This work is included in a largest project focused on the improvement of transgenic rice plants resistance against pests and phytopathogens. Our goal is the obtention of an improvement of the rice resistance against the lepidopterean Chilo suppressalis, the most important rice pest. The chosen strategy was the expression of the mpi gene (Maize Proteinase Inhibitor, coding for a proteinase inhibitor) on rice, by both biolistic and Agrobacterium transformation methods. The proteinase inhibitors are part of the natural defence system of plants against insect predation. Expression of this gene, and accumulation of the MPI protein, is stable through successive generations of rice transgenic lines. We have demonstrated that constitutive expression of the mpi gene confers resistance towards Chilo suppressalis larvae infestation in transgenic rice. Bioassays performed with transgenic rice plants expressing the mpi gene constitutively that were infested with Chilo larvae, showed that ingestion of the MPI lead to a significant reduction of the larvae weight with respect to the control larvae group (as far as 60 %). It is also important to point out that larvae fed on transgenic MPI plants showed a significant delay in their development, preventing the achievement of the L4 larval stage in most of them.The mpi promoter is functional in rice and confers wound-inducibility of gus reporter gene. The 2K fragment of mpi promoter confers a more rapid and intense induction than shortest C1 fragment. Moreover, 2K fragment of mpi promoter doesn't confer expression of gus reporter gene in the rice seed endosperm.On the other hand, the maize mpi gene is correctly expressed in rice plants under control of his own regulatory regions. The observed expression levels allow obtaining similar effects on Chilo larvae than those obtained with constitutive mpi expression.Besides, we fixed the optimal pH of digestive proteinase activities of Chilo suppressalis and Cacyreus marshalli (Geranium pest) as alkaline (pH 10.5 and 10 respectively). In Chilo digestive system participate serine proteinases activities of trypsin and chimotryspsin type, and also carboxy and aspartic proteinases. We also observed an adaptation effect on Chilo digestive system of larvae feed on transgenic rice plants, with an increase of 40% of total proteolytic activities in comparison to the control larvae activities. Nevertheless, this increase is not effective to overcome the MPI inhibitor effect.The analysis of AFP (Antifungal Protein) allows to conclude that this protein shows an elevated antifungal activity against F. verticillioides and M. grisea at low nM concentrations. Besides, AFP shows activity against the oomycete Phytophthora infestans at low mM concentrations. The presence of AFP protein leads to important morphological abnormalities of these phytopathogens. We have not detect toxic effects of AFP protein towards rice protoplasts at high AFP concentrations. The topic application of AFP protein on rice plants confers protection to Magnaporthe grisea infection.

Aquest treball s'emmarca dins d'una de les principals línees d'investigació del nostre grup, dirigida a l'avaluació d'estratègies aplicables a l'obtenció de varietats d'arròs resistents a patògens i insectes plaga mitjançant transformació genètica. L'objectiu general ha estat l'expressió simultània de gens vegetals que codifiquen proteïnes insecticides i antifúngiques en plantes d'arròs transgèniques. En primer lloc s'ha avaluat l'eficàcia de l'expressió d'un gen fusió que codifica dos inhibidors de proteases, els gens mpi de blat de moro (maize proteinase inhibitor) i pci de patata (potato carboxypeptidase inhibitor). Per a l'expressió simultània d'aquets dos gens s'han utilitzat vàries estratègies, com són, 1) l'ús d'una seqüència viral anomenada "2A" capaç de patir autoprocessament, 2) mitjançant una seqüència de processament de la protoxina Cry1B (definida com a seqüència "C") processada per enzims d'insectes o 3) mitjançant creuament de línees d'arròs pci i mpi. En segon lloc, s'ha estudiat l'ús d'un gen regulador de la resposta de defensa a Arabidopsis, el gen AtNPR1 (Non Expressor of Pathogenesis Related genes 1), com a transgen per l'expressió simultània de gens de defensa endògens de la planta d'arròs El gen fusió mpi-pci s'expressa correctament sota el seu propi promotor i terminador. Quan s'utilitza la seqüència 2A, el producte obtingut (proteïna MPI-2A-PCI) es processa parcialment a la cèl·lula d'arròs, mentre que la MPI-C-PCI s'acumula com a poliproteïna no processada. L'expressió del gen mpi-pci emprant ambdues estratègies (2A and C) confereix resistència front infestació amb larves del lepidòpter plaga (Chilo suppressalis). Bioassaigs amb plantes transgèniques d'arròs mpi-pci infestades mostren una reducció significativa del pes larval en comparació amb larves control. Tot i que tradicionalment s'ha atribuït un paper insecticida