Les procédés de bioraffinerie, et notamment les agrocarburants, sont aujourd'hui reconnus comme essentiels pour sortir de l'économie actuelle basée sur le pétrole. Dans le cas du bioéthanol produit à partir de biomasse lignocellulosique, l'hydrolyse enzymatique par les enzymes de Trichoderma reesei est le principal point faible du procédé et doit être améliorée. Ces travaux de thèse s'intègrent dans le cadre du projet Futurol, et ont pour objectif d'identifier de nouvelles enzymes capables d'améliorer l'activité de T. reesei sur la lignocellulose. Une analyse post-génomique réalisée sur les secrétomes de vingt souches fongiques s'est révélée particulièrement prometteuse pour l'identification d'enzymes lignocellulolytiques d'intérêt. Une approche de génomique comparative a également abouti à la sélection de deux endo-mannanases de famille GH5 et GH26 chez le champignon Podospora anserina. Ces hémicellulases ont permis d'améliorer significativement la libération de glucose par T. reesei à partir d'épicéa. Une étude fondamentale approfondie a permis de résoudre les structures cristallographiques et de mettre en évidence les relations entre les spécificités enzymatiques de chaque enzyme et leurs caractéristiques structurales. La structure tridimensionnelle de la mannanase GH26 couplée à son CBM35 présente un linker court et rigide et une organisation du site actif atypique. Les deux mannanases ont également fait l'objet d'un travail d'ingénierie aléatoire qui a abouti à des variants des deux enzymes présentant une amélioration de l'efficacité catalytique et/ou une modification de spécificité. / Biorefineries such as biofuels are nowadays considered as essential to reduce our dependence on oil products. In the production process of bioethanol from lignocellulosic biomass, enzymatic hydrolysis performed by Trichoderma reesei enzymes is the main bottleneck of the process and requires improvements.The present work is part of the Futurol project, and aims at identifying new enzymes to improve the activity of T. reesei toward lignocellulose. Post-genomic analyses on twenty fungal strains have revealed the potential of this approach to identify lignocellulolytic enzymes of interest. Comparative genomics also led to the selection of two endo-mannanases from families GH5 and GH26 from the fungus Podospora anserina. These hemicellulases significantly improved glucose release upon T. reesei hydrolysis of spruce. An in-depth fondamental study allowed the solving of cristallographic structures and revealed the relationships between enzymatic specificities and structural characteristics. The structure of GH26 catalytic module appended to CBM35 highlighted a short and rigid linker and an atypical active site organization. The two mannanases were subjected to molecular engineering. Variants displaying improved catalytic efficiency and/or modified specificity were identified for both enzymes.

Les espèces du complexe Scedosporium apiospermum sont des agents pathogènes émergents qui se situent au deuxième rang parmi les champignons filamenteux rencontrés au cours de la mucoviscidose. Ils sont omniprésents et particulièrement rencontrés dans les zones polluées. En dépit de leur importance clinique, nos connaissances sur leur biologie moléculaire et leur physiologie restent limitées. Chez les champignons, la paroi constitue un bouclier protecteur face à des conditions environnementales défavorables, et joue un rôle essentiel dans la pathogénicité. Ici, nous avons étudié les changements dynamiques de la paroi des conidies de S. boydii, l’une des deux espèces majeures de ce complexe avec S. apiospermum, avec pour objectif d'identifier des facteurs de virulence potentiels. En utilisant une large variété de techniques, allant de la microscopie électronique à balayage ou à transmission à l’analyse protéomique des protéines à ancre glycosylphosphatidylinositol (GPI) en passant par la microélectrophorèse et la partition de phase, la cytométrie en flux, la microscopie de force atomique, la résonance paramagnétique électronique, ou encore des techniques moléculaires, nous avons mis en évidence diverses modifications qui se produisent dans la paroi pendant la maturation et la germination des conidies de S. boydii et nous avons identifié la DHN-mélanine ainsi qu'un nombre important de protéines à ancre GPI. Enfin, nous avons fourni la première séquence complète du génome de S. apiospermum qui appuierait les différents domaines de la recherche sur ces champignons que ce soit pour l’étude des mécanismes pathogènes ou pour des applications biotechnologiques. / Species of the Scedosporium apiospermum complex are emerging human pathogens which rank the second, after Aspergillus