the level of sboA and ituD expression, there was, overall, a level of sboA expression of the isolated Amazonian less than B. subtilis ATCC 19659. In contrast, when levels of ituD were evaluated, it was noticed that the Amazonian strains exhibited high levels of expression of this gene. It is believed that regardless of regulatory control that are the subject of iturin A and subtilosin A operons in stress conditions used in this study, isolates of Bacillus have a baseline level of expression is different among themselves and in relation to B. subtilis ATCC 19659.

Orientadora: Profa Dra Fernanda Dias da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. / A microplusina e um peptideo antimicrobiano (PAM), quelante de cobre e ferro, presente no carrapato bovino Riphicephalus microplus. Possui estrutura globular, arranjada em cinco ¿¿-helices e e rica em residuos de cisteina e histidina. As histidinas His-2 e His-74 estao entre os possiveis residuos de aminoacidos envolvidos na formacao do sitio de ligacao ao cobre, de acordo com dados de RMN. Seu amplo espectro de atividade contra bacterias Gram-positivas e fungos pode estar associado a sua capacidade de quelar cobre e estudos com Micrococcus luteus e Cryptococcus neoformans, mostraram que a adicao de cobre ao meio anula o seu efeito bacteriostatico e fungistatico, respectivamente. A microplusina ao ligar cobre, possivelmente, diminui a disponibilidade deste metal, o que pode afetar a atividade de enzimas dependentes de cobre. Culturas de M. luteus e C. neoformans tratadas com o peptideo apresentaram uma reducao no seu consumo de oxigenio e dados sugerem que a deplecao de cobre pode ter afetado a atividade de heme cobre oxidases pertencentes a uma das vias da cadeia transportadora de eletrons. A microplusina tambem interfere na sintese de melanina de C. neoformans, o que pode estar relacionado a uma diminuicao da atividade da lacase, uma enzima cobre dependente. Esses dados indicam o enorme potencial da microplusina como farmaco e estudos sobre quais aminoacidos de sua sequencia sao importantes para manutencao de sua estrutura e atividades tornam-se essenciais. Sendo assim, o presente projeto propos como objetivo principal avaliar o efeito da substituicao das histidinas amino-terminais His-1 e His-2 por residuos de alanina, utilizando-se para isso, a expressao recombinante de duas variantes da microplusina (MPmH1A e MPmH2A). Os resultados demonstraram o surgimento inesperado de mais de uma molecula com atividade antimicrobiana para a variante MPmH1A, indicando que mais estudos serao necessarios para avaliar a atividade destes peptideos. Por sua vez a variante MPmH2A teve sua atividade antimicrobiana mantida mesmo sem a presenca do residuo de histidina 2 (His- 2). Porem em ambas nao foi possivel detectar a atividade quelante de cobre, indicando assim que atividade antimicrobiana pode ter ocorrido por outras vias, bem como que o residuo de histidina 2 pode ser essencial para a atividade quelante de cobre. / Microplusin is an antimicrobial and chelating peptide (AMP) for both copper II and iron II, present in the cattle tick Riphicephalus microplus. Its structure is globular, with five alpha helices and rich in cysteine and histidine residues. The histidines His-2 and His-74 are the possible amino acids involved in the copper-binding site. Its broad activity spectrum against Gram-positive bacteria and fungi may be associated with its ability to chelate copper and studies with Micrococcus luteus and Cryptococcus meoformans have shown the copper addition in the media abrogate its bacteriostatic and fungistatic effect, respectively. The binding of microplusin to copper, possibly decreases the metal availability in the media, which may affect the activity of copper dependent enzymes. In fact, M. luteus and C. neoformans cultures treated with microplusin, shown a reduction in their oxygen consumption and data suggest the copper depletion may have affected the activity of heme copper oxidases, belonging to one of the transport chain of electrons.This peptide also affects the melanization of C. neoformans. The melanization reduction is related to a lacase activity decrease, a copper dependent enzyme. Microplusin activities indicate its huge potential as a promising therapeutic and studies about which amino acids in its sequence are important to its structure maintenance and activities become essential. Therefore, the main objective of this project was evaluate the effect of amino-terminal histidines His-1 e His-2 substitution for alanine residues, using, for that, a recombinant expression of two microplusin variants (MPmH1A e MPmH2A). The results showed the unexpected onset of more than one molecule with antimicrobial activity for MPmH1A variant, indicating that more studies are necessary to evaluate the activity of these peptides. In turn, the MPmH2A variant had its antimicrobial activity maintained even without the presence of histidine residue 2 (His-2). However in both has not been possible detect the chelating activity of copper, indicating that antimicrobial activity may have happened by other means well as the residue of histidine 2 can be essential for the chelating activity of copper.