als inhibidors de proteases vegetals, hem demostrat el potencial del PCI com a agent antifúngic. Així, plantes transgèniques que expressen constitutivament el gen pci mostren resistència vers patògens de gran importància econòmica com Magnaporthe oryzae i Fusarium verticillioides. S'ha purificat una carboxipeptidasa de M. oryzae mitjançant cromatografia d'afinitat i posteriorment s'ha caracteritzat per espectrometria de masses. Aquesta proteïna fúngica resulta ser una nova carboxipeptidasa B (MoCPB) que és totalment inhibida pel PCI. En conjunt, aquests resultats indiquen que el PCI exerceix la seva activitat antifúngica mitjançant la inhibició d'aquesta carboxipeptidasa fúngica. A la segona part de la tesi, s'ha demostrat que l'expressió constitutiva en arròs del gen AtNPR1 d'Arabidopsis confereix resistència front els patògens fúngics M. oryzae i F. verticillioides, i el patogen bacterià Erwinia chrysantemi. S'ha determinat que la resistència observada vers M. grisea, està associada a un augment en la capacitat de la planta per activar els mecanismes endògens de defensa en condicions d'infecció, concretament l'expressió dels gens de defensa PR-1b, TLP (PR-5), Sci1 (PR-6), PR-10 i PBZ. Les plantes transgèniques AtNPR1 crescudes en condicions d'hivernacle presenten un tamany menor i produeixen menys llavors que les plantes no transformades. Les plantes AtNPR1 desenvolupen lesions espontànies a les fulles al ser crescudes en condicions de baixa intensitat de llum. Aquestes lesions van acompanyades d'una sèrie d'efectes citològics com són l'acumulació de l'ió superòxid i de compostos fluorescents en la paret cel·lular, fenòmens que mimetitzen la resposta hipersensible de defensa. Contràriament a la resistència observada vers patògens fúngics i bacterians, les plantes d'arròs AtNPR1 presenten una major susceptibilitat al Rice Yellow Mottle Virus (RYMV). A més, l'expressió constitutiva del gen AtNPR1 regula negativament l'expressió de gens que participen en la resposta a estrès salí i sequera, com són els gens rab21, salT i dip1, resultant en una major sensibilitat a aquests dos tipus d'estrès abiòtics. Aquestes observacions suggereixen que el gen AtNPR1 en arròs presenta tant un paper positiu com negatiu en la resposta de defensa a estressos biòtics i abiòtics. / This work is part of integrated project focused on the improvement of resistance against pests and phytopathogens in rice. The general goal has been the simultaneous expression of genes encoding insecticides and antifungal proteins in transgenic rice plants. As a first approach, the effectiveness of the expression of a fusion gene that encodes two protease inhibitors, genes mpi (maize proteinase inhibitor) and pci (potato carboxypeptidase inhibitor) has been evaluated. The proteinase inhibitors are part of the natural defence system of plants against insect predation. For the simultaneous expression of these two genes has been used several strategies, including (1) the use of a viral sequence called "2A", a self-cleaving oligopeptide, (2) through a sequence of processing the protoxina Cry1B processed by insect enzymes (defined as a sequence 'C') or (3) by crossing pci and mpi lines of rice. Secondly, a regulator gene of the defence response in Arabidopsis (gene AtNPR1; Non Expressor of Pathogenesis Related gene 1) has been used as transgen for the simultaneous expression of endogenous defence genes in rice plant.The gene fusion mpi-pci is expressed correctly under the control of the mpi wound-inducible promoter and terminator regions. Using the processing sequence 2A, the protein product (MPI-2A-PCI) is partially processed in transformed rice cell, whereas MPI-C-PCI accumulates as a non-processed polyprotein. Expression of mpi-pci gene using both strategies (2A fragment and sequence C) confers resistance against the striped stem borer (Chilo suppressalis) larvae in transgenic rice plants. Bioassays performed with transgenic rice plants expressing the mpi-pci gene and infested with Chilo larvae showed a significant reduction of the larval weight compared with the control larvae group. Although the role of plant protease inhibitors has been described exclusively in the defense against insect attack, we reported about the potential role of the PCI inhibitor involved in resistance to fungal pathogens. Rice plants expressing constitutively the pci gene exhibit resistance against the economically important pathogens Magnaporthe oryzae and Fusarium verticillioides. By affinity chromatography a carboxypeptidase of M. oryzae was purified using the PCI protein, and subsequently characterized by mass spectrometry. This fungal protein came out to be a novel carboxypeptidase B (MoCPB) which was fully inhibited by PCI. Homology-based modelling revealed structural similarities between the predicted structure of the MoCPB and the crystal structure of insect carboxypeptidases. Overall, these results