Orientador: Carlos Roque Duarte Correia / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-21T17:32:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carpes_MarcosJoseSouza_M.pdf: 2501095 bytes, checksum: caf0cb2be69ac7f7693e443bebb9e89e (MD5) Previous issue date: 1996 / Mestrado

La presente tesis se basa en la síntesis y caracterización de nanopartículas del complejo interpolimérico quitosano-poliácido aspártico conteniendo isoniazida. El complejo interpolimérico quitosano-poliácido aspártico posee características apropiadas para cumplir el rol de vehículo polimérico de la droga antituberculosa isoniazida. Es biodegradable, biocompatible, no tóxico y posee grupos funcionales capaces de interactuar con la droga mediante enlaces puentes de hidrógeno entre los grupos N-H y O-H. La polisuccinimida (PSI) fue sintetizada por policondensación térmica del monómero DL-ácido aspártico, catalizada por ácido fosfórico. El poliácido aspártico fue sintetizado a partir de la hidrólisis básica del PSI. Estos polímeros fueron caracterizados por Espectroscopia Infrarroja (IR), Resonancia Magnética Nuclear (RMN), Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) y Difracción de Rayos X (DRX). Los pesos moleculares del PSI y del poliácido aspártico fueron determinados por Viscosimetría Capilar y Dispersión de Luz Estática (SLS), respectivamente. Quitosanos, extraídos de la pota (Dosidicus gigas), de diferentes pesos moleculares, fueron obtenidos por hidrólisis ácida y fueron caracterizados por IR, RMN, DRX, SEM y GPC (Cromatografía de Permeación por Gel). Las nanopartículas del complejo interpolimérico quitosano-poliácido aspártico y del encapsulamiento en solución coloidal fueron sintetizadas empleando la técnica de gelación ionotrópica, siendo las condiciones de síntesis agitación por una hora y a temperatura ambiente donde la solución del poliaspartato fue agregada sobre la solución del quitosano. La caracterización fue realizada por Microscopía de Transmisión Electrónica (TEM), Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) y Dispersión de Luz Dinámica (DLS). Las muestras sólidas obtenidas de las soluciones coloidales mencionadas anteriormente fueron obtenidas al secar dichas soluciones en placas petri a 20 ºC (encapsulamiento) y 40 ºC (complejo interpolimérico). La caracterización de los sólidos fue realizada por IR, DRX, Microscopía de Transmisión Electrónica por Barrido (STEM), SEM, cromatografía en capa fina (CCF) y Espectrometría de Masas por Ionización Electrospray (ESI/MS). La identificación y cuantificación, % de Eficiencia de Encapsulamiento y Carga, de isoniazida en el encapsulamiento sintetizado fue realizado mediante la técnica de Espectroscopia UV-Visible. La polisuccinimida y el poliaspartato de sodio poseen un peso molecular de 18,2 kDa y 8,11 kDa, respectivamente. Asimismo, los pesos moleculares de los quitosanos empleados en este trabajo se encuentran en el rango de 105 - 106 Da. Por otro lado, el grado de acetilación (GA) de la primera y segunda muestra de quitosano de alto peso molecular, determinado por RMN-1H, es 4 – 5 % y 14 %, respectivamente. El análisis TEM de la solución coloidal del complejo interpolimérico quitosano-poliácido aspártico y del encapsulamiento muestra el tamaño nano de las partículas, 60 - 209 nm y 25 - 134 nm, respectivamente. Asimismo, los análisis TEM y AFM muestran que el complejo interpolimérico quitosano-poliácido aspártico posee una morfología casi esférica, mientras que el encapsulamiento posee dos tipos de morfología, esférica y alargada. El análisis DLS de la solución coloidal del encapsulamiento con la relación en peso isoniazida/quitosano (mg/mg) 0,5 : 1 demuestra que el tamaño de las partículas es 148,5  1 nm, cuyo resultado no presenta mucha variación respecto al tamaño del complejo interpolimérico quitosano-poliácido aspártico, el cual es 142,1  2,9 nm. En el espectro ESI/MS del encapsulamiento se observa el pico 138 m/z perteneciente, posiblemente, al aducto M+H+ de la isoniazida. El análisis STEM del encapsulamiento, en estado sólido, demuestra que el tamaño de las partículas se encuentra en el rango nano de 100 a 300 nm. Las imágenes SEM del complejo interpolimérico y del encapsulamiento, en estado sólido, demuestran que el primero posee una morfología de granos con superficie rugosa y láminas corrugadas con superficie lisa, mientras que el encapsulamiento posee una morfología de granos con una región rica de filamentos largos y uniformes. De acuerdo al análisis SEM el complejo interpolimérico quitosano-poliácido aspártico liofilizado posee una morfología más compacta y dura que el complejo interpolimérico secado a 40 ºC en placas petri. El análisis UV-Visible demuestra que efectivamente la isoniazida se encuentra presente en el encapsulamiento. Siendo el porcentaje de eficiencia de encapsulamiento y eficiencia de carga, para el encapsulamiento con la relación isoniazida/quitosano (mg/mg) 0,5 : 1, de 5,30 - 5,81 % y 1,61-1,77 %, respectivamente.