fumigatus, among the filamentous fungi colonizing the airways of patients with cystic fibrosis. These fungi are ubiquitous in nature and particularly encountered in polluted areas. Despite their clinical relevance, our knowledge about their molecular biology and physiology remains rather limited. In fungi, the cell wall forms a protective shield against adverse environmental conditions, and therefore plays a key role in pathogenesis, which makes it an interesting target for antifungal drug development. Here, in an attempt to identify potential virulence factors, we investigated the dynamic changes of the cell wall of conidia in S. boydii, one of the main pathogenic species within this species complex with Scedosporium apiospermum. Using various techniques, ranging from scanning and transmission electron microscopy to proteomic analysis of glycosylphosphatidylinositol (GPI)- anchored proteins, through two-phase partitioning and microelectrophoresis, atomic force microscopy and chemical force spectroscopy, flow 5 cytometry, electron paramagnetic resonance and molecular techniques, we highlighted various modifications occurring in the cell wall during maturation and germination of S. boydii and we identified DHN-melanin as well as a substantial number of GPI-anchored proteins in the cell wall. Finally, we provided the first publicly available genome sequence of S. apiospermum that would support various research fields on these fungi whether for understanding their pathogenic mechanisms or for various biotechnological applications.

L’avènement de la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF a révolutionné la microbiologie en permettant l’identification précise des bactéries et des levures en seulement quelques minutes. En 2010, la MALDI-TOF SM n’était pas applicable à l’identification des champignons filamenteux. Un protocole d’identification générant des spectres interprétables de champignons filamenteux fut d’abord mis au point, suivi par le développement d’une architecture de banque originale. Enfin une banque de références solides, intégrant des références pour la majorité des espèces de moisissures impliquées en pathologie humaine, fut créée en collaboration avec le BCCM/IHEM. Les qualités d’identification de cette banque ont été démontrées non seulement à l’échelle localemais également à l’échelle nationale . Dans un second temps, nous sommes intéressés à l’identification des levures. Nous avons déterminé qu’une extraction complète est le meilleur protocole d’identification des levures en utilisant la banque de référence Bruker ™. Afin d’améliorer le diagnostic clinique,nous avons testé un protocole d’identification sur un séries de 6192 levures isolées de prélèvements cliniques reçus au laboratoire pendant un an. Enfin nous avons pu démontrer en utilisant nos « systèmes » d’identification par MALDI-TOF MS la sous-estimation de la diversité des espèces de moisissures et de levures isolées des prélèvements cliniques, lorsqu’on ne disposait que de techniques conventionnelles d’identification. La mise à disposition d’un tel outil ouvre de grandes perspectives dans le domaine de la mycologie, tant d’un point de vue épidémiologique que clinique. / During the last decade, MALDI-TOF MS has revolutionized microbiology by enabling the accurate identification of bacteria and yeast in only few minutes1. At the beginning of this work in 2010, MALDI-TOF MS was not yet optimized for mold identification. To meet this need, we established an identification protocol to generate interpretable mold spectra. The structure of the reference database was developed taking intoaccount the heterogeneity of molds in culture. Finally, a comprehensive reference database,including references for the majority of molds encountered in human pathology, was created in collaboration with the BCCM/IHEM. Identification performance of this database was tested and validated at both a local scale and an international scale . We also determined the best-adapted pre-treatment protocol to identify yeasts in a routine setting. The protocol was tested on a panel of 6192 yeast isolates recovered from clinical samples submitted to our laboratory over the course of one year. Using our fungal identification system, we were able to identify morphologically similar species and highlight the underestimation of fungal pathogen diversity. The development of our MALDI-TOF MS-based fungal identification system presents numerous opportunities in the field of mycological, from both an epidemiological and clinical point of view. In subsequent studies, defining the clinical meaning of emerging species identified via MALDI-TOF MS will profoundly modify our perspective of fungal diseases.

