Cette thèse traite de la résistance du VIH-1 aux antirétroviraux, en particulier de l'activité antivirale de plusieurs inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI) ainsi que des inhibiteurs de protéase (IP). Nous avons exploré l’émergence et la spécificité des voies de mutations qui confèrent la résistance contre plusieurs nouveaux INNTI (étravirine (ETR) et rilpivirine (RPV)) (chapitres 2 et 3). En outre, le profil de résistance et le potentiel antirétroviral d'un nouvel IP, PL-100, est présenté dans les chapitres 4 et 5. Pour le premier projet, nous avons utilisé des sous-types B et non-B du VIH-1 pour sélectionner des virus résistants à ETR, et ainsi montré que ETR favorise l’émergence des mutations V90I, K101Q, E138K, V179D/E/F, Y181C, V189I, G190E, H221H/Y et M230L, et ce, en 18 semaines. Fait intéressant, E138K a été la première mutation à émerger dans la plupart des cas. Les clones viraux contenant E138K ont montré un faible niveau de résistance phénotypique à ETR (3,8 fois) et une diminution modeste de la capacité de réplication (2 fois) par rapport au virus de type sauvage. Nous avons également examiné les profils de résistance à ETR et RPV dans les virus contenant des mutations de résistance aux INNTI au début de la sélection. Dans le cas du virus de type sauvage et du virus contenant la mutation unique K103N, les premières mutations à apparaître en présence d’ETR ou de RPV ont été E138K ou E138G suivies d’autres mutations de résistance aux INNTI. À l’inverse, dans les mêmes conditions, le virus avec la mutation Y181C a évolué pour produire les mutations V179I/F ou A62V/A, mais pas E138K/G. L'ajout de mutations à la position 138 en présence de Y181C n'augmente pas les niveaux de résistance à ETR ou RPV. Nous avons également observé que la combinaison de Y181C et E138K peut conduire à un virus moins adapté par rapport au virus contenant uniquement Y181C. Sur la base de ces résultats, nous suggérons que les mutations Y181C et E138K peuvent être antagonistes. L’analyse de la résistance au PL-100 des virus de sous-type C et CRF01_AE dans les cellules en culture est décrite dans le chapitre 4. Le PL-100 sélectionne pour des mutations de résistance utilisant deux voies distinctes, l'une avec les mutations V82A et L90M et l'autre avec T80I, suivi de l’addition des mutations M46I/L, I54M, K55R, L76F, P81S et I85V. Une accumulation d'au moins trois mutations dans le rabat protéique et dans le site actif est requise dans chaque cas pour qu’un haut niveau de résistance soit atteint, ce qui démontre que le PL-100 dispose d'une barrière génétique élevée contre le développement de la résistance. Dans le chapitre 5, nous avons évalué le potentiel du PL-100 en tant qu’inhibiteur de protéase de deuxième génération. Les virus résistants au PL-100 émergent en 8-48 semaines alors qu’aucune mutation n’apparaît avec le darunavir (DRV) sur une période de 40 semaines. La modélisation moléculaire montre que la haute barrière génétique du DRV est due à de multiples interactions avec la protéase dont des liaison hydrogènes entre les groupes di-tétrahydrofuranne (THF) et les atomes d'oxygène des acides aminés A28, D29 et D30, tandis que la liaison de PL-100 est principalement basée sur des interactions polaires et hydrophobes délocalisées à travers ses groupes diphényle. Nos données suggèrent que les contacts de liaison hydrogène et le groupe di-THF dans le DRV, ainsi que le caractère hydrophobe du PL-100, contribuent à la liaison à la protéase ainsi qu’à la haute barrière génétique contre la résistance et que la refonte de la structure de PL-100 pour inclure un groupe di-THF pourrait améliorer l’activité antivirale et le profil de résistance. / This thesis focuses on HIV-1 drug resistance and on the antiviral activity of several non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) and protease inhibitors (PIs). We have explored the mutational pathways and resistance patterns of several new NNRTIs (etravirine (ETR) and rilpivirine (RPV)) (Chapters 2 and 3). In addition, the drug resistance profile and potential of a novel protease inhibitor (PI) PL-100 is presented in Chapters 4 and 5. In