Tese (doutorado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2011 / Bibliografia: f. 37-40 / Introdução: Apesar do aumento no número de transplantes de órgãos sólidos e no aumento da sobrevida do paciente, as infecções fúngicas, principalmente, a candidose, ainda representam uma grande ameaça aos pacientes imunocomprometidos. A modulação da virul / Introduction: In spite of the growing number of solid organ transplantations and the increase in patient survival, fungal infections, especially candidiasis, still poses a significant threat to immunocompromised patients. Modulation of Candida albicans vi

As infecções fúngicas se tornaram um grande problema de saúde pública, especialmente em ambientes hospitalares. Candida spp. são os principais patógenos em infecções fúngicas invasivas. A produção de aspartato proteases secretadas (Sapp) por Candida spp. pode estar relacionado com o aumento do número de infecções e resistência aos medicamentos. A produção de proteases é codificada por uma família de 10 genes SAP1-10, sendo SAP2 o gene mais comumente expresso em Candida albicans. A expressão de SAP4 está associada à produção de enzimas Sap4p e formação de hifas que podem contribuir para a invasão dos tecidos hospedeiros e destruição de macrófagos em processos infecciosos. Este trabalho avaliou a expressão dos genes SAP2 e SAP4 em C. albicans ATCC 10231 cultivadas na presença ou ausência de macrófagos e expostas a concentrações subinibitórias de fluconazol e anfotericina B. Candida albicans foi cultivada em ágar Sabouraud Dextrose a 37ºC por 24 h, e posteriormente em caldo carbono levedura base enriquecido com soro-albumina bovina (YCB-BSA), e na ausência ou presença de concentrações subinibitórias de fluconazol e anfotericina B. A linhagem celular monocítica humana de origem leucemia (THP-1) foi cultivada em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 μg/ml) a 37ºC, sob atmosfera de 5% de CO2 durante 10 dias. Para a indução da diferenciação das células, 106 monócitos foram cultivados em meio RPMI-1640 suplementado e forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) 100 nM durante 48 h. Foram utilizadas amostras de 5x106 C. albicans cultivadas na presença ou ausência de 106 macrófagos e expostas ou não a concentrações subinibitórias de antifúngicos. A amostras foram cultivadas em placas de cultura celular com 6 poços por 1 h a 37 °C, sob atmosfera de 5% de CO2. O RNA total foi extraído das amostras utilizando o reagente TRIzol®, após a purificação do RNA com DNase I, este foi convertido em cDNA, e, em seguida, a quantificação do gene SAP4 foi realizada por Reação em Cadeia de Polimerase quantitativa (qPCR) utilizando ACT1 como gene normalizador. Candida albicans cultivada na presença de macrófagos apresentou regulação positiva na expressão de SAP2 e SAP4 (p < 0,01), respectivamente, na ordem de 4,83 e 10,34 vezes maior se comparada com amostras da levedura cultivada sem contato com macrófagos. E ainda, a exposição de C. albicans a concentrações subinibitórias de fluconazol aumentou a expressão de SAP2 e diminuiu a expressão de SAP4, já a exposição da levedura a concentrações subinibitórias de anfotericina B diminuiu a expressão de SAP2 e SAP4. Os genes SAP2 e SAP4 são relacionados como fatores de virulência de C. albicans e sua expressão pode ser regulada pelo contato com fagócitos ou exposição a antifúngicos. Portanto, compreender a expressão desses genes na patogênese fúngica pode ajudar na pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento da candidíase, contribuindo assim para a redução da incidência de morbidade e mortalidade associada a infecções fúngicas. / Fungal infections have become a major public health problem especially in hospital settings. Candida spp. are considered the main pathogen in invasive fungal infections. The production of secreted aspartic proteinases (Sapp) by Candida spp. can be related to the increase in the number of infections and drug resistance. The production of proteinases is encoded by a family of 10 genes known as SAP1-10, of which, SAP2 is the most commonly expressed gene in Candida albicans. The expression of SAP4-6 is associated to the production of Sap4-6p enzymes and hyphae formation which can contribute to the invasion of host tissues and destruction of macrophages during infectious processes. This study evaluates SAP2 and SAP4 gene expression in C. albicans ATCC 10231 grown in the presence or absence of macrophages and exposed to subinibitory concentrations of