Bacteriocinas são peptídeos com atividade bactericida ou bacteriostática para espécies sensíveis ao produto bacteriano. Estas substâncias são compostos heterogêneos em relação à massa molecular, propriedades bioquímicas, espectro inibitório e mecanismos de ação. Apesar dos trabalhos realizados quanto à biodiversidade da Amazônia, poucos estudos são desenvolvidos com o objetivo de investigar a complexidade genética e o potencial biotecnológico desta região, principalmente quando se trata de micro-organismos. Neste âmbito, o presente trabalho teve como objetivo verificar a presença de genes de bacteriocinas produzidas por diferentes linhagens de Bacillus isoladas de intestino de peixes da Região Amazônica, Brasil. Os PCRs mostraram que as cinco linhagens testadas apresentam o gene funcional codificante de malonil Coa transacilase (ituD), para o gene codificador da pré-subtilosina A (sboA) e para o gene codificador da pré-subtilina (spaS). Quatro isolados possuem também o suposto gene terminador transcricional (sfp). A inibição do crescimento de fungos fitopatogênicos caracterizou a atividade antimicótica dos isolados. A caracterização da atividade biossurfactante foi realizada pela presença de zonas de hemólise ao redor de cada colônia e atividade emulsificante. Análises realizadas por MALDI-TOF confirmam a produção de surfactina, iturina A, subtilina, subtilosina A e isoformas. Ao comparar as linhagens de Bacillus Amazônicos com Bacillus subtilis ATCC 19659 em relação ao nível de expressão de sboA e ituD, observou-se, de forma geral, um nível de expressão de sboA pelos isolados Amazônicos inferior a B. subtillis ATCC 19659. Em contraste, quando os níveis de ituD foram avaliados, percebeu-se que as linhagens Amazônicas exibiram altos níveis de expressão deste gene. Acredita-se que independente do controle regulatório a que estão subordinados os operons de iturina A e subtilosina A nas condições de estresse utilizadas por este estudo, os isolados de Bacillus possuem um nível basal de expressão diferenciado entre si e em relação à B. subtilis ATCC 19659. / Bacteriocins are peptides with bactericidal or bacteriostatic activity for species closely related to bacterial product. These substances are heterogeneous compounds in relation to molecular weight, biochemical properties, inhibitory spectrum and mechanisms of action. Despite the work done on the biodiversity of the Amazon, few studies were developed with the objective of investigating the genetic complexity and biotechnology potential in this region, especially when it comes to microorganisms. In this context, this study aimed to verify the presence of genes of bacteriocins produced by five strains of Bacillus isolated from aquatic environment of the Amazon region, Brazil. The PCRs showed that strains tested exhibit potential for the functional gene encoding for malonyl CoA transacilase (ituD), for the gene encoding prosubtilosin A (sboA), and the gene encoding prosubtilin (spaS). Four isolates also have potential for the putative transcriptional terminator gene (sfp). Inhibiting the growth of pathogenic fungi characterizes the antimycotic activity of the isolates. The characterization of biosurfactant activity is undertaken by the presence of zones of hemolysis around each colony, as well the emulsifying activity. Analyses carried out by MALDI-TOF mass spectrometry confirmed the production of surfactin, iturin A subtilin, subtilosin A and isoforms. By comparing Bacillus strains isolated from the Amazon region with Bacillus subtilis ATCC 19659 on the level of sboA and ituD expression, there was, overall, a level of sboA expression of the isolated Amazonian less than B. subtilis ATCC 19659. In contrast, when levels of ituD were evaluated, it was noticed that the Amazonian strains exhibited high levels of expression of this gene. It is believed that regardless of regulatory control that are the subject of iturin A and subtilosin A operons in stress conditions used in this study, isolates of Bacillus have a baseline level of expression is different among themselves and in relation to B. subtilis ATCC 19659.