Les histidine kinases (HKs) représentent une vaste famille de protéines impliquées dans la perception des signaux environnementaux chez les bactéries, les champignons et les plantes. Ces protéines joueraient notamment un rôle majeur dans l’adaptation aux stresses, mais aussi dans la virulence de nombreux micro-organismes procaryotes et eucaryotes. Si les HKs sont à présent bien connues chez les bactéries et les plantes, tant sur un plan structural que fonctionnel, les connaissances concernant ces protéines chez les autres clades de l’arbre du vivant demeurent plus que fragmentaires. C’est ainsi que le premier objectif de ce travail a consisté en l’exploration in silico de la structure et de la distribution des HKs chez les organismes eucaryotes dans le cadre de plusieurs études bioinformatiques : i) chez les champignons inférieurs, ii)chez les levures bourgeonnantes et enfin iii) à travers l’ensemble des super-groupes eucaryotes. Les HKs n’étant pas retrouvées chez les mammifères, elles suscitent depuis quelques années une attention particulière de la communauté scientifique en tant que nouvelles cibles pour le développement d’antimicrobiens. C’est précisément dans ce contexte que la partie expérimentale de ce projet a été initiée au sein du GEIHP. Cette équipe porte en effet ses efforts sur le filamenteux multi-résistant Scedosporium apiospermum qui se situe au second rang parmi les moisissures capables de coloniser chroniquement les poumons des patients atteints de mucoviscidose. Ainsi, dans l’optique d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques du champignon, la seconde partie de ce projet s’est focalisée sur la caractérisation fonctionnelle des HKs chez Scedosporium apiospermum. En parallèle, cette étude nous a également amenés à développer de nouveaux outils moléculaires adaptés à S.apiospermum en vue de futures études d’imageries de fluorescence et de bioluminescence. / Histidine kinases (HKs) represent a broad family of proteins involved in the perception of environmental signals in bacteria, fungi and plants.These proteins play a major role in stress adaptation, but also in the virulence of many prokaryotic and eukaryotic microorganisms. Although HKs are now well known in bacteria and plants, both structurally and functionally, knowledge about these proteins in other clades of the living tree remains more than fragmentary. Thus the first objective of this work was the in silico exploration of the structure and distribution of HKs in eukaryotic organisms through several bioinformatics studies : i) in the lower fungi, ii)in budding yeasts, and finally iii) across all eukaryotic supergroups. Since HKs are not found in mammals, they have been attracting attention in recent years from the scientific community as new targets for the development of antimicrobials. It is precisely in this context that the experimental part of this project was initiated in the GHEIHP. This team is focusing on the multi-resistant filamentous Scedosporiumapiospermum, which ranks second among the molds capable of chronycally conolizing the lungs of cysticfibrosis patients. Thus, in order to identify new therapeutic targets of the fungus, the second part of this project focused on the functional characterization of HKs in S. apiospermum. In parallel, this study also led us to develop new molecular tools adapted to S. apiospermum for future studies of fluorescence or bioluminescence imaging.