the first project, we used both B and non-B subtypes of HIV-1 to select for ETR resistance and showed that ETR selected for mutations at positions V90I, K101Q, E138K, V179D/E/F, Y181C, V189I, G190E, H221H/Y and M230L within 18 weeks of commencing drug pressure. Interestingly, E138K was the first mutation to emerge in most instances. Viral clones containing E138K displayed low-level phenotypic resistance to ETR (3.8-fold) and modestly impaired replication capacity (2-fold) compared to wild-type virus. We also examined resistance patterns to ETR and RPV in viruses containing NNRTI mutations at baseline. In wild-type (wt) viruses and viruses containing K103N alone, E138K or E138G mutations were observed in the presence of either ETR or RPV drug pressure followed by the appearance of other NNRTI resistance mutations. Alternatively, subtype B viruses containing Y181C generated V179I/F or A62V/A on exposure to ETR or RPV drug pressure, respectively, but not E138K. The addition of mutations at position 138 to Y181C did not significantly enhance levels of resistance to ETR or RPV. We also observed that the combination of Y181C and E138K may lead to a less fit virus compared to virus containing Y181C alone. Based on these findings, we suggest that Y181C may be antagonistic to E138K. The tissue culture drug resistance analysis of PL-100 in subtype C and CRF01_AE viruses is described in Chapter 4. PL-100 selected for PI resistance mutations along either of two distinct pathways, one of which involved resistance mutations at positions V82A and L90M while the other involved a mutation at position T80I, with other mutations being observed at positions M46I/L, I54M, K55R, L76F, P81S and I85V. An accumulation of at least three mutations in the protease flap and enzyme active sites were required in each case for high-level resistance to occur, demonstrating that PL-100 has a high genetic barrier against the development of drug resistance. In Chapter 5, we evaluated the potential of PL-100 as a second generation HIV-1 protease inhibitor. PL-100 resistant variants emerged within 8-48 weeks while darunavir (DRV) did not select for resistance mutations over a period of 40 weeks. Structural modeling demonstrated that the high genetic barrier of DRV is due to numerous interactions with protease that include hydrogen-bonding to PR backbone oxygens at amino acid positions A28, D29 and D30 via di-tetrahydrofuran (THF) groups, while binding of PL-100 was predominantly based on polar interactions and delocalized hydrophobic interactions through its diphenyl groups. Our data suggest that hydrogen bonding contacts and the di-THF group in DRV, as well as the hydrophobic nature of PL-100, contribute to PI binding and a high genetic barrier for resistance and that redesigning the structure of PL-100 to include a di-THF group might improve it antiviral potency and drug resistance profile.

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Dans le monde entier, les infections virales causent des problèmes de santé majeurs et récurrents, engendrant de sérieux problèmes socio-économiques. Notamment, les virus de la famille Flaviviridae qui représentent un fardeau considérable sur la santé mondiale et font partie des domaines prioritaires de la virologie médicale selon le rapport 2016 du ‘Global Virus Network’. Bien que le traitement actuel contre le virus de l’hépatite C (VHC) ait un taux de guérison dépassant 98%, d’autres comme le virus de la dengue (DENV) et le virus zika (ZIKV) n’ont pas encore de traitement spécifique autorisé. En prenant avantage de la grande expertise de notre laboratoire dans l’étude du VHC, nous avons utilisé des données d’une étude de biologie des systèmes visant à identifier l’interactome des différentes protéines virales. Les techniques utilisées ont combiné l’immunoprécipitation des protéines virales suivie de l’identification des protéines interacteurs humaines par spectrométrie de masse. Des études de génomique fonctionnelle par ARN interférent (ARNi) ont permis d’étudier l’effet de la diminution de l’expression des protéines identifiées sur la réplication du VHC. Cette étude a conduit à la