The genome of hepatitis B virus (HBV) can be assessed by sequence analysis of HBV DNA in serum. In most chronic HBV infected patients treated with potent nucleos(t)ide analogues (NAs) this approach however is limited by the fast decrease of serum HBV DNA during NA treatment. In contrast, HBV RNA was shown to persist in serum of some HBV infected individuals receiving NA treatment. In this study, we established the sequencing of serum HBV RNA as a method for the monitoring of HBV variants during NA treatment after the decrease of serum HBV DNA to undetectable levels. Using this approach, we studied the evolution of HBV variants in follow-up serum samples (n=156) of 25 patients treated with the potent polymerase inhibitor tenofovir (TDF) as second or third-line treatment. In our cohort, specific reverse transcribed full-length and truncated HBV RNA remained detectable with real-time PCR for long periods in most serum samples, also after the decline of HBV DNA during treatment with TDF. The HBV genome could be analyzed based on serum HBV DNA sequencing in 61 serum samples for a mean duration of 6.0 ± 4.5 (0 – 13) months. After this, sequencing of reverse transcribed serum HBV RNA allowed the analysis of the HBV genome for an additional mean duration of 33.9 ± 12.7 (16 - 65) months in 68 serum samples. The comparison of serum HBV DNA and serum HBV RNA derived sequences showed a high homology. In most patients, acquired HBV resistance variants in the reverse transcriptase (rt) region of the polymerase gene were detectable on HBV DNA and HBV RNA basis. Serum HBV RNA sequencing further revealed a long persistence of these variants during TDF treatment (mean duration of 26.5 ± 15.8 (0 – 50) months), which indicates a high conservation in the cccDNA of the infected individuals. Also HBV stop mutations in the small surface (s) gene, which were discussed in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma (HCC), were present at baseline in 5 patients and remained detectable on HBV RNA basis during follow-up. In this study, we demonstrated that sequencing of reverse transcribed HBV RNA from patient serum is a suitable method to assess HBV variants during NA treatment. We further provided insights into the evolution of HBV variants during strong suppression of the viral replication with the polymerase inhibitor TDF. Future studies should investigate more comprehensively the clinical application of the here presented method of serum HBV RNA sequencing for the early detection of resistant HBV variants during NA treatment and the observation of HBV s gene variants related to HCC development.:Table of content I Table of content 3 II Abbreviations 6 1 Introduction 10 1.1 HBV 11 1.1.1 Classification 11 1.1.2 HBV virion structure and genomic organization 11 1.1.3 HBV proteins 12 1.1.4 HBV replication cycle 15 1.2 Chronic HBV infection 17 1.2.1 Epidemiology 17 1.2.2 Natural course of chronic HBV infection 17 1.3 Treatment of chronic HBV infection with nucleos(t)ide analogues 18 1.3.1 Nucleos(t)ide analogues 18 1.3.2 Treatment goals 18 1.3.3 Response to nucleos(t)ide analogue treatment 20 1.3.4 Treatment with nucleos(t)ide analogues and liver disease 21 1.4 Evolution of HBV variants during antiviral treatment 22 1.4.1 HBV resistance mutations in the pol gene 22 1.4.2 Resistance rates to treatment with nucleos(t)ide analogues 25 1.4.3 HBV variants in the s gene 26 1.5 HBV RNA in serum of chronically infected patients 29 1.5.1 HBV RNA molecules 29 1.5.2 HBV RNA packaging and release 29 1.5.3 HBV RNA as serum marker 31 1.6 Aim of the study 31 2 Materials and methods 33 2.1 Materials 33 2.1.1 Chemicals 33 2.1.2 Devices 33 2.1.3 Laboratory materials 34 2.1.4 Cycler 34 2.1.5 Kits 35 2.1.6 Buffers and solutions 36 2.1.7 Primers 36 2.1.8 Data analysis 39 2.2 Methods 39 2.2.1 Patient set and sample selection 39 2.2.2 Extraction of nucleic acids from serum samples 40 2.2.3 Reverse transcription of HBV RNA 40 2.2.4 Quantification of HBV serum DNA and HBV RNA by real-time PCR 41 2.2.4.1 Real-time PCR 41 2.2.4.2 Quantification of serum HBV DNA 43 2.2.4.3 Quantification of serum HBV trRNA and HBV flRNA 45 2.2.5 Sequencing of serum HBV DNA and HBV RNA 47 2.2.5.1 Primer design 47 2.2.5.2 Amplification by PCR 48 2.2.5.3 Purification of amplification products 50 2.2.5.4 Sanger sequencing of PCR fragments 51 2.2.6 Quantification of serum HBsAg and HBeAg 53 2.2.7 Cloning of HBV variants 53 2.2.8 Data analysis 55 2.2.8.1 Serum HBV DNA and HBV RNA quantities 55 2.2.8.2 Analysis of HBV DNA and HBV RNA sequences 55 3 Results 59 3.1 Composition of the patient set 59 3.2 Quantification of HBV DNA and HBV RNA in serum samples 59 3.2.1 Quantitative courses of serum HBV DNA 60 3.2.2 Quantitative courses of serum HBV flRNA and HBV trRNA 61 3.3 Sequencing of HBV DNA and HBV RNA 64 3.3.1 Method 64 3.3.2 Follow-up with sequencing of HBV DNA and HBV RNA 67 3.3.3 Genotyping of baseline samples 67 3.4 Evolution of HBV variants in the rt