Les espèces du complexe Scedosporium apiospermum sont des agents pathogènes émergents qui se situent au deuxième rang parmi les champignons filamenteux rencontrés au cours de la mucoviscidose. Ils sont omniprésents et particulièrement rencontrés dans les zones polluées. En dépit de leur importance clinique, nos connaissances sur leur biologie moléculaire et leur physiologie restent limitées. Chez les champignons, la paroi constitue un bouclier protecteur face à des conditions environnementales défavorables, et joue un rôle essentiel dans la pathogénicité. Ici, nous avons étudié les changements dynamiques de la paroi des conidies de S. boydii, l’une des deux espèces majeures de ce complexe avec S. apiospermum, avec pour objectif d'identifier des facteurs de virulence potentiels. En utilisant une large variété de techniques, allant de la microscopie électronique à balayage ou à transmission à l’analyse protéomique des protéines à ancre glycosylphosphatidylinositol (GPI) en passant par la microélectrophorèse et la partition de phase, la cytométrie en flux, la microscopie de force atomique, la résonance paramagnétique électronique, ou encore des techniques moléculaires, nous avons mis en évidence diverses modifications qui se produisent dans la paroi pendant la maturation et la germination des conidies de S. boydii et nous avons identifié la DHN-mélanine ainsi qu'un nombre important de protéines à ancre GPI. Enfin, nous avons fourni la première séquence complète du génome de S. apiospermum qui appuierait les différents domaines de la recherche sur ces champignons que ce soit pour l’étude des mécanismes pathogènes ou pour des applications biotechnologiques. / Species of the Scedosporium apiospermum complex are emerging human pathogens which rank the second, after Aspergillus fumigatus, among the filamentous fungi colonizing the airways of patients with cystic fibrosis. These fungi are ubiquitous in nature and particularly encountered in polluted areas. Despite their clinical relevance, our knowledge about their molecular biology and physiology remains rather limited. In fungi, the cell wall forms a protective shield against adverse environmental conditions, and therefore plays a key role in pathogenesis, which makes it an interesting target for antifungal drug development. Here, in an attempt to identify potential virulence factors, we investigated the dynamic changes of the cell wall of conidia in S. boydii, one of the main pathogenic species within this species complex with Scedosporium apiospermum. Using various techniques, ranging from scanning and transmission electron microscopy to proteomic analysis of glycosylphosphatidylinositol (GPI)- anchored proteins, through two-phase partitioning and microelectrophoresis, atomic force microscopy and chemical force spectroscopy, flow 5 cytometry, electron paramagnetic resonance and molecular techniques, we highlighted various modifications occurring in the cell wall during maturation and germination of S. boydii and we identified DHN-melanin as well as a substantial number of GPI-anchored proteins in the cell wall. Finally, we provided the first publicly available genome sequence of S. apiospermum that would support various research fields on these fungi whether for understanding their pathogenic mechanisms or for various biotechnological applications.

Scedosporium apiospermum, pathogène émergent, colonise les voies respiratoires des patients mucoviscidosiques et provoque des infections sévères chez les patients immunodéprimés. Afin d'améliorer notre connaissance sur sa pathogénicité, nous avons étudié sa production en sidérophores. Après une production maximale en milieu de culture liquide déplété en fer et à pH alcalin, les sidérophores ont été récupérés du filtrat de culture par extraction liquide/liquide, et analysés par CLHP en phase inverse. Deux sidérophores, l'acide dimérumique (DMA) et le N-méthyl coprogène B (MCB), ont été identifiés grâce à de la spectrométrie de masse MSn par ionisation par électro-nébulisation. La comparaison des différentes souches fongiques a montré une production importante de MCB pour les isolats cliniques d'origine respiratoire. Après optimisation du protocole d'extraction, de nouveaux sidérophores ont été identifiés à partir d'autres champignons impliqués dans la mucoviscidose. Seul le MCB était présent chez S. apiospermum, constituant ainsi un marqueur de ce champignon. Ainsi, la détection de ce sidérophore dans les expectorations de malades atteints de mucoviscidose pourrait constituer une méthode de diagnostic des infections à S. apiospermum. Dans le but d'étudier plus précisément les mécanismes d'acquisition du fer par S. apiospermum, la synthèse du DMA et du MCB a été entreprise. Ces molécules contiennent respectivement deux à trois monomères de base, la fusarinine. C'est donc la synthèse de la de la fusarinine qui a été effectuée avec un rendement global de 2% en mettant en jeu une synthèse convergente à partir de l'ornithine protégée et du but-3-yn-1-ol.

Le complexe Pseudallescheria boydii / Scedosporium apiospermum se situe au deuxième rang des champignons filamenteux isolés des expectorations de patients atteints de mucoviscidose, maladie génétique la plus fréquente dans la population caucasienne et dont le pronostic est étroitement lié à l'atteinte respiratoire. La distribution des cinq espèces constituant ce complexe a été étudiée au sein d'une cohorte de patients français atteints de mucoviscidose. Nos résultats suggèrent que P. boydii est l'espèce prédominante (62%), suivie de S. apiospermum (24%), Scedosporium aurantiacum (10%) et Pseudallescheria minutispora (4%). Nous avons également démontré la capacité de ces deux dernières espèces à coloniser de manière chronique les voies respiratoires de ces patients. Les niches naturelles et les réservoirs de ces espèces constituant des sources potentielles de contamination humaine ont ensuite été étudiées dans la région Pays-dela- Loire. Les densités les plus importantes de ces espèces ont été retrouvées dans les zones impactées par les activités humaines. Scedosporium dehoogii est l'espèce la plus abondante ; S. aurantiacum, P. boydii et S. apiospermum ont été principalement retrouvées dans les zones agricoles, les plages et les aires de jeux, respectivement. Les techniques de PCR étant plus rapides et plus sensibles que les méthodes culturales et permettant une semi-quantification, nous avons enfin développé une méthode moléculaire pour la détection et la quantification du complexe P. boydii / S. apiospermum. Cependant, une optimisation de l'étape d'extraction d'ADN génomique est nécessaire pour permettre l'application de cette méthode à des échantillons de sol.