découverte de l’interactant spécifique 17-bêta-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 12 (HSD17B12 ou DHB12) de la protéine virale Core comme facteur cellulaire requis à la réplication du VHC. HSD17B12 est une enzyme cellulaire dont l’activité catalytique est requise pour l’élongation des acides gras à très longue chaîne (VLCFA) lors de la deuxième des quatre réactions du cycle d’élongation. Dans cette étude, nous avons déterminé que les cycles de réplication du VHC, ZIKV et DENV dépendent de l’expression et de l’activité métabolique du facteur cellulaire HSD17B12. Ainsi, nous avons étudié les effets de l’inhibition de l’expression génique par ARNi et de façon pharmacologique sur la réplication de plusieurs flavivirus dans une approche antivirale à large spectre. Nous avons démontré que le silençage de HSD17B12 diminue significativement la réplication virale, l’expression des protéines virales et la production de particules infectieuses de cellules Huh7.5 infectées par la souche JFH1 du VHC. L'analyse de la localisation cellulaire de HSD17B12 dans des ii cellules infectées suggère une colocalisation avec l'ARN double brin (ARNdb) aux sites de réplication virale, ainsi qu’avec la protéine Core (et les gouttelettes lipidiques) aux des sites d’assemblage du virus. Nous avons également observé que le silençage de HSD17B12 réduit considérablement le nombre et la taille des gouttelettes lipidiques. En accord avec ces données, la diminution de l’expression de HSD17B12 par ARNi réduit significativement l’acide oléique et les espèces lipidiques telles que triglycérides et phosphatidyl-éthanolamine dans l'extrait cellulaire total. Ces travaux suggèrent une contribution de la capacité métabolique de HSD17B12 lors de la réplication du VHC. De même, nous avons démontré que le silençage de HSD17B12 réduit significativement les particules infectieuses de cellules infectées par DENV et ZIKV. Ces études supportent le rôle de HSD17B12 dans l’efficacité des processus de la réplication de l'ARN viral et de l’assemblage de particules virales. De plus, l'inhibiteur spécifique de HSD17B12, INH-12, réduit la réplication du VHC à des concentrations pour lesquelles aucune cytotoxicité notable n'est observée. Le traitement avec 20 μM d'INH-12 réduit jusqu'à 1,000 fois les particules infectieuses produite par des cellules Huh-7.5 infectées par DENV et ZIKV lors de plusieurs cycles de réplication, et bloque complètement l'expression des protéines virales. En conclusion, ces travaux ont conduit à une meilleure compréhension du rôle de HSD17B12 lors de la synthèse de VLCFA et de lipides requise à la réplication du VHC, permettant d’explorer l’inhibition de HSD17B12 et de l’élongation d’acides gras à très longue chaîne comme nouvelle approche thérapeutique pour le traitement à large spectre des infections par les virus de la famille Flaviviridae. / Infections with viruses are major recurrent socio-economical and health problems worldwide. These include infections by viruses of the Flaviviridae family, which present a substantial global health burden and are among the priority areas of medical virology according to the Global Virus Network 2016 report. While the current treatment regimens for hepatitis C virus (HCV) infection have cure rates of more than 98%, other important members of Flaviviridae like dengue virus (DENV) and zika virus (ZIKV) have no specific licensed treatments. By taking advantage of the most-studied HCV, which our lab has developed a vast expertise in the last 20 years, we used proteomics data of an HCV interactome study, combining viral protein immunoprecipitation (IP) coupled to tandem mass spectrometry identification (IP-MS/MS) and functional genomics RNAi screening. The study uncovered the 17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 12 (HSD17B12, also named DHB12), as a specific host interactor of core that promotes HCV replication. HSD17B12 catalytic activity is involved in the synthesis of very-long-chain fatty acids (VLCFA) upon the second step of the elongation cycle. In this study, taking HCV as a virus model, we elucidated the dependency of HCV, dengue virus (DENV) and