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-29T19:41:10Z No. of bitstreams: 1 2014_MarianaDornellesCherobim.pdf: 2253045 bytes, checksum: 30449b1622cd0a37b98957acf907b947 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2014-10-30T17:37:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MarianaDornellesCherobim.pdf: 2253045 bytes, checksum: 30449b1622cd0a37b98957acf907b947 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-30T17:37:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MarianaDornellesCherobim.pdf: 2253045 bytes, checksum: 30449b1622cd0a37b98957acf907b947 (MD5) / Peptídeos antimicrobianos (PAM) são componentes do sistema imune inato da maioria dos seres vivos. Estas moléculas vêm despertando um crescente interesse como alternativas aos antibióticos clássicos, uma vez que podem apresentar atividade antimicrobiana potente contra um amplo espectro de microrganismos, inclusive contra microrganismos resistentes aos antimicrobianos disponíveis. Por mais dinâmica que sejam as indústrias farmacêuticas na busca por novos fármacos, é praticamente impossivel o mercado farmacêutico acompanhar o espantoso fenômeno da multirresistência apresentada por muitos microrganismos. Neste contexto, os PAMs surgem como uma alternativa farmacológica, pois podem ser usados isoladamente ou combinados entre si ou com outros antibióticos clássicos. Neste estudo foi avaliada a atividade antimicrobiana de dois peptídeos sintéticos e análogos denominados Pa-MAP 1.5 e Pa-MAP 1.9, derivados de um peptídeo do peixe Pleuronectes americanus. Os dois análogos tiveram sua homogeneidade e grau de pureza analisados por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e posteriormente foram submetidos a ensaios antimicrobianos, isoladamente e em combinação, contra a bactéria Gram-negativa Klebsiella pneumoniae e avaliados também, com relação à sua atividade citotóxica Os resultados in vitro evidenciaram uma forte atividade sinérgica com CIM de 4/4g.ml-1, dos peptídeos, sendo que esta concentração não se mostrou citotóxica. Resultados dos testes In vivo, mostraram que a combinação de peptídeos foi eficiente, sendo observado um decréscimo notável de UFCs de K. pneumoniae no sangue bem como nos pulmões, de camundongos Black C57/bl6. Os animais foram tratados com os peptídeos combinados, inoculados por via intravenosa, utilizando concentrações de 36 mg.Kg-1, 18mg.Kg-1 e 9mg.Kg-1 para o peptídeo Pa-MAP 1.5; e para o peptídeo Pa-MAP 1.9 as doses utilizadas foram de 4mg.Kg-1, 2mg.Kg-1 e 1mg.Kg-1. Com o objetivo de entender como ocorre o acoplamento e a interação destes peptídeos, foram propostos modelos tridimensionais in silico através de modelagem molecular. Resultados das modelagens in silico sugerem uma estrutura em α-hélice anfipática, para ambos os peptídeos. Quando se realizou o acoplamento molecular dos peptídeos com uma membrana aniônica, os peptídeos conjugados 11 apresentaram uma alta taxa de afinidade, corroborando assim com os resultados experimentais in vitro e in vivo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Antimicrobial peptides (AMPs) are innate immune system components, which are present in several living organisms. This molecules interesting is growing as an alternative for traditional antibiotics due to their potent antimicrobial activities against a broad range of microorganisms including those resistant to classical antibiotics. In spite of pharmaceutical companies dynamism for new drugs discovery, have been virtually impossible to pharmaceutical market to keep up the amazing multidrug resistance phenomen shown by many microorganisms. By this way, antimicrobial peptides stand out as promising pharmacological alternatives, since they can be used alone or in combination to classic antibiotic. In this view, the present study characterized the activity of two synthetic analogues, named Pa-MAP 1.5 and Pa-MAP 1.9 from Pleuronectes americanus fish. Both analogs had the homogeinity and purity degree checked by MALDI-ToF mass spectrometry. Moreover, peptides were assayed according their antibacterial activity, alone and in combination against Gram-negative Klebsiella pneumonia as well as their hemolytic activity. Data in vitro assay demonstrate a strong synergistic activity between peptides, with MIC of 4/4g.ml-1. Nevertheless at this concentration they did not showed cytolytic effects. The in vivo results showed that peptides combination were capable to pronounced decrease K. pneumoniae’s UFCs in blood count, as well in black C57/bl6 mouse’s lung. The animals were treated with the combined peptides via intravenously using concentrations of 36 mg.Kg-1, 18 mg.Kg-1 and 9 mg.Kg-1 for Pa-MAP 1.5; and 4mg.Kg-1, 2mg.Kg-1 e 1mg.Kg-1 for Pa-MAP 1.9. In order to understand these peptides interact in silico three-dimensional models were constructed by molecular modeling. Results of in silico modeling suggest amphipathic α-helical structures for both peptides. When molecular peptide docking was performed with anionic membranes, conjugated peptides showed high affinity rates, thus corroborating with in vitro and in vivo data presented.