indicate that PCI exerts its antifungal activity through the inhibition of this particular fungal carboxypeptidase. In the second part of this work we demonstrated that constitutive expression of the Arabidopsis AtNPR1 gene in rice confers resistance against the fungal pathogens M. oryzae and F. verticillioides, and the bacterial pathogen Erwinia chrysantemi. The protection of AtNPR1 against M. oryzae is due to the priming expression of salicylic acid-responsive endogenous genes (PR1b, PR5, HR-6, PR10 and PBZ). Transgenic AtNPR1 rice plants grown in the greenhouse showed growth retardation, reduced height and smaller seeds than wild type plants. When transferred to plant growth chambers, AtNPR1 plants developed spontaneous lesions (lesion mimic phenotype) showing typical cellular markers of lesion formation, such as accumulation of superoxide ions and autofluorescent material in the cell walls. On the other hand, AtNPR1-expressing rice plants showed a higher susceptibility to infection by the Rice Yellow Mottle Virus (RYMV). Moreover, AtNPR1 negatively regulates the expression of genes playing a role in the plant response to salt and drought stress, namely the rab21, salT and dip1 genes, resulting in a higher sensitivity to both types of abiotic stress. These observations suggest that AtNPR1 has both positive and negative regulatory roles in mediating defence responses against biotic and abiotic stresses.

Es va avaluar l'eficiència de diferents tècniques d'aplicació de fitosanitaris quetenen la capacitat de reduir la contaminació ambiental: l'ajust de les condicionsd'aplicació amb polvoritzadors hidropneumàtics en plantacions de fruiters, elstúnels de polvorització per als fruiters i la vinya, els broquets d'injecció d'aire entractaments als fruiters i a l'arròs i els tractaments terrestres en lloc dels tractamentsaeris també a l'arròs.La metodologia utilitzada es va basar en la realització d'assaigs de camp per ala mesura de la distribució de la polvorització. Els experiments es van plantejard'acord amb un disseny de tres repeticions situades en una parcel·la de cultiu, ones va realitzar l'aplicació amb els diferents equips en les condicions de treballescollides en cada cas. Es van utilitzar dos tipus de traçadors: el colorant fluorescentsulfoflavina brillant i quelats metàl·lics de Fe, Zn, Mn i Cu. La deposició de lapolvorització sobre el cultiu resultant de cada aplicació es va mesurar bàsicament apartir de mostres de les mateixes fulles i les pèrdues fora de l'objectiu (directamental sòl o per deriva) amb col·lectors artificials, principalment papers de filtre en elcas de les pèrdues al sòl i netejadors de pipes i fil de plàstic per a la mesura de laderiva.L'avaluació dels resultats obtinguts es va realitzar amb tècniques estadístiquesd'anàlisi de la variància i amb d'altres específiques per al cas de la deriva o per tald'avaluar la deposició de producte a la vegetació dels fruiters. Els resultats permetenavaluar tant la capacitat de reducció de la contaminació de les tècniques dereducció de la deriva assajades com la qualitat de la distribució de la polvoritzaciósobre el cultiu. En general, en tots els casos hi va haver una reducció del risc decontaminació amb una bona qualitat de la distribució de la polvorització sobrel'objectiu.En concret, la reducció del cabal d'aire i l'increment de la velocitat de treballen els polvoritzadors hidropneumàtics per als fruiters van causar una reducció dela deriva, però també una disminució de la uniformitat de la distribució de producteen la vegetació. Els túnels de polvorització per a la vinya i els fruiters van eliminarquasi completament les pèrdues per deriva però amb l'inconvenient de mésdificultat en l'execució tractaments. Els broquets d'injecció d'aire en els fruiters ien l'arròs també van provocar una disminució de les pèrdues fora de l'objectiu,que va dependre tant del model concret de broquet utilitzat com de les condicionsambientals. La distribució del producte mesurada sobre els cultius en general vaser bona, amb risc de reducció de l'eficàcia respecte a les tècniques d'aplicacióhabituals només en alguns casos concrets. Finalment, els tractaments aeris a l'arròsvan suposar més risc de contaminació que els terrestres amb una distribució pitjordel producte sobre la vegetació. / Se evaluó la eficiencia de diversas técnicas de aplicación de fitosanitarios quetienen la capacidad de reducir la contaminación ambiental: el ajuste de las condicionesde aplicación con pulverizadores hidroneumáticos en plantaciones de frutales, los túneles de pulverización para los frutales y la viña, las boquillas deinyección de aire en tratamientos a los frutales y al arroz y los tratamientos terrestresen lugar de los tratamientos aéreos también en el arroz.La metodología utilizada se basó en la realización de ensayos de campo para lamedida de la distribución de la pulverización. Los experimentos se plantearon enbase a un