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Teor de apramicina: desenvolvimento e validação de método empregando cromatografia líquida de alta eficiência comparativamente a um doseamento microbiológico / Apramycin determination: development and validation of method employing high performance liquid chromatography in comparison to a microbiological assay

Barbosa, Elisabete de Almeida 03 August 2009 (has links)
A apramicina é um antibiótico aminoglicosídeo produzido por uma cepa de Streptomyces Tenebrarius, utilizada na medicina veterinária na forma de sulfato para tratar e prevenir doenças infecciosas produzidas por bactérias gram-negativas em porcos, bezerros e aves domésticas. As preparações comercialmente disponíveis são injetável, premix para adição em rações e pó oral solúvel, sendo esta última objeto de estudo deste trabalho. A Farmacopéia Britânica é o único compêndio oficial que descreve a apramicina (tanto a matéria-prima quanto as preparações) e recomenda o método microbiológico turbidimétrico para o seu doseamento. Embora os métodos microbiológicos ainda sejam os métodos de escolha na determinação da potência de antibióticos, há uma tendência crescente em substituí-los pelos métodos físico-químicos, sobretudo a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), a qual proporciona sensibilidade, especificidade, exatidão e precisão; ela já vem sendo usada com sucesso na determinação do teor de antibióticos, embora a sua potência possa estar sujeita a confirmação por um método microbiológico. Considerando-se as vantagens da CLAE, bem como a inexistência de métodos físico-químicos oficiais para a análise de apramicina, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver e validar um método empregando a cromatografia líquida de alta eficiência para a quantificação de apramicina em pó oral solúvel, bem como correlacioná-lo com o método turbidimétrico. Foi desenvolvido um método por CLAE empregando fase reversa com o uso de uma coluna C18 de 150 mm x 4,6 mm x 4 &#181;m, derivatização pré-coluna com o-ftalaldeído (OPA) e detecção por UV em 332 nm. A metodologia proposta foi validada de acordo com normas dos compêndios oficiais e apresentou: boa robustez; linearidade no intervalo de 0,02 a 0,05 mg/mL com obtenção de uma curva de calibração de equação igual a y = 132887304,980x + 127223,837 e coeficiente de correlação linear de 0,9999; boa precisão, sendo o DPR<1,0% para a precisão intra-dia e DPR = 1,1% para a precisão inter-dia; 99,33% de recuperação média, demonstrando exatidão; sensibilidade, com limites de detecção e de quantificação de 0,08 e 0,25 &#181;g/mL, respectivamente. Três lotes de apramicina pó oral solúvel foram analisados pelo método por CLAE e pelo método microbiológico oficial e a comparação estatística entre os resultados obtidos através do Teste T demonstrou que não houve diferença significativa entre ambos no nível de &#945; = 0,05. / Apramycin is an aminoglycoside antibiotic produced by Streptomyces tenebrarius strain, widely used in veterinary medicine under sulfate form to treat and prevent infectious diseases induced by gram-negative bacteria in swines, calves and poultry. The commercially available preparations consist of injections, additive feed (premix) and soluble oral powder, being the latter the aim of this work. British Pharmacopoeia is the only official compendium that describes apramycin (bulk pharmaceutical and its formulations) recommending the microbiological turbidimetric method for its dosage. Although microbiological methods are still of chosen for the determination of antibiotics potency, there is an increasing tendency of replacing them by physico-chemical methods, mainly high performance liquid chromatography (HPLC), which offers sensitivity, specificity, accuracy, and precision; it has been successfully used in the determination of antibiotic assay, although its potency may be subjected to confirmation by a microbiological method. Taking into account the advantages of HPLC as well as the absence of official physicochemical methods to analyze apramycin, the aim of the present work was to develop and validate a method employing high performance liquid chromatography to the quantification of soluble oral powder, as well as to compare it with the turbidimetric method. A HPLC method was developed employing reverse phase with a C18 column of 150 mm x 4,6 mm x 4 &#181;m, pre-column derivatization with OPA (o-phthalaldehyde) and UV detection at 332 nm. The proposed method was validated according to official compendia guidelines, having demonstrated: good robustness; linearity in the concentration range of 0,02 to 0,05 mg/mL with linear equation of y = 132887304,980x + 127223,837 and correlation coeficient of 0,999; good precision, being RSD<1,0% for intra-day precision and = 1,1% for inter-day precision; average recuperation of 99,33%, what demonstrates accuracy; sensitivity, with quantification and detection limits of 0,08 and 0,25 &#181;L/mL, respectively. Three batches of apramycin soluble oral powder were analyzed by HPLC method and by the official microbiological method having the statistical comparison between the obtained results by T test demonstrated that there are no significant differences between both of them at &#945; = 0,05 level.