Bacteriocinas são peptídeos com atividade bactericida ou bacteriostática para espécies sensíveis ao produto bacteriano. Estas substâncias são compostos heterogêneos em relação à massa molecular, propriedades bioquímicas, espectro inibitório e mecanismos de ação. Apesar dos trabalhos realizados quanto à biodiversidade da Amazônia, poucos estudos são desenvolvidos com o objetivo de investigar a complexidade genética e o potencial biotecnológico desta região, principalmente quando se trata de micro-organismos. Neste âmbito, o presente trabalho teve como objetivo verificar a presença de genes de bacteriocinas produzidas por diferentes linhagens de Bacillus isoladas de intestino de peixes da Região Amazônica, Brasil. Os PCRs mostraram que as cinco linhagens testadas apresentam o gene funcional codificante de malonil Coa transacilase (ituD), para o gene codificador da pré-subtilosina A (sboA) e para o gene codificador da pré-subtilina (spaS). Quatro isolados possuem também o suposto gene terminador transcricional (sfp). A inibição do crescimento de fungos fitopatogênicos caracterizou a atividade antimicótica dos isolados. A caracterização da atividade biossurfactante foi realizada pela presença de zonas de hemólise ao redor de cada colônia e atividade emulsificante. Análises realizadas por MALDI-TOF confirmam a produção de surfactina, iturina A, subtilina, subtilosina A e isoformas. Ao comparar as linhagens de Bacillus Amazônicos com Bacillus subtilis ATCC 19659 em relação ao nível de expressão de sboA e ituD, observou-se, de forma geral, um nível de expressão de sboA pelos isolados Amazônicos inferior a B. subtillis ATCC 19659. Em contraste, quando os níveis de ituD foram avaliados, percebeu-se que as linhagens Amazônicas exibiram altos níveis de expressão deste gene. Acredita-se que independente do controle regulatório a que estão subordinados os operons de iturina A e subtilosina A nas condições de estresse utilizadas por este estudo, os isolados de Bacillus possuem um nível basal de expressão diferenciado entre si e em relação à B. subtilis ATCC 19659. / Bacteriocins are peptides with bactericidal or bacteriostatic activity for species closely related to bacterial product. These substances are heterogeneous compounds in relation to molecular weight, biochemical properties, inhibitory spectrum and mechanisms of action. Despite the work done on the biodiversity of the Amazon, few studies were developed with the objective of investigating the genetic complexity and biotechnology potential in this region, especially when it comes to microorganisms. In this context, this study aimed to verify the presence of genes of bacteriocins produced by five strains of Bacillus isolated from aquatic environment of the Amazon region, Brazil. The PCRs showed that strains tested exhibit potential for the functional gene encoding for malonyl CoA transacilase (ituD), for the gene encoding prosubtilosin A (sboA), and the gene encoding prosubtilin (spaS). Four isolates also have potential for the putative transcriptional terminator gene (sfp). Inhibiting the growth of pathogenic fungi characterizes the antimycotic activity of the isolates. The characterization of biosurfactant activity is undertaken by the presence of zones of hemolysis around each colony, as well the emulsifying activity. Analyses carried out by MALDI-TOF mass spectrometry confirmed the production of surfactin, iturin A subtilin, subtilosin A and isoforms. By comparing Bacillus strains isolated from the Amazon region with Bacillus subtilis ATCC 19659 on the level of sboA and ituD expression, there was, overall, a level of sboA expression of the isolated Amazonian less than B. subtilis ATCC 19659. In contrast, when levels of ituD were evaluated, it was noticed that the Amazonian strains exhibited high levels of expression of this gene. It is believed that regardless of regulatory control that are the subject of iturin A and subtilosin A operons in stress conditions used in this study, isolates of Bacillus have a baseline level of expression is different among themselves and in relation to B. subtilis ATCC 19659.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5622_1.pdf: 652971 bytes, checksum: 5cf0265224e3cb7b596a27276eaf94c4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / A utilização de antibióticos pode ser considerada um dos principais avanços no tratamento de doenças infecciosas desde o século passado, entretanto, a redução da sensibilidade aos agentes antimicrobianos de uso corrente tem aumentado em uma grande variedade de patógenos e a resistência a múltiplas drogas tem sido comum a vários microrganismos. Esta diminuição tem sido observada quando se avalia, por exemplo, o perfil de sensibilidade de bacilos Gram-negativos como Escherichia coli frente aos betalactâmicos, uma classe de antibióticos muito utilizada clinicamente. A busca por novos medicamentos que possam trazer maior sucesso nos