region 68 3.4.1 HBV resistance mutations in the rt region at baseline 68 3.4.2 HBV resistance mutations in the rt region during antiviral treatment 70 3.5 HBV variants in the s gene 77 3.5.1 HBV s gene variants at baseline 77 3.5.2 HBV s gene variants during antiviral treatment 80 4 Discussion 82 4.1 Patient cohort 82 4.2 Quantification of serum HBV DNA, HBV flRNA and HBV trRNA 82 4.3 Quantitative courses of serum HBV DNA, HBV flRNA and HBV trRNA 83 4.4 Sequencing of serum HBV RNA as novel method for HBV genome analysis 85 4.5 Evolution of HBV variants in the rt region 89 4.6 Evolution of HBV stop mutations in the s gene 91 4.7 Conclusion 92 III Summary 94 IV References 96 V List of Figures 104 VI List of Tables 105 VII Supplement 106 VIII Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 107 IX Curriculum Vitae 108 X Publications 110 XI Acknowledgment 114

Codirecteur de recherche: Dr Sylvain Meloche / Durant ces quatre dernières années, le champ de recherche concernant l’immunité innée a grandement été influencé par la découverte des IKK-related kinases, TBK1 et IKKi, deux kinases régulant l’activité des facteurs de transcription IRF-3/IRF-7 et NF-κB. Les kinases TBK1 and IKKi furent notamment démontrées comme étant responsables de la phosphorylation en C-terminal de IRF-3. Toutefois, l’identité des sites phosphoaccepteurs ciblés par ces kinases restait un sujet de controverse. En combinant la spectrométrie de masse aux essais de phosphorylation in vitro de His-IRF-3 par la kinase recombinante TBK1, nous démontrons que les sérines 396 et 402 sont directement phosphorylées par cette kinase. Nos analyses biochimiques révèlent également que la mutation S396A, localisée dans le cluster II, abolit l’homodimérisation, l’association à CBP et l’accumulation nucléaire de IRF-3. De façon intéressante, la mutation de la sérine 339, impliquée dans la stabilité de IRF-3, provoque également une perte d’association à CBP et de la dimérisation du facteur de transcription sans toutefois affecter la transactivation des gènes antiviraux en autant que la sérine 396 soit disponible pour accepter un événement de phosphorylation. Nos expériences de complémentation de MEFs IRF-3 KO révèlent la présence d’un mécanisme compensatoire impliquant la sérine 339 et la sérine 396 dans l’induction des IFN-stimulated genes (ISGs), ISG56 and ISG54. Globalement, les données présentées dans cette étude nous ont permis de reconsidérer le modèle d’activation du facteur de transcription IRF-3 actuellement proposé et d’y ajouter certaines subtilités. TRAF3 est également un médiateur central impliqué dans l’induction de la réponse interféron de type I. Cette fois, en couplant la spectrométrie de masse à la technique de purification protéique par affinité, nous avons identifié Sec16A et p115, deux protéines du système de transport vésiculaire ER-Golgi , comme étant des nouveaux partenaires protéiques de Flag-TRAF3. Nos expériences démontrent la localisation cellulaire de TRAF3 au niveau du système de transport vésiculaire. De plus, la diminution des niveaux d’expression de p115 ou Sec16A provoque une redistribution cellulaire de TRAF3 et affecte la réponse interféron suivant une stimulation par de l’ARN double brin. Nos résultats démontrent également une colocalisation de TRAF3 et TRADD au niveau du cis-Golgi ainsi qu’une interaction avec la protéine du translocon Sec61β médiée par l’intermédiaire de Sec5. De façon générale, nos données suggèrent que la localisation cellulaire de TRAF3 au niveau des compartiments de transport vésiculaire est requise afin d’obtenir une réponse antiviral optimale par la voie de signalisation cellulaire associée aux RIG-I-like RNA helicases, RIG-I et MDA5. Nos données appuient également le rôle potentiel précédemment suggéré de l’exocyste dans l’établissement d’une réponse antivirale. / Over the past four years, the field of the innate immune response has been highly influenced by the discovery of the IκB kinase (IKK)-related kinases, TBK1 and IKKi, which regulate the activity of IRF-3/IRF-7 and NF-κB transcription factors. The IKK-related kinases, TBK1 and IKKi, were recently shown to be responsible for the C-terminal phosphorylation of IRF-3. However, the identity of the phosphoacceptor site(s) targeted by these two kinases remains unclear. By combining mass spectrometry analysis to in vitro kinase assays using full length His-IRF3 as a substrate, we have demonstrated that serine 402 and serine 396 were directly targeted by TBK1. Analysis of Ser/Thr to Ala mutants revealed that S396A mutation, located in cluster II, abolished IRF-3 homodimerization, CBP association and nuclear accumulation. Interestingly, mutation of serine 339, which is involved in IRF-3 stability, also abrogated CBP association and dimerization without affecting gene transactivation as long as serine 396 remained available for phosphorylation. Complementation of MEFs IRF-3 KO also reveals a compensatory mechanism of serine 