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Doseamento microbiológico de apramicina - desenvolvimento e validação de método empregando leitura cinética em microplacas / Microbial assay of apramycin - delevopment and validation of assay using kinetic-reading microplate system

Lourenço, Felipe Rebello 16 October 2009 (has links)
O princípio do ensaio turbidimétrico é simples: a solução-teste é adicionada à suspensão do microrganismo-teste em meio de cultura, a mistura é incubada em condições adequadas e o crescimento microbiano é medido através da leitura fotométrica. O emprego de método de microplacas com leitura cínética para a dosagem de antibióticos é de interesse considerável, uma vez que possibilita reduzir quantidade de material e tempo de análise necessários e permite o ensaio de grande número de amostras simultaneamente, com leitura e cálculo automatizados. O objetivo deste trabalho é determinar as condições experimentais ideais para o desenvolvimento de metodologia para a dosagem microbiológica de apramicina empregando microplacas e modo de leitura cinético, e validar o método desenvolvido, através da avaliação dos parâmetros de especificidade e seletividade, linearidade, faixa ou intervalo linear, limite de detecção e quantificação, exatidão e precisão. As condições estabelecidas abrangem curva-padrão de apramicina com concentrações entre 5 e 35 &#181;g/ml, e emprego de meio de cultura caldo de triptona-soja inoculado com Escherichia coli (ATCC 8739) na proporção de 5%. Foram obtidos resultados satisfatórios após 2 horas de incubação. O método desenvolvido apresentou especificidade e seletividade adequadas, linearidade na faixa de 5 a 35 &#181;g/ml, limite de detecção e quantificação de 0,1 e 0,4 &#181;g/ml, respectivamente, exatidão (recuperação = 98,5%) e precisão (DPR = 6,0%) satisfatórias. O ensaio em microplaca agrega características dos ensaios microbiológicos (avaliação da atividade do antibiótico frente a microrganismo-teste sensível) e físico-químicos (facilidade operacional e maior rapidez na obtenção dos resultdos). / The turbidimetric assay principle is simple: the test-solution is added to a suspension of test-microorganism in culture media, the mixture is incubated in appropriate conditions and the microbial growth is measured by photometric reading. Microplate with kinetic reading mode employed in antibiotic assay is considerable interesting, once it allows reduction of material and analysis time and it permits that a great numbers of samples could be analyzed simultaneously, with automated reading and calculating. The aim of this work is to determinate best experimental conditions to development of methodology for microbiological assay of apramycin employing microplate and kinetic reading mode, and to validate the developed method, through evaluation of parameters of specificity and selectivity, linearity, linear range, limit of detection and quantification, accuracy and precision. Established conditions considered standard-curve of apramycin in concentrations from 5 to 35 &#181;g/ml, and tryptic soy broth inoculated with 5% of Escherichia coli (ATCC 8739) suspension. Satisfactory results were obtained with 2 hours incubation. The developed method showed appropriate specificity and selectivity, linearity in the range from 5 to 35 &#181;g/ml, limit of detection and quantification of 0,1 and 0,4 &#181;g/ml, respectively, satisfactory accuracy (recuperation = 98,5%) and precision (RSD = 6,0%). Microplate assay considered characteristics of microbiological assay (evaluation of antibiotic activity against sensible test-microorganism) and physical-chemistry (operational facility and quicker results).