tratamentos, minimizando os casos de resistência microbiana, tem aumentado significativamente, e a química orgânica, através dos planejamentos e modificações moleculares tem contribuído em grande parte das descobertas. As tiazolidinas e imidazolidinas representam uma classe de compostos de grande interesse científico devido às suas propriedades químicas e ao extenso espectro de atividades biológicas. Neste trabalho, derivados tiazolidínicos e imidazolidínicos foram avaliados acerca da atividade antimicrobiana frente a bactérias e fungos. O caldo e o ágar Mueller-Hinton e Sabouraud foram usados para os testes e diluições seriadas dos compostos de concentrações variando entre 128μg/ml e 0,5μg/ml foram preparadas em Dimetilformamida(DMF). Os experimentos foram realizados em microplacas, incubadas em estufa bacteriológica, após as quais o conteúdo foi semeado em placas de Petri, contendo meio sólido, para análise da presença ou ausência de crescimento, sendo considerada a Concentração Inibitória Mínima(CIM) a menor concentração da droga para a qual não havia presença de colônias. Foi verificada atividade antimicrobiana frente a todos os compostos, estando o melhor resultado de CIM igual a 32μg/mL. O derivado imidazolidínico NN-41 foi utilizado para avaliação do efeito sinérgico, quando combinado com o antibiótico ampicilina sobre a bactéria Escherichia coli resistente (ATCC 35218). O teste de difusão em meio sólido, após a ação sinérgica, mostrou halo de inibição de 20mm, enquanto a ampicilina isolada mostrou halo 14mm, demonstrando que a combinação resultou em maior ação antibacteriana. A mesma bactéria foi avaliada, via microscopia eletrônica de transmissão acerca das alterações estruturais, após o tratamento com o composto NN-41, sendo observado alterações na morfologia da parede celular, formação de vacúolos e edemas intracelulares. Os resultados sugerem capacidade antimicrobiana dos novos derivados tiazolidínicos e imidazolidínicos utilizados, inclusive com potencial de utilização frente a uma bactéria Gram negativa multirresistente da espécie Escherichia coli de grande interesse clínico

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9561_1.pdf: 666223 bytes, checksum: 4eeb4297cede9922bd396a7f3a8879d2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / A utilização de antibióticos pode ser considerada um dos principais avanços no tratamento de doenças infecciosas desde o século passado, entretanto, a redução da sensibilidade aos agentes antimicrobianos de uso corrente tem aumentado em uma grande variedade de patógenos e a resistência a múltiplas drogas tem sido comum a vários microrganismos. Esta diminuição tem sido observada quando se avalia, por exemplo, o perfil de sensibilidade de bacilos Gram-negativos como Escherichia coli frente aos betalactâmicos, uma classe de antibióticos muito utilizada clinicamente. A busca por novos medicamentos que possam trazer maior sucesso nos tratamentos, minimizando os casos de resistência microbiana, tem aumentado significativamente, e a química orgânica, através dos planejamentos e modificações moleculares tem contribuído em grande parte das descobertas. As tiazolidinas e imidazolidinas representam uma classe de compostos de grande interesse científico devido às suas propriedades químicas e ao extenso espectro de atividades biológicas. Neste trabalho, derivados tiazolidínicos e imidazolidínicos foram avaliados acerca da atividade antimicrobiana frente a bactérias e fungos. O caldo e o ágar Mueller-Hinton e Sabouraud foram usados para os testes e diluições seriadas dos compostos de concentrações variando entre 128μg/ml e 0,5μg/ml foram preparadas em Dimetilformamida(DMF). Os experimentos foram realizados em microplacas, incubadas em estufa bacteriológica, após as quais o conteúdo foi semeado em placas de Petri, contendo meio sólido, para análise da presença ou ausência de crescimento, sendo considerada a Concentração Inibitória Mínima(CIM) a menor concentração da droga para a qual não havia presença de colônias. Foi verificada atividade antimicrobiana frente a todos os compostos, estando o melhor resultado de CIM igual a 32μg/mL. O derivado imidazolidínico NN-41 foi utilizado para avaliação do efeito sinérgico, quando combinado com o antibiótico ampicilina sobre a bactéria Escherichia coli resistente (ATCC 35218). O teste de difusão em meio sólido, após a ação sinérgica, mostrou halo de inibição de 20mm, enquanto a ampicilina isolada mostrou halo 14mm, demonstrando que a combinação resultou em maior ação antibacteriana. A mesma bactéria foi avaliada, via microscopia eletrônica de transmissão acerca das alterações estruturais, após o tratamento com o composto NN-41, sendo observado alterações na morfologia da parede celular, formação de vacúolos e edemas intracelulares. Os resultados sugerem capacidade antimicrobiana dos novos derivados tiazolidínicos e imidazolidínicos utilizados, inclusive com potencial de utilização frente a uma bactéria Gram negativa multirresistente da espécie Escherichia coli de grande interesse clínico