339 and serine 396 in the ability of IRF-3 to induce IFN-stimulated genes (ISGs) ISG56 and ISG54 expression. These data lead us to reconsider the current model of IRF-3 activation. TRAF3 is also a central mediator that is important for inducing type I interferon production in response to intracellular double-stranded RNA. By combining Flag-Affinity purification using Flag-TRAF3 as a bait to mass spectrometry, we have identified Sec16A and p115, two proteins of the ER-to-Golgi vesicular transport system, as novel TRAF3 interactors. We found that TRAF3 localizes to the ER-to-Golgi vesicular pathway and behaves like a cis-Golgi protein. Depletion of p115 or Sec16A disrupts the cis-Golgi cellular localization of TRAF3 and affects type I Interferon response following double-stranded RNA treatment. Furthermore, we demonstrate that TRAF3 colocalizes with TRADD at the cis-Golgi and also interacts with the translocon protein Sec61β in a Sec5 dependent manner. Together, our data suggest that the cellular localization of TRAF3 to the ER-to-Golgi transport compartments is required for an optimal RIG-I-like Helicases (RLH)-Cardif-dependent antiviral immune response. Our findings also highlight the potential role of the exocyst in the innate immune response.

Les LT CD8 mémoires constituent une population hétérogène. Une modulation des différents signaux d’activation des LT CD8 naïfs influe sur la diversité des LT CD8 effecteurs et mémoires générés. A coté des sous populations classiquement décrites de LT CD8 mémoires développés dans des conditions infectieuses, il existe une population de LT CD8 mémoires générés dans des conditions d’inflammation stérile, c’est-à-dire en absence de pathogènes et de signaux moléculaires dérivés de pathogènes : les TIM pour « T-inflammatory memory cells ». Au cours de cette thèse j’ai eu pour objectif : 1) de mieux caractériser la population de TIM 2) d’évaluer leur capacité à répondre à une activation par un pathogène viral et ainsi leur plasticité et 3) d’étudier leur recrutement au site d’une infection locale respiratoire.J’ai ainsi pu identifier de nouvelles propriétés des TIM et montrer que les TIM sont recrutés dans une réponse secondaire à un virus exprimant la même spécificité antigénique, en générant des LT CD8 mémoires secondaires aux fonctions améliorées. De plus, les LT CD8 mémoires secondaires générés présentent un avantage fonctionnel par rapport aux LT CD8 mémoires primaires dans leur capacité de production de TNF-α et de la chimiokine XCL1. Cette dernière propriété pourrait leur conférer un avantage pour la réponse à des antigènes cross présentés. J’ai par ailleurs montré la capacité des TIM à être recrutés au niveau du poumon et des voies aériennes au cours d’une infection respiratoire virale. Ces résultats montrent que les LT CD8 mémoires générés dans des conditions d’activation inflammatoires stériles peuvent prendre part au contingent de cellules immunitaires impliquées dans des réponses à des infections. Ces résultats ouvrent un champ d’investigation intéressant concernant la plasticité des LT CD8 mémoires. Ils pourraient avoir une incidence sur certaines pathologies inflammatoires, dans le cas d’une ré-activation des TIM par un virus cross réactif. / Memory CD8 T cells represent a heterogeneous population. A modulation of the activation signals during naïve CD8 T cells activation influences the diversity of the Effector and Memory CD8 T cells generated. Besides the classically described subsets of Memory CD8 T cells, generated under infectious conditions, are T inflammatory memory CD8 T cells (TIM). TIM are generated under sterile priming conditions that are devoid of pathogens and pathogen-derived danger signals.During this thesis, I had the latter objectives: 1) a better characterisation of TIM, 2) to evaluate whether they could be recruited in an immune response directed against a virus and thus investigate their plasticity, 3) to examine their recruitment to the site of a respiratory local infection.I have identified new features of TIM and shown that TIM can take part to the immune response triggered by a virus expressing their cognate antigen and further differentiate into secondary memory cells with improved functions. The secondary memory CD8 T cells they generate display a functional advantage over primary memory cells in their capacity to produce TNF-α and the XCL1 chemokine. This last result could give them an advantage against cross-presented antigen. Furthermore, I have shown that TIM cells can be recruited in lung and airways during a respiratory viral infection. These results show that memory CD8 T cells generated under sterile priming conditions can take part to the contingent of immune cells involved in responses to infection. They open an interesting field of investigation of the plasticity of memory CD8 T cells. They could have an impact in inflammatory diseases, in the case of re-activation of TIM by a cross-reactive virus.