fluconazole and amphotericin B. C. albicans was grown in Sabouraud Dextrose Agar for 24 h at 37ºC and after in yeast carbon base more 0.2% bovine serum albumin (YCB-BSA) in the absence or presence of subinibitory concentrations of Fluconazole and Amphotericin B. The human monocytic leukemia cell line (THP-1) was grown in RPMI-1640 Medium supplemented with 10% fetal bovine serum, penicillin (100U/ml) and streptomycin (100μg/ml) at 37 °C and atmosphere of 5% CO2 during 10 days. For the induction of cell differentiation, 106 cells were seeded in RPMI-1640 medium supplemented and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 100 nM for 48 h. The samples of 5x106 C. albicans were cultured in the presence or absence of 106 macrophages and these was exposed or not to subinibitory concentrations of antifungals. All samples were incubated in culture test plates with 6 flat-botton wells for 1 h at 37 °C and atmosphere of 5% CO2. Total RNA was extracted from the samples using TRIzol® reagent, after RNA purification with DNaseI it was converted to cDNA, and then, the relative quantification of the SAP4 gene was performed by Real-Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) using ACT1 gene as normalizing endogenous gene. Candida albicans grown in the presence of macrophages showed upregulation in the expression of SAP2 and SAP4 (p < 0.01), respectively, in the order of 4.83 and 10.34 fold higher as compared to yeast samples grown without contact with macrophages. Concerning exposure to antifungal agents, C. albicans exposed to subinhibitory concentrations of amphotericin B showed downregulation in expression of SAP2 and SAP4. However, the yeast's exposure to subinhibitory concentrations of fluconazole caused upregulation in SAP2 expression and downregulation in SAP4 expression. SAP2 and SAP4 genes are related to virulence factors of C. albicans and its expression can be regulated by contact with phagocytes or exposure to antifungals. Therefore, understanding the expression of these genes in fungal pathogenesis may aid in research and development of new drugs for treating candidiasis, thus contributing to reducing the incidence of morbidity and mortality associated with fungal infections. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:02:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 mariana_almeida_ioc_dout_2014.pdf: 10914971 bytes, checksum: 979497712c5a77cc8a8934caa85ef74e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os parasitos do gênero Leishmania, protozoários veiculados por insetos flebotomíneos e responsáveis pelas leishmanioses visceral e tegumentar, se encontram amplamente distribuídos pelo mundo. O potencial adaptativo destes protozoários é um reflexo da diversidade biológica do gênero Leishmania, em especial a espécie Leishmania (Viannia) braziliensis, que se encontra em diversos biomas acometendo diferentes animais e vetores de acordo com a região que se encontra. Os estudos biológicos e de expressão gênica de fatores de virulência do parasito são importantes para auxiliar na elucidação destes mecanismos de adaptação. Portanto este trabalho tem o objetivo de avaliar variações biológicas e na expressão de genes de proteinases de L. (V.) braziliensis, cepa MCAN/BR/1998/R619 e seus clones. Inicialmente foi realizada uma análise do genoma de L. (V.) braziliensis frente aos de L. (L.) infantum, L. (L.) major e L. (L.) mexicana, com o propósito de identificar características espécie-específicas que possam contribuir para compreender as diferenças fenotípicas ou de virulência entre as espécies estudadas. Foi observado que todos os cromossomos das quatro espécies apresentam genes de proteases em diferentes quantidades; alto grau de conservação entre os alelos de proteases; e as sequências dos genes de proteases dos parasitos não apresentam similaridade entre as de genes de proteases de mamíferos. Portanto, a análise dos genomas das Leishmania spp. indica uma grande diversidade de genes da protease nestas espécies Posteriormente foram obtidos clones da cepa em estudo oriundos de um único promastigota e avaliados seu comportamento in vitro e o potencial biológico destes parasitos na infecção experimental in vitro. A cepa em estudo reúne vários clones de parasitos e estas produzem padrões distintos de infecção in vitro de macrófagos de camundongos BALB/c; com produção de citocinas no sobrenadante de forma heterogênea. Algumas são menos indutoras de IL-1\03B2 e IL-6, e as citocinas TNF-\03B1 e IL-12p70, bem