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-10-08T21:48:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Charles Fernandes dos Santos Simões.pdf: 1267840 bytes, checksum: fd5cd699bcc0a35150281d99cfaa2efc (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-11-22T17:34:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Charles Fernandes dos Santos Simões.pdf: 1267840 bytes, checksum: fd5cd699bcc0a35150281d99cfaa2efc (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-22T17:34:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Charles Fernandes dos Santos Simões.pdf: 1267840 bytes, checksum: fd5cd699bcc0a35150281d99cfaa2efc (MD5) Previous issue date: 2015-09-11 / Nos últimos anos, novos desafios têm surgido para os pesquisadores no âmbito das ciências médicas; sobretudo, destacam-se: a procura por novas terapias contra câncer, a busca por novos agentes anti-inflamatórios que não apresentem as reações adversas típicas e o combate à multirresistência microbiana. Annona muricata L. (Annonaceae), conhecida vulgarmente como gravioleira e na medicina popular, tem sido empregado no tratamento de inflamações, febres, infecções e diabetes. Além disso, tem demonstrado ser potencialmente eficaz na terapia contra o câncer. Com base nisso, objetivou-se, nesse trabalho, analisar o perfil fitoquímico de extratos obtidos das folhas de A. muricata L. e executar uma triagem farmacológica visando a avaliação do seu potencial antimicrobiano, citotóxico e anti-inflamatório. Primeiramente, foi realizada a extração das folhas de A. muricata L., utilizando os solventes hexano, acetato de etila, etanol e água, através da técnica de Soxhlet e obteve-se como respostas os respectivos rendimentos (3,37%, 3,20%, 6,22% e 9,09%). Em seguida, através da técnica de Cromatografia em Camada Delgada (CCD), foram identificados os grupos de metabólitos secundários. Posteriormente, avaliou-se a atividade antimicrobiana dos quatro diferentes extratos em questão frente a cepas de bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e de fungos leveduriformes, assim como as atividades citotóxicas frente à três diferentes linhagens de células tumorais e as atividades anti-inflamatórias através da avaliação da produção de óxido nítrico (NO). A triagem fitoquímica revelou a presença de mono e sesquiterpenos, triterpenos e esteroides, flavanoides, taninos, cumarinas e alcaloides. Os extratos hexânico e acetato de etila não apresentaram atividade frente às cepas testadas, já os extratos etanólico e aquoso exibiram atividade frente a cepas Gram-positivas, com halos de 19 mm frente a Micrococcus luteus, para o extrato etanólico, e 18 mm frente a Staphylococcus coagulase-negativa para o extrato aquoso, e em algumas Gram-negativas, 11 mm frente a Proteus mirabilis para o extrato etanólico, porém sem atividade frente aos fungos. A respeito da atividade citotóxica, todos os extratos apresentaram atividades inibitórias frente às linhagens testadas, sobretudo a linhagem HEp-2 onde todos apresentaram inibição de 100% na concentração avaliada. A ação anti-inflamatória dos extratos também foi efetiva, todos os extratos analisados reduziram a produção de NO induzida a níveis basais em todas as concentrações estudadas, especialmente os extratos etanólico e aquoso. Pode-se considerar que A. muricata trata-se de uma opção para a busca de novos agentes terapêuticos e como fonte de moléculas de grande interesse científico. Os resultados corroboraram com o seu uso tradicional, reforçando mais ainda sua comprovação científica a respeito de suas propriedades, possibilitando assim maiores estudos para a sua viabilidade terapêutica. / In the recent years, new challenges have arisen for researchers in the field of medical science such as the quest for new therapies against cancer, the search for new anti- inflammatory agents that do not represent the typical adverse reactions and also the the struggle against microbial multidrug resistance. Annona muricata L. (Annonaceae), commonly known as soursop and famous for its therapeutic properties in folk medicine, has been employed in the treatment of inflammations, fevers, infections and diabetes. Moreover, it has shown to be potentially effective in cancer therapy. On this basis, the goal of this work was to analyze the phytochemical profile of extracts obtained from the leaves of A. muricata L. and run a pharmacological screening aimed at assessing its antimicrobial, cytotoxic and anti-inflammatory potential. Firstly, the extraction process was employed in the leaves of A. muricata L., using several solvents such as hexane, ethyl acetate, ethanol and water by Soxhlet extractor and were obtained their respective yields as responses (3.37%, 3.20%, 6.22% and 9.09%). Then, through Thin Layer Chromatography (TLC), the groups of secondary