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Doseamento microbiológico de apramicina - desenvolvimento e validação de método empregando leitura cinética em microplacas / Microbial assay of apramycin - delevopment and validation of assay using kinetic-reading microplate system

Felipe Rebello Lourenço 16 October 2009 (has links)
O princípio do ensaio turbidimétrico é simples: a solução-teste é adicionada à suspensão do microrganismo-teste em meio de cultura, a mistura é incubada em condições adequadas e o crescimento microbiano é medido através da leitura fotométrica. O emprego de método de microplacas com leitura cínética para a dosagem de antibióticos é de interesse considerável, uma vez que possibilita reduzir quantidade de material e tempo de análise necessários e permite o ensaio de grande número de amostras simultaneamente, com leitura e cálculo automatizados. O objetivo deste trabalho é determinar as condições experimentais ideais para o desenvolvimento de metodologia para a dosagem microbiológica de apramicina empregando microplacas e modo de leitura cinético, e validar o método desenvolvido, através da avaliação dos parâmetros de especificidade e seletividade, linearidade, faixa ou intervalo linear, limite de detecção e quantificação, exatidão e precisão. As condições estabelecidas abrangem curva-padrão de apramicina com concentrações entre 5 e 35 &#181;g/ml, e emprego de meio de cultura caldo de triptona-soja inoculado com Escherichia coli (ATCC 8739) na proporção de 5%. Foram obtidos resultados satisfatórios após 2 horas de incubação. O método desenvolvido apresentou especificidade e seletividade adequadas, linearidade na faixa de 5 a 35 &#181;g/ml, limite de detecção e quantificação de 0,1 e 0,4 &#181;g/ml, respectivamente, exatidão (recuperação = 98,5%) e precisão (DPR = 6,0%) satisfatórias. O ensaio em microplaca agrega características dos ensaios microbiológicos (avaliação da atividade do antibiótico frente a microrganismo-teste sensível) e físico-químicos (facilidade operacional e maior rapidez na obtenção dos resultdos). / The turbidimetric assay principle is simple: the test-solution is added to a suspension of test-microorganism in culture media, the mixture is incubated in appropriate conditions and the microbial growth is measured by photometric reading. Microplate with kinetic reading mode employed in antibiotic assay is considerable interesting, once it allows reduction of material and analysis time and it permits that a great numbers of samples could be analyzed simultaneously, with automated reading and calculating. The aim of this work is to determinate best experimental conditions to development of methodology for microbiological assay of apramycin employing microplate and kinetic reading mode, and to validate the developed method, through evaluation of parameters of specificity and selectivity, linearity, linear range, limit of detection and quantification, accuracy and precision. Established conditions considered standard-curve of apramycin in concentrations from 5 to 35 &#181;g/ml, and tryptic soy broth inoculated with 5% of Escherichia coli (ATCC 8739) suspension. Satisfactory results were obtained with 2 hours incubation. The developed method showed appropriate specificity and selectivity, linearity in the range from 5 to 35 &#181;g/ml, limit of detection and quantification of 0,1 and 0,4 &#181;g/ml, respectively, satisfactory accuracy (recuperation = 98,5%) and precision (RSD = 6,0%). Microplate assay considered characteristics of microbiological assay (evaluation of antibiotic activity against sensible test-microorganism) and physical-chemistry (operational facility and quicker results).