zika virus (ZIKV) replication on expression and metabolic capacity of the host factor HSD17B12. We investigated the effects of the inhibition of gene expression by RNAi and of its pharmacological enzymatic inhibition on flavivirus replication in a broad-spectrum antiviral approach. We showed that silencing expression of HSD17B12 decreases viral replication, viral proteins and iv infectious particle production of the JFH1 strain of HCV in Huh7.5 cells. The cellular localization analysis of HSD17B12 showed a co-staining with double-stranded RNA (dsRNA) at viral replication sites and with core protein (and lipid droplets) at virus assembly sites. Furthermore, HSD17B12 gene silencing drastically reduced the number and size of lipid droplets. In association, the reduced expression of HSD17B12 by RNAi decreases oleic acid levels and lipids such as triglycerides (TG) and phosphatidylethanolamine (PE) in whole-cell extract. The data suggested the requirement of the metabolic capacity of HSD17B12 for HCV replication. Similarly, we provide evidence that HSD17B12 silencing significantly reduces DENV and ZIKV infectious particles. The studies support a role of HSD17B12 for effective viral RNA replication and particle assembly processes. Moreover, the specific HSD17B12 inhibitor, INH-12, reduces HCV replication at concentrations for which no appreciable cytotoxicity is observed. The treatment of DENV- and ZIKV-infected Huh- 7.5 cells with 20 μM of INH-12 dramatically reduces production of infectious particles by up to 3-log10 in infection assays, and completely block viral protein expression. In conclusion, these studies extends our understanding of the role of HSD17B12 in VLCFA synthesis required for the replication of HCV, allowing to explore the inhibition of HSD17B12 and elongation of VLCFA as a novel therapeutic approach for the treatment of a broad-spectrum of viruses of the Flaviviridae family.

Les infections virales en particulier celles dues aux virus de la famille des Herpesviridae pendant la période d’aplasie et de lymphopénie à la suite d’une greffe de cellules souches hématopoïétiques (GCSH) peuvent occasionner des complications très graves, souvent associées à une morbidité et mortalité élevées. Les recommandations cliniques actuelles préconisent l’utilisation des antiviraux pour la prévention de certaines de ces infections. L’efficacité du famciclovir et de l’acyclovir contre les virus de l’herpès simplex (HSV), le virus varicella-zoster (VZV) et l’herpésvirus humain de type 6 (HHV-6) est bien reconnue, cependant il nous manque des données quant à leur effet contre le virus Epstein-Barr (EBV) et le cytomégalovirus (CMV) dans la population pédiatrique. L’objectif principal de ce projet de maitrise a été de mesurer l’incidence de l’infection aux virus HSV, VZV, EBV, CMV et HHV-6 et de mesurer l’association entre l’utilisation de la prophylaxie antivirale (acyclovir et famciclovir) et l’infection (virémie asymptomatique et maladie) avec le CMV et l’EBV dans une cohorte pédiatrique de GCSH allogéniques. Les données d'une cohorte de sujets ayant subis pour la première fois une GCSH enrôlés dans quatre centres de greffes pédiatriques au Canada entre juillet 2013 et mars 2017 (Étude TREASuRE) ont été utilisées. Le recrutement a été effectué au : CHU Sainte-Justine (Montréal) (n=86), British Columbia Children’s Hospital (Vancouver) (n=31), Winnipeg Children's Hospital and CancerCare Manitoba (n=28) et Alberta Children’s Hospital (n=11). Le suivi des patients avait débuté 1 mois avant la greffe et avait duré 13 mois. L’âge médian des patients au recrutement était de 6,3 ans. Les courbes de Kaplan-Meier ont permis d’estimer l'incidence cumulée des infections CMV et EBV avec intervalle de confiance (IC) à 95% à 100 jours post-greffe en fonction de la prophylaxie antivirale (acyclovir ou famciclovir). Les modèles multivariés de régression de Cox à risques proportionnels ont permis de mesurer l'association entre la prise d’antiviraux (acyclovir ou famciclovir) et le développement de ces infections. L’étude a inclus 156 sujets âgés de 0 à 21 ans. Les incidences cumulées de la virémie des virus de