metabolites were identified. Subsequently, the four different extracts were evaluated concerning the antimicrobial activity against strains of Gram-positive bacteria, Gram-negative, and yeast fungi, as well as the cytotoxic activity against three different tumor cell lines and also the anti-inflammatory activities by assessing the production of nitric oxide (NO). The phytochemical screening revealed the presence of mono and sesquiterpenes, triterpenes and steroids, flavonoids, tannins, alkaloids and coumarins. The hexane extracts and ethyl acetate showed no activity against the strains tested, since the ethanol and aqueous extracts showed activity against Gram-positive strains, with halos of 19 mm against Micrococcus luteus for ethanolic extract, and 18 mm against Staphylococcus coagulase-negative for the aqueous extract, and in some Gram-negative strains, 11 mm against Proteus mirabilis for the ethanolic extract, but without activity against the yeasts. Regarding the cytotoxic activity, all extracts showed inhibitory activities across the tested strains, especially Hep-2 line where all showed inhibition of 100% in the assessed concentration. The anti-inflammatory action of the extracts was also effective, since all analyzed extracts reduced NO production induced levels at all the concentrations studied, especially ethanol and aqueous extracts. It can be considered that A. muricata is an alternative to the search for new therapeutic and as a source of great scientific interest molecules agents. The results corroborate with its traditional use, further strengthening its scientific evidence regarding their properties, thus enabling further study for its therapeutic viability.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Texto liberado parcialmente pelo autor. Conteúdo restrito: Capítulo 2 e Apêndice I. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-18T18:32:08Z No. of bitstreams: 1 2016_DéboraFarageKnuppdosSantos_Parcial.pdf: 6708225 bytes, checksum: 0340ad0794bc4ae6a1b51344c09e8c3c (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-05-27T12:23:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DéboraFarageKnuppdosSantos_Parcial.pdf: 6708225 bytes, checksum: 0340ad0794bc4ae6a1b51344c09e8c3c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-27T12:23:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DéboraFarageKnuppdosSantos_Parcial.pdf: 6708225 bytes, checksum: 0340ad0794bc4ae6a1b51344c09e8c3c (MD5) / A resistência antimicrobiana tem sido uma grande ameaça à saúde humana, dada a disseminação de genes de resistência a antibióticos (ARGs) em patógenos e micro-organismos clinicamente importantes, promovendo o aparecimento de cepas multirresistentes de difícil tratamento, complicado também pela queda na quantidade de novos antibióticos lançados no mercado. Assim, pesquisas por determinantes genéticos da resistência a antibióticos em isolados clínicos têm sido intensificadas desde os primeiros relatos de resistência antimicrobiana no começo do século XX. Neste contexto, a diversidade ambiental dos ARGs vem sendo subestimada, apesar do conhecimento de que a origem destes genes são os ambientes naturais, em particular o solo. Os micro-organismos presentes nesses ambientes são, em sua maioria, ainda não cultiváveis e consequentemente desconhecidos, o que os torna importantes fontes de novos genes e biomoléculas de interesse biotecnológico. Entretanto, analisar sua totalidade depende de técnicas independentes de cultivo. A metagenômica apresenta-se como uma ferramenta importante, já que acessa os micro-organismos de uma dada amostra ambiental pela extração do seu DNA total, permitindo identificar genes de interesse por abordagem de sequência ou funcional. Na pesquisa por novos ARGs, a metagenômica funcional é de grande valia para identificar novos mecanismos de resistência antimicrobiana e inferir a real diversidade de ARGs no meio ambiente, além de investigar os papéis ecológicos destes genes fora do ambiente clínico. Em trabalho anterior, observou-se a presença de três genes para putativas dioxigenases em dois clones resistentes isolados de biblioteca metagenômica de pequenos insertos (com insertos de 3-8 Kb) construída com DNA de amostras de solo de Cerrado. Nesta Tese, apresentam-se dois capítulos: o primeiro aborda a hipótese de que as dioxigenases putativas estão associadas ao fenótipo resistente observado. Dessa forma, três subclones foram construídos e denominados AMX3(2), AMX3(3) e CRB2(1), para posteriores análises fenotípicas e estruturais, onde CRB2(1) mostrou-se capaz de causar resistência à carbenicilina em Escherichia coli – adicionalmente, também mostrou-se capaz de resistir à ação do fenol. Em análises estruturais e enzimáticas, inferiu-se que o inserto é uma extradioldioxigenase com domínio bicupina, sendo uma provável gentisato 1,2-dioxigenase (GDO). Estas enzimas são importantes no metabolismo de compostos aromáticos, o