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Teor de apramicina: desenvolvimento e validação de método empregando cromatografia líquida de alta eficiência comparativamente a um doseamento microbiológico / Apramycin determination: development and validation of method employing high performance liquid chromatography in comparison to a microbiological assay

Elisabete de Almeida Barbosa 03 August 2009 (has links)
A apramicina é um antibiótico aminoglicosídeo produzido por uma cepa de Streptomyces Tenebrarius, utilizada na medicina veterinária na forma de sulfato para tratar e prevenir doenças infecciosas produzidas por bactérias gram-negativas em porcos, bezerros e aves domésticas. As preparações comercialmente disponíveis são injetável, premix para adição em rações e pó oral solúvel, sendo esta última objeto de estudo deste trabalho. A Farmacopéia Britânica é o único compêndio oficial que descreve a apramicina (tanto a matéria-prima quanto as preparações) e recomenda o método microbiológico turbidimétrico para o seu doseamento. Embora os métodos microbiológicos ainda sejam os métodos de escolha na determinação da potência de antibióticos, há uma tendência crescente em substituí-los pelos métodos físico-químicos, sobretudo a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), a qual proporciona sensibilidade, especificidade, exatidão e precisão; ela já vem sendo usada com sucesso na determinação do teor de antibióticos, embora a sua potência possa estar sujeita a confirmação por um método microbiológico. Considerando-se as vantagens da CLAE, bem como a inexistência de métodos físico-químicos oficiais para a análise de apramicina, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver e validar um método empregando a cromatografia líquida de alta eficiência para a quantificação de apramicina em pó oral solúvel, bem como correlacioná-lo com o método turbidimétrico. Foi desenvolvido um método por CLAE empregando fase reversa com o uso de uma coluna C18 de 150 mm x 4,6 mm x 4 &#181;m, derivatização pré-coluna com o-ftalaldeído (OPA) e detecção por UV em 332 nm. A metodologia proposta foi validada de acordo com normas dos compêndios oficiais e apresentou: boa robustez; linearidade no intervalo de 0,02 a 0,05 mg/mL com obtenção de uma curva de calibração de equação igual a y = 132887304,980x + 127223,837 e coeficiente de correlação linear de 0,9999; boa precisão, sendo o DPR<1,0% para a precisão intra-dia e DPR = 1,1% para a precisão inter-dia; 99,33% de recuperação média, demonstrando exatidão; sensibilidade, com limites de detecção e de quantificação de 0,08 e 0,25 &#181;g/mL, respectivamente. Três lotes de apramicina pó oral solúvel foram analisados pelo método por CLAE e pelo método microbiológico oficial e a comparação estatística entre os resultados obtidos através do Teste T demonstrou que não houve diferença significativa entre ambos no nível de &#945; = 0,05. / Apramycin is an aminoglycoside antibiotic produced by Streptomyces tenebrarius strain, widely used in veterinary medicine under sulfate form to treat and prevent infectious diseases induced by gram-negative bacteria in swines, calves and poultry. The commercially available preparations consist of injections, additive feed (premix) and soluble oral powder, being the latter the aim of this work. British Pharmacopoeia is the only official compendium that describes apramycin (bulk pharmaceutical and its formulations) recommending the microbiological turbidimetric method for its dosage. Although microbiological methods are still of chosen for the determination of antibiotics potency, there is an increasing tendency of replacing them by physico-chemical methods, mainly high performance liquid chromatography (HPLC), which offers sensitivity, specificity, accuracy, and precision; it has been successfully used in the determination of antibiotic assay, although its potency may be subjected to confirmation by a microbiological method. Taking into account the advantages of HPLC as well as the absence of official physicochemical methods to analyze apramycin, the aim of the present work was to develop and validate a method employing high performance liquid chromatography to the quantification of soluble oral powder, as well as to compare it with the turbidimetric method. A HPLC method was developed employing reverse phase with a C18 column of 150 mm x 4,6 mm x 4 &#181;m, pre-column derivatization with OPA (o-phthalaldehyde) and UV detection at 332 nm. The proposed method was validated according to official compendia guidelines, having demonstrated: good robustness; linearity in the concentration range of 0,02 to 0,05 mg/mL with linear equation of y = 132887304,980x + 127223,837 and correlation coeficient of 0,999; good precision, being RSD<1,0% for intra-day precision and = 1,1% for inter-day precision; average recuperation of 99,33%, what demonstrates accuracy; sensitivity, with quantification and detection limits of 0,08 and 0,25 &#181;L/mL, respectively. Three batches of apramycin soluble oral powder were analyzed by HPLC method and by the official microbiological method having the statistical comparison between the obtained results by T test demonstrated that there are no significant differences between both of them at &#945; = 0,05 level.

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