L’immunité innée représente la première ligne de défense d’un organisme face à une infection virale, en engendrant une réponse rapide capable de restreindre la menace microbienne. Dans la cellule, les récepteurs Toll-likes (TLRs) et les hélicases cytosoliques RIG-I like (RLRs) représentent les deux systèmes majeurs de reconnaissance des virus. Les acides nucléiques viraux sont notamment reconnus les hélicases cytosoliques RIG-I et MDA5. Ces deux protéines possèdent deux domaines CARD impliqués dans le recrutement de la protéine adaptatrice MAVS, capable d’induire l’activation des promoteurs interférons (IFNs) de type I et de NF-B pour la mise en place d’une réponse antivirale. De façon surprenante, MAVS est localisée au niveau de la mitochondrie et a besoin de cette association au compartiment mitochondrial pour exercer sa fonction. Bien que de nombreuses études aient montré le rôle crucial de la protéine mitochondriale MAVS dans la signalisation antivirale des RLRs, sa régulation est encore mal connue à ce jour. Ce travail de doctorat a permis de mettre en évidence que la dégradation de MAVS suite à une infection virale est nécessaire à la transduction du signal antiviral. Nous avons ainsi déterminé que l’E3 ubiquitine ligase TRIM25 induit l’ubiquitination puis la dégradation de MAVS quelques heures après une infection virale. De plus, nous avons montré que l’activation du signalosome aboutissant à la production des IFNs de type I et dépendant de MAVS n’a lieu que suite à sa translocation de la mitochondrie vers le cytosol permise par la dégradation de MAVS. Enfin, nous avons mis en évidence le rôle essentiel de l’élongation du réseau mitochondrial suite à une infection virale pour la transduction du signal dépendant de MAVS. / Innate Immunity acts as the first line of the host defense against viral infection, providing a rapid response to restrict the microbial threats. Toll-like receptors (TLRs) and cytosolic RIG-I-like helicases (RLRs) are the two major receptor systems for detecting virus. Viral nucleic acids are recognised by the helicases RIG-I and MDA5. These receptors contain two CARD domains involve in the recruitment of the mitochondrial antiviral signaling adaptor MAVS whose activation triggers a rapid production of type 1 interferons (IFNs) and of pro-inflammatory cytokines. Interestingly, it has been reported that MAVS must be localized to mitochondria to exert its function. While MAVS is essential for this signaling, its function and regulation remain unclear. In this work, we report that RLR activation triggers MAVS ubiquitination by the E3 ubiquitin ligase TRIM25 and marks it for proteasomal degradation concomitantly with downstream signaling. MAVS appears to function as a recruitment platform to first assemble a signaling complex, then the proteasome-mediated MAVS degradation is required to unleash into the cytosol this signaling complex allowing the signalosome activation and ensuing type I IFNs production. Futhermore, we reported that mitochondrial dynamics regulate MAVS-mediated signaling after viral infection.

Durant ces quatre dernières années, le champ de recherche concernant l’immunité innée a grandement été influencé par la découverte des IKK-related kinases, TBK1 et IKKi, deux kinases régulant l’activité des facteurs de transcription IRF-3/IRF-7 et NF-κB. Les kinases TBK1 and IKKi furent notamment démontrées comme étant responsables de la phosphorylation en C-terminal de IRF-3. Toutefois, l’identité des sites phosphoaccepteurs ciblés par ces kinases restait un sujet de controverse. En combinant la spectrométrie de masse aux essais de phosphorylation in vitro de His-IRF-3 par la kinase recombinante TBK1, nous démontrons que les sérines 396 et 402 sont directement phosphorylées par cette kinase. Nos analyses biochimiques révèlent également que la mutation S396A, localisée dans le cluster II, abolit l’homodimérisation, l’association à CBP et l’accumulation nucléaire de IRF-3. De façon intéressante, la mutation de la sérine 339, impliquée dans la stabilité de IRF-3, provoque également une perte d’association à CBP et de la dimérisation du facteur de transcription sans toutefois affecter la transactivation des gènes antiviraux en autant que la sérine 396 soit disponible pour accepter un événement de phosphorylation. Nos expériences de complémentation de MEFs IRF-3 KO révèlent la présence d’un mécanisme compensatoire impliquant la sérine 339 et la sérine 396 dans l’induction des IFN-stimulated genes (ISGs), ISG56 and ISG54. Globalement, les données présentées dans cette étude nous ont permis de reconsidérer le modèle d’activation du facteur de transcription IRF-3 actuellement proposé et d’y ajouter certaines subtilités. TRAF3 est également un médiateur central impliqué dans l’induction de la réponse interféron de type I. Cette fois, en couplant la spectrométrie de masse à la technique de purification protéique par affinité, nous avons identifié Sec16A et