Cette étude a pour objectif la mise en évidence, chez les basidiomycetes du genre Pycnoporus, de nouvelles oxydo-réductases impliquées dasn la dégradation de la biomasse végétale: de l'expression des gènes aux applications biotechnologiques. Les champs d'application visés concernent essentiellement le domaine de la chimie verte, dans le cadre du projet européen BIORENEW. Le travail s'est articulé autour de trois axes principaux. Le premier a concerné l'exploration de la biodiversité naturelle en particulier tropicale, pour la sélection de souches productrices de nouvelles laccases de haut potentiel d'oxydo-réduction. Le gène codant pour la laccase Lac1 chez Pycnoporus a été utilisé comme marqueur moléculaire d'identification et de relation phylogénie-fonction, mettant en évidence une distribution des souches fortement corrélée avec leur écozone. Le deuxième axe a porté sur l'isolement de trois nouvelles laccases issues de P.sanguineus et P. coccineus qui exhibent des caractéristiques biochimiques complémentaires: haute thermostabilité, résistance aux solvants, au pH, constantes catalytiques et potentiels rédox élevés. Ces enzymes constituent de bons modèles pour des applications en biotechnologies blanches:décoloration de colorants polyphénoliques, oxydation de composés modèles de type lignine non-phénolique, oligomérisation de flavonoides naturels adaptés aux applications cosmétiques et pharmaceutiques. Enfin, dans le cadre de l'annotation du génome des souches monocaryotiques P. cinnabarinus BRFM 137 et P; sanguineus BRFM 1264, dont le séquençage a été réalisé par notre Unité, un regard tout à fait nouveau est porté sur le système lignolytique du genre Pycnoporus, longtemps décrit comme produisant que de la laccase comme enzyme du système lignolytique. Pour la première fois, nous avons montré la présence de gènes codant pour tout l'arsenal enzymatique de dégradation des lignines, c'est à dire plusieurs laccases mais surtout de nombreuses peroxydases et des enzymes auxilliaires génératrices d'H2O2 comme les glyoxal oxydases. Ces nouvelles enzymes ont été caractérisées in silico. Pour la première fois également, la sécrétion effective de peroxydases, de glyoxal oxydases et d'autres FOLymes dans nos conditions de culture a également pu être démontrée par analyse protéomique. / The purpose of this work was to prospect, in the genus Pycnoporus, for new oxido-reductases involved in the degradation of lignocellulosic biomass: from gene expression to biotechnological applications. This research was conducted in the framework of green chemistry applications according to BIORENEW European Project. The study was divided in three main research axes. Firstly, the exploration of natural biodiversity, especially tropical biodiversity, for the selection of new high redox potential-laccase producing strains. These strains were repositionned in a context of phylogenomic/function through the lac1 gene. Molecular clustering based on lac1 sequences enabled the distribution of P. sanguineus and P. coccineus through four distinct, well supported clades and subclades. This distribution was highly correlated with ecozones. The second part of the work deals with the biochemical and molecular characterization of three novel laccases from P. coccineus and P. sanguineus, and their applicability on natural or model phenolic substrates. The three laccases showed complementary biochemical features: high thermo- and pH stability, high catalytic efficiency and resistance to organic solvents. The three novel laccases proved to be suitable models for white biotechnology processes: polyphenolic dye decolourization, non-phenolic lignin model compound oxidation, and synthesis of new oligomers from natural flavonoids suitable for cosmetic or pharmaceutical applications. Finally, annotation of genomic data from the monocaryotic strains P. cinnabarinus BRFM 137 and P. sanguineus BRFM 1264 (genomes sequenced by the UMR1163 BCF ) was performed for lignolytic enzymes. For the first time, new oxidases (peroxidases, glyoxal oxidases and other FOLymes) were evidenced in Pycnoporus and in silico characterized. Moreover, the active secretion of several of these enzymes has been demonstrated in our culture conditions by 1D-proteomic analysis