como o óxido nítrico, são induzidas de forma equilibrada pelos clones estudados. Uma análise de agrupamento permitiu a classificação de dois grupos distintos dos clones obtidos neste estudo. O conjunto de dados que mais influenciou para a definição destes grupos foi os relativos à infecção em macrófagos peritoneais murinos. Isto ressalta a possibilidade de haver outros marcadores, não contemplados neste estudo, que influenciam no sucesso da adaptação da cepa em estudo ao hospedeiro vertebrado. Também foi observado que os clones da cepa expressam diferentemente os genes das quatro classes de proteinases. Os amastigotas expressam mais proteinases que os promastigotas. Entre os promastigotas há maior expressão de aspártico e metaloproteinase enquanto que os amastigotas expressam mais metalo e serino proteinases. A diversidade da espécie vista entre isolados pôde ser comprovada também dentro de uma única cepa. O conjunto de resultados agrupados aqui enfatiza a capacidade da L. (V.) braziliensis utilizar a plasticidade de seu genoma para modular seu fenótipo e aumentar suas chances de sobrevivência nos hospedeiros / Parasites of the genus Leishmania are protozoans transmitted during the bite of female phlebotomines and are the causative agents of visceral or tegumentary leishmaniasis, presenting a worldwide distribution. The adaptative potential of these protozoa is a reflection of their biological diversity, especially that of the species Leishmania (Viannia) braziliensis, which is found in many biomes and affect different animals and vectors. Studies about the biology of parasites and their expression of virulence factor genes are important to help on the elucidation of their mechanisms of adaptation. Therefore, the purpose of this work is to evaluate the the biology and expression of protease genes of L. (V.) braziliensis, strain MCAN/BR/1998/R619, checking for variations among clones of this strain. Initially, we performed a comparative analysis of L. (V.) braziliensis genome against L. (L.) infantum, L. (L.) major and L. (L.) mexicana genomes to identify species-specific features that could potentially relate to characteristic phenotypic and virulence traits of the species. We could observe that protease genes are present in all chromosomes of the studied species, but in different frequencies. Additionally, a high degree of alleles conservation was noted, as well as a prominent distinction among the protease gene sequences of parasites and those of mammals, with no similarity detected. Thus, the analysis of genome of Leishmania spp. pointed to a great diversity of protease genes in these species. In an additional analysis, we obtained clones from single promastigotes isolated from L. (V.) braziliensis strain MCAN/BR/1998/R619 and evaluated their behaviors in vitro as well as their potential to cause infection in BALB/c macrophage cultures. Our results suggested that this strain is, in fact, composed by many clones with different characteristics, as they are able to promote distinct patterns of infection in macrophages in vitro, with a heterogenic production of cytokines by these cells. While some clones induced lower IL-1β or IL-6 production, TNF-α, IL-12p70 and nitric oxide production were homogeneously induced by the clones. A cluster analysis led to the classification of two distinct groups of clones in this study. Data analysis indicated that the capacity to promote infection in murine macrophages was the feature that most contributed to the clusters definition. However, the possibility remain that other features, no analyzed in the present study, could also play important roles regarding the success the studied strain’s adaptation to the vertebrate host. It was also observed that the clones differentially expressed genes related to the four main protease classes of Leishmania: cysteine, serine, metallo and aspartic-proteinases. Generally, the amastigotes expressed higher levels of proteinases-related mRNAs than promastigotes. Also, it was observed that promastigotes express more aspartic and metalloproteinases mRNAs, while amastigotes express more metallo and serine proteinases mRNAs. Therefore, a reflection of the features diversity already reported among isolates of L. (V.) braziliensis can also be noted among clones of a single strain. The results gathered herein emphasize the ability of L. (V.) braziliensis to apply its genome plasticity to modulate its phenotype and, thus, increase its odds to survive in the vertebrate host.