p115, deux protéines du système de transport vésiculaire ER-Golgi , comme étant des nouveaux partenaires protéiques de Flag-TRAF3. Nos expériences démontrent la localisation cellulaire de TRAF3 au niveau du système de transport vésiculaire. De plus, la diminution des niveaux d’expression de p115 ou Sec16A provoque une redistribution cellulaire de TRAF3 et affecte la réponse interféron suivant une stimulation par de l’ARN double brin. Nos résultats démontrent également une colocalisation de TRAF3 et TRADD au niveau du cis-Golgi ainsi qu’une interaction avec la protéine du translocon Sec61β médiée par l’intermédiaire de Sec5. De façon générale, nos données suggèrent que la localisation cellulaire de TRAF3 au niveau des compartiments de transport vésiculaire est requise afin d’obtenir une réponse antiviral optimale par la voie de signalisation cellulaire associée aux RIG-I-like RNA helicases, RIG-I et MDA5. Nos données appuient également le rôle potentiel précédemment suggéré de l’exocyste dans l’établissement d’une réponse antivirale. / Over the past four years, the field of the innate immune response has been highly influenced by the discovery of the IκB kinase (IKK)-related kinases, TBK1 and IKKi, which regulate the activity of IRF-3/IRF-7 and NF-κB transcription factors. The IKK-related kinases, TBK1 and IKKi, were recently shown to be responsible for the C-terminal phosphorylation of IRF-3. However, the identity of the phosphoacceptor site(s) targeted by these two kinases remains unclear. By combining mass spectrometry analysis to in vitro kinase assays using full length His-IRF3 as a substrate, we have demonstrated that serine 402 and serine 396 were directly targeted by TBK1. Analysis of Ser/Thr to Ala mutants revealed that S396A mutation, located in cluster II, abolished IRF-3 homodimerization, CBP association and nuclear accumulation. Interestingly, mutation of serine 339, which is involved in IRF-3 stability, also abrogated CBP association and dimerization without affecting gene transactivation as long as serine 396 remained available for phosphorylation. Complementation of MEFs IRF-3 KO also reveals a compensatory mechanism of serine 339 and serine 396 in the ability of IRF-3 to induce IFN-stimulated genes (ISGs) ISG56 and ISG54 expression. These data lead us to reconsider the current model of IRF-3 activation. TRAF3 is also a central mediator that is important for inducing type I interferon production in response to intracellular double-stranded RNA. By combining Flag-Affinity purification using Flag-TRAF3 as a bait to mass spectrometry, we have identified Sec16A and p115, two proteins of the ER-to-Golgi vesicular transport system, as novel TRAF3 interactors. We found that TRAF3 localizes to the ER-to-Golgi vesicular pathway and behaves like a cis-Golgi protein. Depletion of p115 or Sec16A disrupts the cis-Golgi cellular localization of TRAF3 and affects type I Interferon response following double-stranded RNA treatment. Furthermore, we demonstrate that TRAF3 colocalizes with TRADD at the cis-Golgi and also interacts with the translocon protein Sec61β in a Sec5 dependent manner. Together, our data suggest that the cellular localization of TRAF3 to the ER-to-Golgi transport compartments is required for an optimal RIG-I-like Helicases (RLH)-Cardif-dependent antiviral immune response. Our findings also highlight the potential role of the exocyst in the innate immune response. / Codirecteur de recherche: Dr Sylvain Meloche

Le risque de LH est augmenté en cas de déficit immunitaire acquis ou inné. Les déficits immunitaires innés associés à un risque accru de LH, sont les DICV (Déficit Immunitaire Commun Variable), XLP (Syndrome lymphoprolifératif lié au chromosome X) et ALPS (Syndrome lymphoprolifératif Autoimmun). L'objectif de notre travail était d'évaluer la prévalence de ces déficits immunitaires chez des enfants atteints de LH. Nous avons reçu, 395 prélèvements de patients atteints de LH au diagnostic. L'âge médian de la population étudiée est de 13 ans, allant de 3 à 18 ans. Le sex-ratio M/F est de 1.1. Il augmente à 3 au dessous de l'âge de 10 ans. Parmi les biopsies (n=84) qui ont été relues, 87% sont de type scléro-nodulaires (SN), 7% à cellularité mixte (CM) et 6% non spécifié. L'EBV est détecté in situ dans 23% des cas de LH. Les patients atteints de LH-EBV+ sont significativement plus jeunes que ceux atteints de LH-EBV- (p=3.10-4). Ce sont plus fréquemment des garçons que des filles (63% ; M/F : 1,7) et fréquemment de sous-type CM (40%). Enfin, ils ont une charge virale EBV significativement plus élevée (p=3.10-3) que les enfants qui ont un LH-EBV-.Parmi les 83 premiers enfants analysés, un immunophénotypage approfondi a montré une diminution de la population lymphocytaire par rapport aux témoins et une lymphopénie B fréquente (31 patients sur 83 soit 37% des patients). La lymphopénie B était corrélée aux facteurs pronostiques connus du LH. Dans un cas parmi les 