diseño de tres repeticiones situadas en una parcela de cultivo, donde serealizó la aplicación con los diferentes equipos en las condiciones de trabajo escogidasen cada caso. Se utilizaron dos tipos de trazadores: el colorante fluorescentesulfoflavina brillante y quelatos metálicos de Fe, Zn, Mn y Cu. La deposición de lapulverización sobre el cultivo resultante de cada aplicación se midió básicamente apartir de muestras de las mismas hojas y las pérdidas fuera del objetivo (directamenteal suelo o por deriva) con colectores artificiales, principalmente papeles defiltro en el caso de las pérdidas en el suelo y limpiadores de pipas y hilo de plásticopara la medida de la deriva.La evaluación de los resultados obtenidos se realizó con técnicas estadísticas deanálisis de la varianza y con otras específicas para el caso de la deriva o con el finde evaluar la deposición de producto en la vegetación en los frutales. Los resultadospermiten evaluar tanto la capacidad de reducción de la contaminación de lastécnicas de reducción de la deriva ensayadas como la calidad de la distribución dela pulverización sobre el cultivo. En general, en todos los casos hubo una reduccióndel riesgo de contaminación con una buena calidad de la distribución de lapulverización sobre el objetivo.En concreto, la reducción del caudal de aire y el incremento de la velocidad detrabajo en los pulverizadores hidroneumáticos para los frutales causó una reducciónde la deriva, pero también una disminución de la uniformidad de la distribuciónde producto en la vegetación. Los túneles de pulverización para los frutales yla viña eliminaron casi completamente las pérdidas por deriva con el inconvenientede una mayor dificultad en la realización de los tratamientos. Las boquillas deinyección de aire en los frutales y en el arroz también provocaron una disminuciónde las pérdidas fuera del objetivo, que dependió tanto del modelo concreto de boquillautilizada como de las condiciones ambientales. La distribución de productomedida sobre los cultivos en general fue buena, con riesgo de reducción de la eficaciarespecto a las técnicas de aplicación habituales solamente en algunos casosconcretos. Finalmente, los tratamientos aéreos en el arroz implicaron más riesgo decontaminación que los terrestres con una peor distribución del producto sobre lavegetación. / The efficiency of several pesticide application techniques, which are able to reduceenvironmental pollution, was assessed: the adjustment of the applicationconditions of air-assisted sprayers in fruit orchards, tunnel sprayers for fruit orchardsand vineyards, air-injection nozzles for spray applications in fruit orchardsand rice and ground-based instead of aerial applications in rice paddies.The methodology was based on carrying out field trials to measure the spraydistribution. The experiments were planned in a three-replication basis. The replicationswere placed on a crop plot, where the spray applications with the mechanicalequipment, set up according to the selected working conditions, were carriedout. Two kinds of tracers were used: the fluorescent dye brilliant sulphoflavine andmetal chelates of Fe, Zn, Mn and Cu. The spray deposition on the crop from eachspray application was measured mainly by means of the same crop leaves, whereasoff-target spray losses -to the soil or drift- with artificial collectors, i.e. filter papersfor the spray losses to soil and pipe cleaners and plastic lines for drift measurement.Data assessment was made by means of statistical techniques based on theanalysis of the variance, but also by other specific techniques in the case of spraydrift or for the assessment of the spray deposit on the fruit tree canopy. The resultsallow to assess both the capability of the tested drift reduction application techniquesto decrease the pollution and the quality of the spray distribution throughoutthe crop canopy. In general, a reduction of the contamination hazard wasalways measured, together with a good quality of the spray distribution on thetarget.In short, an air-flow rate reduction together with an increase of the workingspeed in fruit orchards caused a reduction of the amount of spray drift, but also aworse spray deposit uniformity on the crop. The tunnel sprayers for fruit orchardsand vineyards reduced almost completely the spray drift losses but with the disadvantageof making the spray application more difficult to be carried out. The airinjectionnozzles produced a reduction of the off-target spray losses, depending asmuch on the nozzle model used than on the environmental conditions. The measuredspray deposit on the crops was rather good and only on few occasions thepossibility of a lower efficacy in relation to the conventional spray applicationtechniques was stated. Finally, aerial spraying in rice caused higher risk of spraycontamination than the ground-based applications, together with a worse spraydistribution on the crop.