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Foram selecionados, aleatoriamente, 12 fungos para serem reativados em placas de Petri contendo meio BDA. Após a reativação, foram obtidos os micro-extratos dos 12 fungos conforme a metodologia adaptada de Smedsgaar. Os micro-extratos foram avaliados por CLAE-DAD para determinação do perfil cromatográfico e, também, submetidos a ensaios antimicrobianos. O fungo FSF12 (Trichoderma sp.), selecionado após a triagem do perfil químico e biológica foi cultivado em escala ampliada em meio sólido (arroz) e levou ao isolamento de cinco substâncias: ácido graxo poliinsaturado (E1), 5’-inosil (E2), tirosol (E3), harzialactona A (E4) e 2-anidromevalônico (E5). Já em relação ao fungo EJCP13 (S. apiospermum), foram isolados os compostos triacil (J1), peróxido de ergosterol (J2), ergosterol (JA19), cerivisterol (JA29) e éster metílico (JA24), dulcitol (D) e Brefeldina A (JA). O composto brefeldina A apresentou importante atividade antimicrobiana e, também, mostrou ser o metabolito secundário majoritário nos extratos de S. apiospermum. Assim, resolveu-se quantificar essa substância nos extratos, o que corroboraram com os resultados, indicando a presença da brefeldina A somente nos extratos AcOEt e hexânico. O isolamento das substâncias foi realizado através de técnicas cromatográficas, como CCVU e, monitoramento, por CCDA. As estruturas químicas foram elucidadas com auxílio de técnicas espectroscópicas (RMN de 1H e 13C, HMQC, HMBC) e espectrométrica (ESI-MS). / Endophytic fungi are microorganisms that lives in association with the host species, and they're a promising source of important natural products. With a equal importance, the soil fungi also are capable of producing so many substances of economic value. Thus, the following work was objective to obtain bioactive composts produced by endophytic fungi M. acutistipula var. ferrea and soil Carajás Saw, besides the endophytic S. apiospermium from liana of Bauhinia guianensis Auble. The species M. acutistipula var. ferrea, were isolated 56 endophytic and 64 soil fungi. They were randomly, selected, 12 fungi to be reactivated in Petri dishes containing PDA medium. After reactivating the micro-extracts of 12 fungi were obtained as the adapted methodology Smedsgaar. The micro-extracts were evaluated by HPLC-DAD to determine the chromatographic profile and, also, submitted antimicrobial testing. The FSF 12 (trichoderma sp.), selected after the screening of chemical and biological profile was grown on a large scale in a solid medium (rice) and led to the isolation of five substances: fatty acid polyunsaturated (E1), 5'-inosil (E2), tyrosol (E3), harzialactone A (E4) and 2-anhydro mevalonic (E5). In relation to the fungus EJCP13 (S. apiospermium) where compounds isolated, triacyl (J1), ergosterol peroxide (J2), ergosterol (JA19), cerivisterol (JA29), methylester (JA24), dulcitol (D), and brefeldin A (JA). The compound Brefeldin A showed significant antimicrobial activity and, also, proved to be the major secondary metabolite in extracts from S. apiospermium. Thus, it decides to quantify a substance in the extract, which corroborate results, which indicate the presence of brefeldin A only in AcOEt and the hexane extracts. The isolation of the substances was performed by chromatographic techniques, such as CCVU and, monitoring, by ADCC. The chemical structures were elucidated with the aid of spectroscopic (1H and 13C NMR, HMQC, HMBC), and spectrometric (ESI-MS).