31, une baisse des immunoglobulines a été mise en évidence ce qui est évocateur de DICV. Nous avons montré que dans les autres cas, les lymphopénies se corrigeaient à distance de la maladie. La recherche de profil cytokinique associé à ces lymphopénies (TGF, BAFF, IL-7) n'a pas permis de mettre en évidence de mécanisme physiopathologique simple pour expliquer ces lymphopénies. Nous émettons l'hypothèse qu'elles sont liées à l'exposition au contact des cellules tumorales à des signaux favorisant l'apopotose.En ce qui concerne la recherche d'autres déficits immunitaires innés, aucun cas évocateur de XLP n'a été mis en évidence sur la base de la quantification des lymphocytes NKT. Cinq cas parmi les 83 (6%) avaient une expansion de lymphocytes T DN (Lymphocytes TCRαβ CD4-CD8-) dans le sang périphérique. Des dosages de Fas ligand et d'IL-10 plasmatiques ont permis d'exclure un ALPS. Au total, nous n'avons pas pu affirmer de défaut qualitatif des sous-populations lymphocytaires évoquant les déficits immunitaires de type XLP et ALPS. Seule une lymphopénie B avec baisse des IgG est évocatrice de DICV. Nous avons étendu l'analyse à l'ensemble des patients (395patients) avec un contrôle à distance du diagnostic pour ceux qui étaient anormaux. Nous avons identifié 4 patients potentiellement atteints de DICV, 1,5%. Parallèlement, nous avons recherché un déficit de la réponse T anti-EBV par cytomètrie de flux et l'Elispot. L'étude de la réponse T anti-EBV par la cytométrie de flux, a montré une tendance vers une baisse de la production d'IL-2 par les CD4 et les CD8 de patients avec une charge virale EBV élevée en réponse à une stimulation par des peptides EBV en présence de lignées autologues. L'étude de la réponse T anti EBV par la technique d'ELISPOT sur 9 patients n'a pas montré globalement de déficit du contrôle de l'EBV sauf pour une jeune patiente de 10 ans ayant une charge virale EBV très élevée sans réponse T anti-EBV efficace. Les résultats que nous avons obtenus restent à approfondir, ce qui permettra d'enrichir les connaissances actuelles sur cette pathologie.

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie chronique multifactorielle. Les infections entérovirales, en particulier à Coxsackievirus du groupe B (CVB), et notamment CVB4, transmises par voie digestive, constituent le facteur de risque le plus souvent évoqué dans la littérature. Plusieurs mécanismes physiopathologiques sont proposés pour expliquer cette relation entre CVB4 et diabète de type 1. Il s'agit, entre autres, du tropisme préférentiel de CVB4 pour les ilots et les cellules β pancréatiques et l'inflammation qui s'ensuit, de la persistance du virus au niveau des cellules infectées qui pourrait constituer un facteur déterminant dans le processus d'altération des cellules endocrines, de l'exacerbation possible de l'infection par des d'anticorps facilitateurs ou encore du mimétisme moléculaire entre les auto-antigènes et les antigènes viraux. Par ailleurs des auteurs ont montré que la cause de la déplétion des cellules β chez des souris infectées par la souche diabétogénique CVB4E2 est un défaut de régénération plutôt qu'une destruction directe de ces cellules par le virus. La présence de constituants entéroviraux dans les cellules ductales du pancréas de patients diabétiques a été observée. Le diabète de type 1, qui serait l'expression finale d'un long processus, survient généralement chez des sujets jeunes, c'est pourquoi l'hypothèse que le tissu pancréatique jeune serait plus permissif aux infections à CVB4 n'est pas exclue. La prévention des infections virales reste le meilleur moyen de protéger les individus contre les maladies qu'elles provoquent. Un intérêt particulier est aujourd'hui accordé à la mise en évidences et à la caractérisation d'inhibiteurs antiviraux à large spectre. L'absence d'allaitement maternel est associé à un risque plus élevé de diabète de type 1, mais la nature du ou des facteurs du lait conférant une protection est mal connue, et l'activité anti-CVB4 du lait maternel n'a pas été étudiée jusqu'à présent. Objectifs : Nous avons émis l'hypothèse que CVB4 pouvait infecter des cellules humaines précurseurs de cellules endocrines, impliquées dans la régénération des îlots. L'infection de ces cellules par CVB4E2 et ses conséquences ont été étudiées ; nous avons utilisé des cellules humaines précurseurs canalaires primitives et la lignée continue de cellules Panc-1, dont la différenciation in vitro est possible. La permissivité au CVB4 du tissu pancréatique selon l'âge a été étudiée ex vivo chez le rat et l'existence d'inhibiteurs antiviraux à large spectre est notamment explorée dans l'intestin de souris. L'activité anti-CVB4 du lait maternel susceptible de protéger, à un âge critique, le jeune enfant vis-à-vis d'un virus diabétogène a été étudiée in vitro et l'hypothèse que le lait humain pourrait prévenir le déclenchement du DT1 chez la souris NOD a également été évaluée in vivo.

