Le gène ShcA code pour trois isoformes de protéines adaptatrices (p46, p52 et p66Shc), possédant entre eux une forte homologie structurelle. Les études antérieures ont attribué un rôle essentiel à l'isoforme p52Shc dans l'activation de la voie mitogénique des MAPK, ainsi que dans la transformation cellulaire en aval des récepteurs de type tyrosine kinase (RTK). L'activation des MAPK fait intervenir une liaison directe de p52Shc aux RTK suivant leur activation, ce qui permet la phosphorylation sur tyrosines de Shc et ainsi, le recrutement de la protéine adaptatrice Grb2. Pendant longtemps, ces fonctions ont été attribuées aux trois isoformes des protéines Shc. Cependant, il est maintenant évident que Pisciforme p66Shc joue des rôles distincts de p52Shc. En effet, l'expression de p66Shc n'induit pas la transformation cellulaire et inhibe l'activité des MAPK en aval des RTK. D'ailleurs, p66Shc induit l'apoptose en réponse aux stress oxydatifs, par le biais de la phosphorylation d'une sérine située dans son domaine unique en N-terminal. Bien que ces caractéristiques proposent un pouvoir anti-tumorigénique à p66Shc, son rôle dans la progression du cancer demeure controversé. Mes travaux de recherche démontrent que p66Shc est constitutivement associé au récepteur dii facteur de croissance des hépatocytes, le RTK Met, et diminue fortement l'interaction entre le récepteur Met actif et Grb2. Nos études in cellulo et in vivo dans un modèle de cellules épithéliales intestinales transformées par Tpr-Met (Tpr-Met-IEC-6), une forme oncogénique du récepteur Met, révèlent que l'expression de p66Shc induit l'apoptose à l'atteinte de la confluence et diminue la croissance tumorale, dépendamment de sa phosphorylation sur sérine. En revanche, p66Shc augmente la capacité de ces cellules à survivre sans ancrage à la matrice extracellulaire et favorise la formation de métastases. En conclusion, nous démontrons qu'une protéine Shc s'associe à un RTK indépendamment de son activation. Il s'agit de la première évidence que les modes d'interaction de p66Shc avec les RTK different de ceux caractérisés pour p52Shc. De plus, nos études permettent d'illustrer la dualité fonctionnelle de p66Shc, où son expression diminue la capacité tumorigénique des cellules en adhésion, mais augmente leur potentiel métastatique lorsqu'elles sont en suspension, dénotant le rôle controversé de p66Shc dans le cancer. Cette nouvelle compréhension des rôles distincts associés à p66Shc selon le contexte de la cellule cancéreuse permet de cibler différentes étapes du développement du cancer.

Resveratrol is reported to possess chemotherapeutic properties in several cancers. In this study, we wanted to investigate the molecular mechanisms of resveratrol-induced cell cycle arrest and apoptosis as well as the impact of resveratrol on NAMPT and SIRT1 protein function and asked whether there are differences in hepatocarcinoma cells (HepG2, Hep3B cells) and non-cancerous primary human hepatocytes. We found a lower basal NAMPT mRNA and protein expression in hepatocarcinoma cells compared to primary hepatocytes. In contrast, SIRT1 was significantly higher expressed in hepatocarcinoma cells than in primary hepatocytes. Resveratrol induced cell cycle arrest in the S- and G2/M- phase and apoptosis was mediated by activation of p53 and caspase-3 in HepG2 cells. In contrast to primary hepatocytes, resveratrol treated HepG2 cells showed a reduction of NAMPT enzymatic activity and increased p53 acetylation (K382). Resveratrol induced NAMPT release from HepG2 cells which was associated with increased NAMPT mRNA expression. This effect was absent in primary hepatocytes where resveratrol was shown to function as NAMPT and SIRT1 activator. SIRT1 inhibition by EX527 resembled resveratrol effects on HepG2 cells. Furthermore, a SIRT1 overexpression significantly decreased both p53 hyperacetylation and resveratrol-induced NAMPT release as well as S-phase arrest in HepG2 cells. We could show that NAMPT and SIRT1 are differentially regulated by resveratrol in hepatocarcinoma cells and primary hepatocytes and that resveratrol did not act as a SIRT1 activator in hepatocarcinoma cells.

Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung mit bevorzugter Manifestation an den Gelenken. Die RA ist charakterisiert durch eine chronische, systemische Entzündung, eine abnormale zelluläre und humorale Immunantwort und eine synoviale Hyperplasie. Die Ursache der synovialen Hyperplasie ist noch nicht eindeutig geklärt, aber es wird eine veränderte oder unvollständig ablaufende Apoptose der synovialen Fibroblasten vermutet. Die vorliegende Arbeit untersucht die Rolle des Apoptosemodulators death associated protein (Daxx) in rheumatoiden synovialen Fibroblasten (RA-SF). Als erstes wurde die Expression von Daxx in RA-SF gegenüber Osteoarthrosefibroblasten (OA-SF) untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die OA-SF eine höhere Expression von Daxx auf mRNA und Proteinebene gegenüber RA-SF aufweisen. Im weiteren Verlauf erfolgte die Untersuchung der subzellulären Lokalisation von Daxx in RA-SF mittels konfokaler Laserscan-Mikroskopie (Immunfluoreszenz). Dabei zeigte sich, dass Daxx vorwiegend im Zellkern und nur zu einem geringen Anteil im Zytoplasma lokalisiert ist. Weiterhin zeigte Daxx eine Kolokalisation mit dem Promyeloischen Leukämie Protein (PML), welches ausschließlich im Zellkern lokalisiert ist. Nun erfolgten die Untersuchungen zur Rolle von Daxx in der Apoptose von RA-SF mittels RNA Interferenz (RNAi). Zu diesem Zweck wurden 3 verschiedene small interfering RNA (siRNA) synthetisiert, die unterschiedliche Abschnitte auf der mRNA von Daxx umfassen. Die Überprüfung der Effektivität der siRNA erfolgte auf mRNA Ebene mittels Quantitativer Real Time PCR(TaqMan®) und auf Proteinebene im Westernblot in HeLa-Zellen und RA-SF. Dabei zeigte die siRNA(454-472) die stärkste Hemmung. In den Untersuchungen zur Apoptose in HeLa-Zellen und RA-SF, nach der Hemmung von Daxx durch die siRNA, zeigte sich, dass eine stärkere Hemmung von Daxx zu einer verminderten Empfindlichkeit der HeLa-Zellen und RA-SF auf die FasL-induzierte Apoptose führt. Die RA-SF und Makrophagen der Deckzellschicht synthetisieren Zytokine wie den Tumor Nekrose Faktor a (TNFa). Diese Erkenntnis dient als Grundlage zur Untersuchung des Einflusses von TNFa auf die Expression von Daxx auf mRNA- und Proteinebene. Dabei zeigte sich eine konzentrationsabhängige Erhöhung der Expression von Daxx. Als letztes erfolgte die Untersuchung zur Apoptose nach der TNFa Stimulation. Hierbei zeigte sich eine Reduktion der Apoptose, die von der TNFa Konzentration abhängig war, wobei sich hohe Schwankungsbreiten bei der Konzentration von 10ng/ml TNFa zeigten. In dieser Arbeit wurde durch die Hemmung von Daxx mittels siRNA eine pro-apoptotische Funktion des Moleküls in RA-SF nachgewiesen. Diese Ergebnisse sollen der weiteren Identifizierung von Signalwegen in der Apoptose bei RA-SF dienen.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Quartärstruktur des Tumorsuppressors p53 an Mitochondrien zu untersuchen. In vorangegangenen Untersuchungen der Arbeitsgruppe konnte festgestellt werden, dass der transkriptionsunabhängige Apoptoseweg von p53 an den Mitochondrien resistent war gegenüber dominant-negativer Hemmung durch mutiertes p53. Dadurch stellte sich die Frage, welche Mechanismen für diese Resistenz verantwortlich sind. Unter den zahlreichen, denkbaren Möglichkeiten erschienen zwei als wahrscheinlich: a) Der Mechanismus, der p53 nach Stress an die Mitochondrien transloziert, ist spezifisch für Wildtyp-Homotetramer; b) mitochondriales p53 liegt als Monomer vor. Für das experimentelle Vorgehen wurden HCT116 Colon-Adenokarzinomzellen und MCF-7 Mamaadenokarzinomzellen verwendet, die beide einen intakten p53- Apoptoseweg besitzen. Zudem wurden HCT116R175HPuro und HCT116R273HPuro verwendet, um die Eigenschaften von mutiertem p53 an Mitochondrien untersuchen zu können. Aus den Zellen wurden die Mitochondrien isoliert, um dann die mitochondrialen Proteine durch die beiden Crosslinker Bismaleimidohexan (BMH) und Glutaraldehyd (GLD) zu vernetzen. Durch einen Western Blot wurden die Proteine voneinander getrennt und detektiert. In Voruntersuchungen konnte gezeigt werden, dass Wildtyp-p53 im Gesamtzellextrakt von HCT116 Zellen, ebenso wie die p53 Mutanten, sowohl als Monomer als auch als Oligomer vorkommt. Außerdem konnte eine Methode etabliert werden, mit der es möglich war, Oligomere durch eine Vernetzung mit BMH sichtbar zu machen. Um zeigen zu können, dass die Methode für Proteine an Mitochondrien geeignet war, wurden Bax-Oligomere an den Mitochondrien nachgewiesen. Mit der etablierten Methode konnten dann im Gesamtzellextrakt p53-Oligomere und –Monomere nachgewiesen werden, während p53 an den Mitochondrien unter gleichen Bedingungen nur als Monomer vorlag. Um die erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen, wurden die Experimente mit einem weiteren Crosslinker (Glutaraldehyd) wiederholt. Auch in diesen Untersuchungen konnte p53 als Monomer an den Mitochondrien nachgewiesen werden. Um zeigen zu können, dass diese vorliegenden Ergebnisse nicht nur für HCT116 Zellen gültig sind, wurden die beschriebenen Untersuchungen in einer weiteren Zelllinie vorgenommen. Die Ergebnisse bewiesen, dass auch in MCF-7 Zellen p53 vorwiegend als Monomer an den Mitochondrien vorkommt.

Thèse (D. en biochimie)--Université du Québec à Montréal, 2005. / En tête du titre: Université du Québec à Montréal. Comprend des réf. bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Thèse (D. en biochimie)--Université du Québec à Montréal, 2006. / En tête du titre: Université du Québec à Montréal. Bibliogr.: f. [251]-292. Publié aussi en version électronique.

Thesis--University of Helsinki, 1996. / Includes bibliographical references.

Thesis--University of Helsinki, 1996. / Includes bibliographical references.

Avhandling : Zoomorfologi : Göteborg. / Notes bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. 69-78. Publié aussi en version électronique.