La fermentation en milieu solide (FMS) est un procédé biotechnologique particulièrement bien adapté au traitement de la biomasse végétale. Cette technologie, extrapolable à l’échelle industrielle, peut répondre aux besoins actuels du marché de l’alimentation animale en développant des produits fermentés visant à améliorer les qualités des matières premières d’un point de vue nutritionnel et fonctionnel. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse développent ces aspects à partir du tourteau de colza issu du procédé de trituration des graines.Un premier criblage a mis en évidence le potentiel de certaines souches fongiques en prenant en compte les performances de croissance et leur capacité à enrichir le tourteau en protéines totales et digestibles. Des teneurs comparables à celles du tourteau de soja, principale source de protéine en nutrition animale, ont d’ailleurs été atteintes. Une activité biologique d’intérêt a ensuite été démontrée in vitro sur cellules immunitaires. Cette voie, inexplorée jusqu’à présent à partir de culture en milieu solide, confère une valeur ajoutée au produit fermenté via un apport en composés immunomodulateurs naturels d’origine fongique comme les β-glucanes. Ces derniers suscitent un intérêt croissant car ils représentent une alternative à l’utilisation des antibiotiques comme facteur de croissance. L’étude consacrée à la phase d’optimisation du procédé FMS a permis d’accroître les performances de croissance de la souche A. sojae et de définir une stratégie visant à maintenir les conditions optimales de croissance en réacteur pré-pilote à couche profonde. Des complications liées à la granulométrie très fine du tourteau de colza et à la qualité microbiologique qui évolue en cours de fermentation dans des conditions non stériles ont pu être identifiées mais le procédé mis en place a alors permis de les maîtriser en partie. / Solid state fermentation (SSF) is a biotechnological process particularly well adapted to the treatment of vegetable biomass. This technology adjustable to industrial scale, is adapted to current challenges in animal nutrition by developing fermented products in order to improve the quality of raw materials from a nutritional and functional point of view. The work presented in this thesis considers these issues using rapeseed meal from the oil crushing industry.A first screening study highlighted several fungal strains based on their growth performance and protein enrichment (total and digestible) of the substrate. Levels similar to those of soybean meal, the main protein source in animal nutrition, have also been reached. An interesting biological activity was then reported in vitro on immune cells. To date, this way has never been investigated concerning solid state culture. The presence of fungal immunomodulatory compounds as β-glucan confers added value to the fermented product. Recently, there has been growing interest in natural immunomodulators as they represent an alternative to the use of antibiotics for growth promotion in food animal production. SSF process optimization improved the growth performance of the strain A. sojae and helped to determine the best strategy to maintain optimum growth conditions at larger scale in the deep-bed pre-pilot reactor. Complications related to the fine particle size of the rapeseed meal and the changes in microbiological quality during fermentation under non-sterile conditions were also identified and partially controlled by the process.

La maîtrise du développement des moisissures retrouvées dans le contexte agro-alimentaire parmi les flores microbiennes d'altération ou technologiques répond à des enjeux économiques et sanitaires importants. Le développement des moisissures peut être affecté par des facteurs abiotiques comme la température, l'activité de l'eau (aw) ou la composition gazeuse. L'évaluation de l'effet de ces facteurs via des outils de mycologie prévisionnelle vise à prévoir l'altération fongique des aliments. Ce travail a pour objectif d'explorer l'impact des conditions environnementales sur la physiologie de moisissures d'intérêt pour l'industrie agro-alimentaire.L'effet de la température, de l'aw ajustée par du glycérol ou du chlorure de sodium (NaCl) du pH et de la composition gazeuse a été évalué sur la germination des spores et/ou la croissance radiale de cinq moisissures: Paecilomyces niveus, Mucor lanceolatus, Penicillium brevicompactum, Penicillium expansum et Penicillium roqueforti. Au niveau appliqué, ces travaux ont montré que l'effet du NaCl ou de la composition gazeuse peuvent être inclus dans une approche de mycologie prévisionnelle. Le choix des souches représentatives d'une espèce fongique et l'état physiologique des spores utilisées comme inoculum ont un impact significatif sur les modèles prédictifs.Au niveau fondamental, des marqueurs ont été recherchés pour évaluer l'effet des facteurs abiotiques sur