Chez les insectes, la voie des petits ARNs interférants (siARN) joue un rôle majeur dans la réponse antivirale. Ces dernières années, il a été montré que les petits ARNs interagissant avec les protéines PIWI (piARNs) sont impliqués dans la défense des moustiques face aux infections arbovirales. Le but de mon travail de thèse fut de caractériser l'implication de la voie des piARNs dans la réponse antivirale de la Drosophila melanogaster, utilisée ici comme un organisme modèle. Dans un premier temps, j’ai demontré qu’à la suite d’une infection virale, la survie et le titre viral chez les drosophiles mutées pour les protéines Piwi, Aubergine, Argonaute-3 et Zucchini, ne présente aucune différence avec les données observées pour les drosophiles sauvages. Ensuite, via l’utilisation de virus provoquant une infection aigue, persistante ou se transmettant de manière verticale par les cellules germinales, j’ai montré l’absence de production de piARNs viraux durant l’infection chez les drosophiles adultes. Finalement, l’utilisation de mes données de séquencage m’a permis d’observer la production de piARNs dérivant d’un gène codant une protéine impliquée dans la réponse antivirale. Suggérant ainsi un rôle hypothétique des piARNs dans la régulation de l’immunité de l’hôte durant l’infection virale.Mes travaux visent à améliorer la compréhension de la réponse immunitaire antivirale chez l’insecte. Je montre que la fonction antivirale de la voie des piARN dépend plus de la biologie de l’hôte et du virus que de la réponse antivirale en elle-même. / In insects, the small interfering RNA (siRNA) pathway is the major antiviral response. In recent years, the piwi-interacting RNA (piRNA) pathway has been also implicated in antiviral defense in mosquitoes infected with arboviruses. The aim of my thesis was to characterize the involvement of the piRNA pathway in antiviral defense in Drosophila melanogaster. I first showed that following virus infection, the survival and viral titers of Piwi, Aubergine, Argonaute-3, and Zucchini mutant flies were similar to those of wild type flies. Then, by studying an array of viruses that infect the fruit fly acutely or persistently or are vertically transmitted through the germ line, I showed that no viral piRNAs are produced during infection in adult Drosophila melanogaster. Finally, using the next generation sequencing data generated during viral infections, I showed the presence of piRNAs derived from protein coding gene and suggested their potential role in regulating the immune status of the host during viral infection.This work improves the current understanding of the antiviral response in insects. It shows that, in contrast to what was observed in mosquitoes, the piRNA pathway is not directly implicated in antiviral defence in adult Drosphila melanogaster and that viral piRNAs production depends on the biology of the host–virus combination rather than being part of a general antiviral process.

Ces travaux de thèse CIFRE, réalisés au sein du Laboratoire de Biotechnologie et Chimie Marines de l’Université de Bretagne-Sud et du Groupe Olmix, s’inscrivent dans le cadre d’un projet national de valorisation de biomasses d’algues vertes, le projet ULVANS. Ce projet est le fruit d’une collaboration entre cinq industriels bretons et deux laboratoires universitaires. Les objectifs de ces travaux de thèse concernent i) la caractérisation approfondie de la matière première, en particulier des polysaccharides matriciels solubles (ulvanes) et des protéines, ii) la mise au point d’un procédé d’extraction assistée par enzymes des métabolites algaux, iii) la caractérisation biochimique et moléculaire des hydrolysats enzymatiques, avec pour objectif la compréhension de l’effet des enzymes commerciales sur les algues, iv) l’évaluation des activités antioxydantes et antivirales des hydrolysats, v) l’étude de l’influence des paramètres d’hydrolyse en vue de déterminer les conditions optimales pour l’extraction des métabolites d’intérêt et enfin vi) de conclure, à partir des éléments fournis par l’étude, sur la viabilité d’un tel procédé à l’échelle industrielle. En conclusion de ces travaux, l’hydrolyse enzymatique apparait comme un procédé intéressant pour le bioraffinage des algues vertes. Bien que les préparations enzymatiques commerciales utilisées ne soient pas spécifiques des composés algaux, les protéases ont conduit à une augmentation significative des rendements d’extraction, alors que l’effet des carbohydrases reste modéré. L’étude de l’influence des paramètres d’hydrolyses a confirmé les résultats préliminaires et montré que la température, la concentration d’enzyme et la méthode de broyage présentaient peu d’effets sur les activités des protéases testées. Un résultat majeur de cette étude aura été la mise en évidence d’activités anti-herpétiques dans les hydrolysats. La caractérisation des fractions actives a montré que les activités étaient liées à la présence de protéines ou glycoprotéines dans les extraits. Ce résultat présente un intérêt majeur car à l’heure actuelle, a priori, aucune activité de ce type n’a été identifiée chez Ulva sp. / This PhD Thesis works, conducted in the Laboratoire de Biotechnologie et Chimie Marines of the Université de Bretagne-Sud and in the Olmix