Sabe-se que a hemoglobina é uma rica fonte de peptídeos antimicrobianos (hemocidinas). A primeira hemocidina derivada da hemoglobina bovina caracterizada em carrapatos foi o peptídeo Hb33-61, que é ativo contra bactérias gram-positivas e fungos. Acredita-se que tais hemocidinas sejam geradas proteoliticamente no intestino do carrapato. Neste trabalho nós caracterizamos bioquimicamente uma catepsina D, designada BmAP. A análise da expressão gênica por qPCR mostrou que ela é expressa predominantemente no intestino. Através de LC-MS/MS, determinamos a especificidade de clivagem da BmAP utilizando Hb bovina, e verificamos que resíduos hidrofóbicos foram preferencialmente clivados nos subsítios P1 e P1. Também investigamos a especificidade de clivagem da catepsina L intestinal BmCL1, utilizando uma biblioteca combinatória de tetrapeptídeos e através de hemoglobinólise in vitro. A BmCL1 preferiu resíduos alifáticos no P2 e polares no P1 e P1. Além disso, hidrolisou a cadeia da Hb bovina entre A63/A64, gerando peptídeos com estrutura primária similar ao Hb 33-61. A hemoglobinólise com a BmAP e/ou BmCL1 resultou na formação de algumas hemocidinas, corroborando a hipótese do seu envolvimento na geração endógena de peptídeos antimicrobianos. / It is known that hemoglobin is a rich source of antimicrobial peptides (hemocidins). The first hemoglobin-derived hemocidin characterized in ticks was the peptide Hb33-61, which is active against Gram-positive bacteria and fungi. It is believed that hemocidins are endogenously generated in the tick gut. In this work we biochemically characterized a cathepsin D, designated BmAP. Expression analysis by qRT-PCR showed that it is expressed predominantly in the gut. Through LC-MS/MS, we determined the cleavage specificity of BmAP using bovine hemoglobin, and we verified that hydrophobic residues were preferentially cleaved at the subsites P1 and P1. We also investigated the cleavage specificity of the intestinal cathepsin L BmCL1, using a positional scanning synthetic combinatorial library and through in vitro hemoglobinolysis. BmCL1 preferred aliphatic residues at P2 and polar residues at P1 and P1. Also, it hydrolysed the subunit of bovine hemoglobin at A63/A64, generating peptides with a primary structure similar to Hb 33-61. Hemoglobinolysis with BmAP and/or BmCL1 resulted in the formation of some hemocidins, corroborating the hypothesis that these proteinases are involved in the endogenous generation of antimicrobial peptides

Hidróxidos Duplos Lamelares (HDLs), são materiais lamelares constituídos de camadas positivamente carregadas de um hidróxido misto de dois metais (um di e um trivalente), com ânions hidratados no domínio interlamelar. Apesar de serem potenciais adsorventes, o estudo da adsorção de aminoácidos sobre estes sólidos ainda não foi realizado. Este é importante, pois abre caminho para a aplicação de HDLs na remoção e recuperação de aminoácidos de soluções aquosas, provenientes de processos industriais. Este trabalho teve por objetivo estudar a adsorção e a sorção dos aminoácidos: Ácido Aspártico (Asp), Ácido Glutâmico (Glu) e Fenilalanina (Phe), a partir de soluções aquosas, em HDLs do sistema [Mg-Al-CO3], verificando o efeito de variáveis como temperatura, pH e força iônica (FI) do meio. O adsorvente foi preparado pelo método de coprecipitação a pH variável e caracterizado quanto à composição, organização estrutural, textura e morfologia. A adsorção de Asp, Glu e Phe no HDL não calcinado indicaram que não ocorre a substituição do ânion interlamelar (CO32-), mas sim a adsorção por interação do aminoácido com as cargas residuais na superfície do HDL. O processo mostrou uma grande dependência das variáveis estudadas. A adsorção de Asp e Glu tem comportamento semelhante, embora o aumento da força iônica, seja mais pronunciado em pH 7 para o Asp, e em pH 10 para o Glu. Sem aumento da força iônica, as isotermas atingem ou se aproximam do patamar de adsorção destes aminoácidos, e o aumento na temperatura diminui a quantidade máxima adsorvida. A adsorção de Phe apresentou comportamento similar aos anteriores, exceto pelo fato do aumento da força iônica causar uma diminuição na adsorção. Os resultados obtidos para a sorção no HDL calcinado mostraram que inicialmente o HDL é reconstituído contendo ânions OH- intercalados que são deslocados pelo aminoácido conforme a concentração deste aumenta. Neste caso, Asp e Glu também apresentaram comportamentos semelhantes: as isotermas atingem um patamar onde a sorção torna-se constante e o aumento da temperatura diminui a quantidade sorvida. Para a Phe, a quantidade sorvida