la physiologie des spores. La température et l'aw ont un effet significatif sur l'état physiologique des spores et leur germination. La recherche de marqueurs moléculaire, contribuera aux connaissances de l'effet des facteurs abiotiques sur la physiologie des moisissures. / In the food processing industry, controlling the development of filamentous fungi encountered as spoilers or technological cultures address significant economic and sanitary issues. Fungal development in foods is mainly determined by abiotic factors including temperature, water activity (aw) or the headspace gas composition. The quantification of these respective effects through a predictive mycology approach aims at preventing fungal food spoilage. The present work aims at exploring the effect of environmental conditions on the physiology of filamentous fungi of interest in the food processing industry.The effect of temperature, aw (adjusted with glycerol of sodium chloride), pH and headspace gas composition was evaluated on conidial germination and/or radial growth of five fungi isolated from dairy products: Paecilomyces niveus, Mucor lanceolatus, Penicillium brevicompactum, Penicillium expansum and Penicillium roqueforti. The present work suggests that the specific effects of sodium chloride or gas composition could be included in predictive mycology approaches. It was also demonstrated that the selection of strains representative of a fungal species and the physiological state of conidia utilized as inoculum have a significant effect on the final predictive models.At the fundamental level, markers were investigated to study the effect of abitoic factors on the physiological state of spores. The temperature and aw significantly affected the physiological state of spores and their germination kinetics. The investigation of markers at the molecular level could provide better knowledges on the effect of abiotic factors on the physiology of filamentous fungi.

L’objectif de cette thèse est de développer une nouvelle souche de champignon filamenteux pour la production d’acide lactique. Pour répondre à cet objectif, nous avons tout d’abord d’exploré la biodiversité fongique à la recherche de champignons filamenteux capables de produire de l’acide lactique ou présentant de bonnes prédispositions pour la production d’acides organiques sans neutralisation du pH. Grâce à ce criblage, une souche sauvage d’Aspergillus brasiliensis a été sélectionnée et utilisée pour construire, grâce à l’ingénieure métabolique, les premières souches d’Aspergillus capables de produire de l’acide lactique à pH acide. Ces souches ont ensuite été caractérisées et les conditions de culture en fioles et fermenteurs volumes ont été étudiées. Cette étude des conditions de culture donne des résultats prometteurs et dévoile de nombreuses voies possibles pour continuer à améliorer la production d’acide lactique par ces organismes. / The objective of this thesis is to develop a new filamentous fungal strain for the production of lactic acid. To meet this goal, we first explored the fungal biodiversity in order to find filamentous fungi able to produce lactic acid or having good predispositions for the production of organic acids without pH neutralization. Through this screening, a wild type strain of Aspergillus brasiliensis was selected and used to construct, using the metabolic engineer, new strains capable of producing lactic acid at an acidic pH. These strains were then characterized and culture conditions in flasks and bioreactors were studied. The study of culture conditions shows promising results and reveals many possible ways to further improve the production of lactic acid by these organisms.

Pour se défendre des effets délétères des éléments transposables, les pezizomycotina ont développé un système de défense génétique et épigénétique appelé « Repeat Induced Point Mutation » (RIP). Chez N. crassa, le RIP survient dans la cellule dicaryotique avant la caryogamie et conduit à la méthylation de novo des cytosines (5mC) inclues dans les séquences répétées de chacun des noyaux parentaux haploïdes. De plus, certaines de ces cytosines sont la cible d’un processus de mutation qui les transforme en thymines. Cette étape est suivie par la mise en place locale de l’hétérochromatine constitutive permettant une répression transcriptionnelle durable des séquences cibles du RIP au cours des divisions nucléaires. L’acteur majeur du RIP correspond à une cytosine méthyltransférase putative appelée RID (RIP Defective). Bien que son génome ne montre pas une quantité significative de 5mC, l’inactivation