HSV, VZV, EBV, CMV et HHV-6 à 100 jours de suivi ont été respectivement de 2.5% (IC 95% : 0.8–7.6), 0.8% (IC 95% : 0.1–6.1), 34.5% (IC 95% : 27.6–42.6), 19.9% (IC 95% : 14.5-27.1) et 3.4% (IC 95% : 1.2–9.1). Les incidences cumulées pour CMV et EBV n’ont pas montré de différence statistiquement significative entre les groupes ayant reçu la prophylaxie antivirale (acyclovir ou famciclovir) et ceux qui ne l’ont pas reçu. Les analyses de Cox n’ont montré aucun effet significatif des antiviraux sur le CMV avec un HR ajusté de 0.55 (IC 95% : 0.24–1.26) pour l’acyclovir et de 0.82 (IC 95% : 0.30–2.29) pour le famciclovir. Il en était de même pour l’EBV avec un HR ajusté de 1.41 (IC 95% : 0.63–3.14) pour l’acyclovir et de 0.79 (IC 95% : 0.36–1.72) pour le famciclovir. Notre étude n’a montré aucune preuve d’effet de la prophylaxie antivirale avec le famciclovir et l’acyclovir contre l’EBV et le CMV. Très peu de cas de HSV et de VZV ont été diagnostiqués dans cette cohorte ce qui est conforme avec l’idée selon laquelle l’acyclovir et le famciclovir sont efficaces pour ces virus. / Viral infections, especially those involving members of the Herpesviridae during the period of aplasia and lymphopenia following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), cause very serious complications, often associated with high morbidity and mortality. Current clinical guidelines recommend prophylactic use of antivirals, which has proven to be effective against certain viruses. The efficacy of famciclovir and acyclovir against herpes simplex viruses (HSV), varicella zoster virus (VZV) and human herpesvirus type 6 (HHV-6) is well-recognized, however, we lack data on their effects against Epstein-Barr virus (EBV) and cytomegalovirus (CMV) in the pediatric population. The main objective of this master's project was to measure the incidence of herpes virus infection, specifically by HSV, VZV, EBV, CMV and HHV-6, and to measure the association between the use of antiviral prophylaxis (acyclovir and famciclovir) and infection (including both asymptomatic viremia and disease) by CMV and EBV in a pediatric cohort of allogeneic HSCT. We used data from the TREASuRE cohort, which includes patients enrolled for a first allogeneic HSCT in four pediatric centers in Canada between July 2013 and March 2017. Recruitment was carried out at: CHU Sainte-Justine (Montreal) (n = 86), British Columbia Children's Hospital (Vancouver) (n = 31), Winnipeg Children's Hospital and CancerCare Manitoba (n = 28) and Alberta Children's Hospital (n = 11). Patient follow-up began 1 month before transplant and lasted 13 months. Median patient age at recruitment was 6.3 years. Kaplan-Meier curves were used to estimate the cumulative incidence of CMV and EBV infections with 95% confidence interval (CI) at 100 days post-transplant according to antiviral prophylaxis (acyclovir or famciclovir). Multivariate proportional hazards Cox regression models were used to measure the association between antiviral use (acyclovir or famciclovir) and the detection of these infections. The study included 156 subjects aged 0 to 21 years. The cumulative incidences of viremia due to HSV, VZV, EBV, CMV and HHV-6 at day 100 of follow-up were respectively 2.5% (CI 95%: 0.8–7.6), 0.8% (CI 95%: 0.1-6.1), 34.5% (CI 95%: 27.6-42.6), 19.9% (CI 95%: 14.5-27.1) and 3.4% (95% CI: 1.2-9.1). The cumulative incidences for CMV and EBV did not show a statistically significant difference between the groups who received antiviral prophylaxis (acyclovir or famciclovir) and those who did not. Cox analyses showed no significant effect of antivirals on CMV with an adjusted HR of 0.55 (95% CI: 0.24–1.26) for acyclovir and 0.82 (95% CI: 0.30–2.29) for famciclovir. The same was true for EBV with an adjusted HR of 1.41 (95% CI: 0.63–3.14) for acyclovir and 0.79 (95% CI: 0.36–1.72) for famciclovir. Our study showed no evidence of an effect with use of famciclovir or acyclovir prophylaxis on EBV and CMV infections. Very few cases of HSV and VZV infections were diagnosed in this cohort, which is consistent with the idea that acyclovir and famciclovir are effective against the latter viruses.