é muito maior que para os demais e não se observa o patamar de sorção constante. A temperatura não causa alteração significativa na quantidade sorvida. Os resultados de remoção dos aminoácidos, obtidos para o HDL calcinado se mostraram mais eficientes do que àqueles observados no HDL não calcinado. / Layered Double Hydroxides (LDHs), are lamellar materials constituted of positively charged layers of two cations mixed hydroxide (a bi and a trivalent one), with hydrated anions in the interlayer domain. In spite of they being potential adsorbents, the study of the adsorption of amino acids on these solids has not been done yet. This is important, because it opens the perspective for the application of LDHs to remove and to recover amino acids from aqueous solutions, resultant from industrial processes. The aim of this work was to study the adsorption and the sorption of the amino acids: Aspartic Acid (Asp), Glutamic Acid (Glu) and Phenylalanine (Phe), from aqueous solutions, in [Mg-Al-CO3] LDHs, verifying the effect of the variables: temperature, pH and ionic strength of the medium. The adsorbent was prepared by the coprecipitation method and characterized with respect to their composition, structural organization, texture and morphology. The adsorption of Asp, Glu and Phe in LDH indicated that the substitution of the interlayer anion (CO32-) doesn\'t occur, but the adsorption process occurs by the interaction of the amino acid with the residual charges on the LDH surface. The process showed a dependence on the parameters studied. The adsorption of Asp and Glu presented similar behavior, although the ionic strength effect is more pronounced in pH 7 for Asp, and in pH 10 for Glu. Without the increase in ionic strength, the isotherms reach or approach a plateau, and the increasing in the temperature reduces the maximum amount adsorbed. The adsorption of Phe has similar behavior to the previous ones, except at higher ionic strength, in which a decrease in the adsorption was observed. The results for the sorption in calcined LDH showed that the LDH are reconstituted with the OH- anions intercalated at low amino acid concentrations. The intercalation of amino acid becomes important as their concentration increase. In this case, Asp and Glu also presented similar behaviors: the isotherms reach a plateau where the sorption becomes constant and the increase of the temperature reduces the amount of sorbed amino acid. For Phe, the amount sorbed is higher than those for the others amino acids and the plateau of constant sorption was not observed. The temperature doesn\'t cause any significant alteration in the sorbed amount. The results of removing the amino acids on calcined LDH showed to be more efficient than those observed for the adsorption in LDH.

Sabe-se que a hemoglobina é uma rica fonte de peptídeos antimicrobianos (hemocidinas). A primeira hemocidina derivada da hemoglobina bovina caracterizada em carrapatos foi o peptídeo Hb33-61, que é ativo contra bactérias gram-positivas e fungos. Acredita-se que tais hemocidinas sejam geradas proteoliticamente no intestino do carrapato. Neste trabalho nós caracterizamos bioquimicamente uma catepsina D, designada BmAP. A análise da expressão gênica por qPCR mostrou que ela é expressa predominantemente no intestino. Através de LC-MS/MS, determinamos a especificidade de clivagem da BmAP utilizando Hb bovina, e verificamos que resíduos hidrofóbicos foram preferencialmente clivados nos subsítios P1 e P1. Também investigamos a especificidade de clivagem da catepsina L intestinal BmCL1, utilizando uma biblioteca combinatória de tetrapeptídeos e através de hemoglobinólise in vitro. A BmCL1 preferiu resíduos alifáticos no P2 e polares no P1 e P1. Além disso, hidrolisou a cadeia da Hb bovina entre A63/A64, gerando peptídeos com estrutura primária similar ao Hb 33-61. A hemoglobinólise com a BmAP e/ou BmCL1 resultou na formação de algumas hemocidinas, corroborando a hipótese do seu envolvimento na geração endógena de peptídeos antimicrobianos. / It is known that hemoglobin is a rich source of antimicrobial peptides (hemocidins). The first hemoglobin-derived hemocidin characterized in ticks was the peptide Hb33-61, which is active against Gram-positive bacteria and fungi. It is believed that hemocidins are endogenously generated in the tick gut. In this work we biochemically characterized a cathepsin D, designated BmAP. Expression analysis by qRT-PCR showed that it is expressed predominantly in the gut. Through LC-MS/MS, we determined the cleavage specificity of BmAP using bovine hemoglobin, and we verified that hydrophobic residues were preferentially cleaved at the subsites P1 and P1. We also investigated the cleavage specificity of the intestinal cathepsin L BmCL1, using a positional scanning synthetic combinatorial library and through in vitro hemoglobinolysis. BmCL1 preferred aliphatic residues at P2 and polar residues at P1 and P1. Also, it hydrolysed the subunit of bovine hemoglobin at A63/A64, generating peptides with a primary structure similar to Hb 33-61. Hemoglobinolysis with BmAP and/or BmCL1 resulted in the formation of some hemocidins, corroborating the hypothesis that these proteinases are involved in the endogenous generation of antimicrobial peptides