Group, was included in a national project for the upgrading of green seaweed biomasses, the Ulvans project. This project results in the collaboration of five industrial companies and two academic research laboratories. The objectives of this thesis works had been i) the characterization of the raw material, particularly the soluble matrix polysaccharides (ulvans) and proteins, ii) the development of an enzyme-assisted extraction process of algal metabolites, iii) the biochemical and molecular characterization of the enzymatic hydrolyzates, with the aim of understanding the effect of enzymes on algae thallus, iv) the screening of antioxidant and antiviral activities of hydrolyzates, v) the study of the influence of hydrolysis parameters to determine the optimum conditions for the extraction of metabolites of interest and finally vi) to conclude, according to the results provided by this study, on the viability of the industrial upscaling of the process. In conclusion of this work, enzymatic hydrolysis appeared to be an effective process for biorefinery of green seaweeds. Although commercial enzymatic preparations were not specific of algal compounds, protéases led to a significant increase in the extraction yields, whereas the effect of carbohydrases were moderate. The study of hydrolysis parameters confirmed the preliminary results and showed that the temperature, the concentration of enzyme and the grinding method had no effect on the protease used. A major result of this study has been the highlighting of anti-oxidant and anti-herpetic compounds in hydrolyzates. The antiviral activity of ulvans had several times been demonstrated but the biochemical characterization of actives fractions showed that the activity could be associated to proteins or glycoproteins. This result is very interesting because, a priori, any antiviral activity has also been related to this type of compounds in Ulva sp.

L'interféron de type I (IFN) est une famille de cytokine avec des propriétés antivirales et immunomodulatrices. Alors que les effets antiviraux de l'IFN sont bien caractérisés, leurs propriétés immunomodulatrices le sont moins. Nous avons examiné en profondeur les effets de l'IFN de type I sur le développement, l'homéostasie, et la fonction des cellules Treg. Nous avons utilisé des souris chimériques reconstituées avec une mixture de moelle osseuse de souris normale (WT) et de souris sans le récepteur de l'IFN(IFNAR)KO, et des souris femelles hétérozygotes exprimant une délétion d'IFNAR spécifiquement sur les Treg. Dans ces deux modèles, la signalisation d'IFNAR favorise le développement de la lignée Treg dans le thymus et leur survie dans la périphérie. Nous avons également généré des souris chimériques en utilisant le foie f¿tal de souris scurfy, les Treg dérivés de IFNAR KO ont été incapables de contrôler l'activation des cellules T effectrices et l'inflammation des tissus. Nous avons aussi examiné les effets pendant l'infection avec le virus chorioméningite lymphocytaire chronique (LCMV). Nous avons démontré que le pourcentage de V?5+ Treg était significativement réduit chez les souris IFNAR KO. Nous avons également examiné l'effet pendant Encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Suite à l'induction de l'EAE, les souris chimériques WT/IFNAR KO développent une maladie plus sévère que les souris WT/WT. Nous montrons aussi que les souris avec une délétion conditionnelle de IFNAR dans les Tregs développent une forme très grave de l'EAE. Ces résultats démontrent que la signalisation via IFNAR est nécessaire pour la fonction de suppressive des Treg dans l'EAE. / Type I Interferons (IFNs) are a family of cytokines with antiviral and immunomodulatory properties. While the antiviral effects of IFNs are well characterized, their immunomodulatory properties are less clear. We examined the effects of type I IFN on development, homeostasis, and function of Treg cells. We used mixed bone marrow (BM) chimeras between WT and IFNαβ receptor (IFNAR) KO mice, and heterozygous female mice expressing a Treg-specific deletion of the IFNAR. IFNAR signaling promoted the development of the Treg lineage in the thymus and their survival in the periphery. IFNAR KO Treg from chimeric mice displayed a more naïve phenotype. In mixed chimeras with Scurfy fetal liver, Treg derived from IFNAR KO BM were unable to control T effector cell activation and tissue inflammation. We also examined the potential effects during Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus infection. We demonstrated that the percentage of Vβ5+ Treg was significantly reduced in IFNAR KO mice, and that the IFNAR functions in a Treg cell intrinsic manner. We also studied the effect during Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Following induction of EAE, WT / IFNAR KO chimeras develop more severe disease than the WT/WT chimeras. Mice with a conditional deletion of the IFNAR in Treg rapidly developed a very severe form of EAE. These results demonstrate that signaling via the IFNAR is required for Treg suppressor function in EAE. Collectively, these studies demonstrate that under certain condition including stress, chronic infection, and autoimmune disease, IFNAR signaling is essential to maintain Treg development, homeostasis, and function.