de PaRid chez Podospora anserina aboutit à un blocage du développement sexué survenant après la fécondation. Dans ce contexte, nous avons voulu déterminer si la fonction de PaRid dans le développement sexué consiste à éteindre l’expression de gènes cibles via l’installation de foyers d’hétérochromatine constitutive aux loci concernés. Pour ce faire, nous avons identifié les gènes PaKmt1 et PaHP1, codant respectivement l’histone méthyltransférase PaKmt1 (l’homologue de SU(VAR)39 qui catalyse la tri-méthylation du résidu H3K9 (H3K9me3) et PaHP1 (l’homologue de Heterochromatin Protein 1 qui se lie à H3K9me3). Les deux protéines interviennent dans une même voie de régulation qui aboutit à la mise en place de l’hétérochromatine constitutive. Par opposition, PaKmt6, homologue de l’histone méthyltransférase E(Z), correspond à la sous-unité catalytique du complexe PRC2 qui catalyse la marque H3K27me3 pour permettre l’établissement de l’hétérochromatine facultative. Nos résultats ont montré que l’absence de PaKmt1 et PaHP1 ne provoquent que des défauts mineurs. A l’inverse, l’inactivation du gène PaKmt6 conduit à un ensemble de défauts sévères : croissance végétative altérée, surproduction des gamètes mâles, malformations critiques des fructifications, production très réduite d’ascospores dont la germination est pour partie déficiente. Une étude d’épistasie a montré que les protéines PaRid et PaKmt6 interviennent chacune dans deux voies développementales distinctes. Par ailleurs, nous avons établi par immuno-précipitation de la chromatine les profils de distribution à l’échelle du génome entier des modifications H3K9me3, H3K27me3 et H3K4me3. Caractéristique rare, la marque H3K9me3 colocalise avec H3K27me3 sur des gènes transcriptionnellement réprimés et les séquences répétées ripées. Conformément à sa fonction canonique, H3K4me3 est présente en 5’ des gènes transcrits et est exclue des domaines H3K9me3 et H3K27me3. Comme attendue, PaKmt6 est essentielle à la mise en place de la marque H3K27me3, mais, de manière surprenante, elle serait aussi impliquée dans le dépôt et/ou le maintien d’une partie des marques H3K9me3, dévoilant ainsi une voie de méthylation non canonique de ces résidus. / In pezizomycotina, transposable elements are targeted by a genome defense system named Repeat Induced Point Mutation (RIP). First described in Neurospora crassa, RIP occurs before karyogamy in each parental haploid nucleus of the dikaryotic cells and results, within the repeats, in de novo methylation of cytosine (5mC) and mutations, mainly C to T transitions. This initial step triggers local assembly of constitutive heterochromatin, which allows transcriptional gene silencing. RID (RIP Defective) is a putative cytosine methyltransferase essential for RIP. Despite the absence of 5mC in its genome, PaRid inactivation in Podospora anserina results in sexual reproduction arrest right after fertilization. In this context, we asked whether PaRid is required to silence expression of some of sexual development-specific genes by nucleation of constitutive heterochromatin. To this end, we identified PaKmt1 and PaHp1 genes encoding respectively the histone methyltransferase PaKmt1 (SU(VAR)39 homologue protein) and the heterochromatin protein 1 (PaHP1). To assemble constitutive heterochromatin, PaKmt1 catalyses tri-methylation of H3K9 (H3K9me3), latter on bound by PaHP1. By contrast, the E(Z) histone methyltransferase homologue PaKmt6, as part of the PRC2 complex, catalyses tri-methylation of H3K27 (H3K27me3) to form facultative heterochromatin. Our results showed that loss of either PaKmt1 or PaHP1 does not cause major defects. Conversely, PaKmt6 gene inactivation results in severe defects: altered mycelium and vegetative growth rate, overproduction of male gamete, development of crippled fructifications, reduced production ascospores, part of which does not germinate. Furthermore, epistatic study showed that PaRid and PaKmt6 likely act in two different developmental pathways, with respect to sexual reproduction. In addition, using chromatin immuno-precipitation we characterized H3K9me3, H3K27me3 and H3K4me3 genome-wide distribution patterns. We observed an uncommon overlapping distribution between H3K9me3 and H3K27me3 on transcriptionally repressed genes and RIP target repeats. As expected, H3K4me3 localizes in 5’ of the transcribed genes and is excluded from the H3K9me3 and H3K27me3 domains. As expected, PaKmt6 is essential for H3K27me3 modification, but surprisingly, could also be responsible for some of the H3K9me3 setting up or maintenance.