Made available in DSpace on 2016-02-26T13:36:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 amanda_hammes_ioc_mest_2012.pdf: 2580577 bytes, checksum: c40f0f68c566ee77505a8966c14e2e8e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Uma família de enzimas do tipo aspartil proteases, conhecida como Plasmepsinas, tem sido descrita como alvo atrativo para pesquisa e desenvolvimento de novos compostos terapêuticos para o tratamento da malária. Isto se deve ao fato de que no vacúolo alimentar do parasita existem quatro Plasmepsinas ativas e a inibição destas impede que o parasita degrade a hemoglobina, sua fonte de nutrientes para crescimento e maturação. Sabendo-se que os parasitas Plasmodium falciparum spp. adquirem uma rápida resistência aos atuais fármacos antimalariais, se faz necessário que novos e mais efetivos fármacos sejam descobertos para tratamento desta doença. A área de planejamento de novos fármacos baseado em estrutura (Structure Based Drug Design - SBDD) é considerada estratégica pois se baseia em uma maior compreensão dos mecanismos de reconhecimento molecular através da utilização de métodos computacionais O objetivo deste trabalho foi estudar, através da identificação dos modos de ligação e da determinação da energia livre de ligação, uma nova série de compostos planejados pelo Departamento de Síntese Orgânica de Farmanguinhos-Fiocruz. Métodos de docking e dinâmica molecular foram combinados e mostraram vantagens na utilização conjunta dessas técnicas apresentando uma boa correspondência entre o valor de energia livre de ligação, calculado através do método LIE, e o valor da afinidade de ligação obtida experimentalmente para os compostos estudados. Os resultados foram satisfatórios pois mostraram que os métodos usados no estudo de interações receptor-ligante envolvendo moléculas da família de aspartil proteases são interessantes na determinação dos plausíveis modos de ligação dos protótipos no sítio de ligação do alvo molecular / A family of aspartyl proteases enzyme, known as Plasmepsins, has been described as attractive target for research and development of new therapeutic com pounds for treatment of malaria. This is because within the digestive vacuole of the parasite there exist four active Plasmepsins whose inhibition prevents these parasites to degrade the hemoglobin which is the source of nutrients for their growth and matu ration. Bearing in mind that the parasites of the genre Plasmodium falciparum spp . acquire a rapid resistance to the antimalarial drugs currently on the market, it is necessary that new and more effective compounds are discovered to treat the disease. The field of Structure Based Drug Design – SBDD is nowadays considered crucial because it relies on the profound understanding of the mechanisms of molecular recognition through the use of computational methods. Thus, the goal of this study was to identify th e binding modes and determining the free energy of binding of a new series of compounds planned by the Department of Organic Synthesis of Farmanguinhos – FIOCRUZ. The joint application of docking and molecular dynamics methodologies showed advantages in us ing these techniques together. The results presented a good correspondence between the calculated free energy values using the Linear Interaction Energy – LIE method of compounds and their experimental values. The results may be considered satisfactory in the context of this job and show that the approach here applied to study receptor - ligand interactions involving molecules of the aspartyl proteases family was adequate in determining the plausible binding modes of prototypes molecules in the target binding site