que as torna potenciais em processos de biorremediação. No segundo capítulo está descrita a análise das sequências de seis clones resistentes isolados de biblioteca metagenômica de grandes insertos (com insertos de mediana de 35 Kb), também construída com amostras de DNA de micro-organismos de solo de Cerrado. A anotação gênica somou um conjunto de dados de aproximadamente 0,27 Mb, num total de 172 prováveis genes. Tais ORFs foram agrupadas em oito diferentes classes, de acordo com funções selecionadas. Dentre elas, 1,2% eram referentes a enzimas previamente relacionadas à resistência antimicrobiana e 5,8% a transportadores, que também são importantes protagonistas na resistência a xenobióticos. Apesar da grande diversidade de funções observadas, a maior parte das ORFs foi anotada como hipotéticas, sendo fontes para descrição de possíveis novos ARGs, assim como de genes de interesse biotecnológico. Essas observações indicam que a diversidade de ARGs em ambientes naturais difere daquela classicamente encontrada em isolados clínicos, o que evidencia a importância em acessar micro-organismos ambientais na tentativa de revelar novos mecanismos de resistência a antibióticos, que vem a enriquecer o conhecimento sobre seus papéis ecológicos e auxiliar pesquisas das indústrias biotecnológicas, como na prospecção de antimicrobianos e em processos de biorremediação. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Antimicrobial resistance poses a grave threat to human health given the dissemination of antibiotic resistance genes (ARGs) in pathogens and in clinically important microorganisms, promoting the rise of multiresistant strains of difficult treatment, also aggravated by the decreasing quantity of new antimicrobials launched onto the market. Hence, since the first reports of antimicrobial resistance in the beginning of the 20th century, the research for the genetic determinants of antimicrobial resistance have been intensified. In this context, the environmental diversity of ARGs was underestimated, despite the knowledge that such genes are environmental-born, especially on the soil. The majority of environmental microorganisms are not yet cultivable and remain unknown, being an important source for novel genes and biomolecules of biotechnological interest. However, analyzing them requires culture independent techniques. Metagenomics rise as a powerful tool, since it access the microorganisms from an environmental sample by the extraction of their total DNA, allowing for the identification of genes of interest by sequence and functional approaches. In the search for new ARGs, functional metagenomics is a valuable method to identify novel mechanisms for antibiotic resistance and infer the actual diversity of environmental ARGs, while exploring their ecological roles outside the clinical setting. In a former work, three putative dioxigenase genes were observed in two resistant clones isolated from a small-insert metagenomic library (insert size 3-8 Kb) constructed with DNA samples from Cerrado soil. In this Thesis, two chapters are provided: the former addresses the hypothesis in which putative dioxygenases are involved in the resistant phenotype observed. In this manner, three subclones were constructed and named AMX3(2), AMX3(3) and CRB2(1), for further phenotypical and structural analysis, where CRB2(1) proved resistant to carbenicillin in Escherichia coli – additionally, it was also able to resist the action of phenol. In the structural and enzymatic assays, the insert was presupposed as an extradioldioxygenase with a bicupin domain, most probably a gentisate 1,2-dioxygenase (GDO). These are important enzymes on aromatic metabolism and potential resources in the bioremediation industry. The latter chapter describes the sequence analysis of six resistant clones isolated from a large-insert metagenomic library (insert size around 35 Kb), also constructed with DNA samples from Cerrado soil. Gene annotation comprised a 0.27 Mb dataset, summing 172 probable genes. Such ORFs were grouped in eight different classes, according to preselected functions. Within these, 1.2% were related to enzymatic mechanisms of resistance and 5.8% were classified as transporters, that also play important roles on xenobiotic resistance. Although a great diversity of functions were observed, a greater number of ORFs was classified as hypothetical, being sources for the description of novel ARGs as well as of other genes of biotechnological relevance. These observations imply that the diversity of environmental ARGs differ from that classically observed in clinical isolates, which shows the importance in accessing environmental microorganisms in the attempt to reveal new mechanisms to antibiotic resistance, which may enrich the knowledge on their ecological roles and aid biotechnological researches, such as in antimicrobial bioprospection and in bioremediation processes.