Hidróxidos Duplos Lamelares (HDLs), são materiais lamelares constituídos de camadas positivamente carregadas de um hidróxido misto de dois metais (um di e um trivalente), com ânions hidratados no domínio interlamelar. Apesar de serem potenciais adsorventes, o estudo da adsorção de aminoácidos sobre estes sólidos ainda não foi realizado. Este é importante, pois abre caminho para a aplicação de HDLs na remoção e recuperação de aminoácidos de soluções aquosas, provenientes de processos industriais. Este trabalho teve por objetivo estudar a adsorção e a sorção dos aminoácidos: Ácido Aspártico (Asp), Ácido Glutâmico (Glu) e Fenilalanina (Phe), a partir de soluções aquosas, em HDLs do sistema [Mg-Al-CO3], verificando o efeito de variáveis como temperatura, pH e força iônica (FI) do meio. O adsorvente foi preparado pelo método de coprecipitação a pH variável e caracterizado quanto à composição, organização estrutural, textura e morfologia. A adsorção de Asp, Glu e Phe no HDL não calcinado indicaram que não ocorre a substituição do ânion interlamelar (CO32-), mas sim a adsorção por interação do aminoácido com as cargas residuais na superfície do HDL. O processo mostrou uma grande dependência das variáveis estudadas. A adsorção de Asp e Glu tem comportamento semelhante, embora o aumento da força iônica, seja mais pronunciado em pH 7 para o Asp, e em pH 10 para o Glu. Sem aumento da força iônica, as isotermas atingem ou se aproximam do patamar de adsorção destes aminoácidos, e o aumento na temperatura diminui a quantidade máxima adsorvida. A adsorção de Phe apresentou comportamento similar aos anteriores, exceto pelo fato do aumento da força iônica causar uma diminuição na adsorção. Os resultados obtidos para a sorção no HDL calcinado mostraram que inicialmente o HDL é reconstituído contendo ânions OH- intercalados que são deslocados pelo aminoácido conforme a concentração deste aumenta. Neste caso, Asp e Glu também apresentaram comportamentos semelhantes: as isotermas atingem um patamar onde a sorção torna-se constante e o aumento da temperatura diminui a quantidade sorvida. Para a Phe, a quantidade sorvida é muito maior que para os demais e não se observa o patamar de sorção constante. A temperatura não causa alteração significativa na quantidade sorvida. Os resultados de remoção dos aminoácidos, obtidos para o HDL calcinado se mostraram mais eficientes do que àqueles observados no HDL não calcinado. / Layered Double Hydroxides (LDHs), are lamellar materials constituted of positively charged layers of two cations mixed hydroxide (a bi and a trivalent one), with hydrated anions in the interlayer domain. In spite of they being potential adsorbents, the study of the adsorption of amino acids on these solids has not been done yet. This is important, because it opens the perspective for the application of LDHs to remove and to recover amino acids from aqueous solutions, resultant from industrial processes. The aim of this work was to study the adsorption and the sorption of the amino acids: Aspartic Acid (Asp), Glutamic Acid (Glu) and Phenylalanine (Phe), from aqueous solutions, in [Mg-Al-CO3] LDHs, verifying the effect of the variables: temperature, pH and ionic strength of the medium. The adsorbent was prepared by the coprecipitation method and characterized with respect to their composition, structural organization, texture and morphology. The adsorption of Asp, Glu and Phe in LDH indicated that the substitution of the interlayer anion (CO32-) doesn\'t occur, but the adsorption process occurs by the interaction of the amino acid with the residual charges on the LDH surface. The process showed a dependence on the parameters studied. The adsorption of Asp and Glu presented similar behavior, although the ionic strength effect is more pronounced in pH 7 for Asp, and in pH 10 for Glu. Without the increase in ionic strength, the isotherms reach or approach a plateau, and the increasing in the temperature reduces the maximum amount adsorbed. The adsorption of Phe has similar behavior to the previous ones, except at higher ionic strength, in which a decrease in the adsorption was observed. The results for the sorption in calcined LDH showed that the LDH are reconstituted with the OH- anions intercalated at low amino acid concentrations. The intercalation of amino acid becomes important as their concentration increase. In this case, Asp and Glu also presented similar behaviors: the isotherms reach a plateau where the sorption becomes constant and the increase of the temperature reduces the amount of sorbed amino acid. For Phe, the amount sorbed is higher than those for the others amino acids and the plateau of constant sorption was not observed. The temperature doesn\'t cause any significant alteration in the sorbed amount. The results of removing the amino acids on calcined LDH showed to be more efficient than those observed for the adsorption in LDH.