Orientadora : Profª Drª Emanuel M. de Souza / Coorientador : Prof. Dr. Vivian Rotuno Moure / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 25/05/2017 / Inclui referências : f. 86-97 / Resumo: A fixação biológica de nitrogênio é catalisada pelo complexo enzimático nitrogenase. Este complexo contém duas metaloproteínas: as proteínas Fe e MoFe. Em Azospirillum brasilense, objeto deste estudo, a regulação pós-traducional envolve a modificação covalente de uma das subunidades da proteína Fe por ADP-ribosilação. Esta ADPribosilação inativa reversivelmente a proteína Fe e é catalisada pela dinitrogenase redutase ADP-ribosiltransferase (DraT) em resposta ao aumento de íons amônio ou depleção da energia celular. O grupo ADP-ribosil é removido pela dinitrogenase redutase glicohidrolase (DraG), promovendo reativação da proteína Fe e consequentemente, da nitrogenase. Em resposta ao aumento de íons amônio, as proteínas PII, assim como a proteína de membrana AmtB, estão envolvidas no sistema de regulação atuando principalmente por interação direta com proteínas alvo. No caso de A. brasilense, as proteínas PII são denominadas de GlnB e GlnZ e interagem com DraT e DraG, respectivamente, regulando suas atividades. Porém o mecanismo pelo qual estas enzimas são reguladas pelos níveis energéticos celulares não é totalmente conhecido. O objetivo deste trabalho foi contribuir para elucidação do mecanismo da regulação póstraducional da nitrogenase em condições de anaerobiose. Vários aspectos da regulação do metabolismo energético nesta bactéria foram estudados. Para avaliar o envolvimento de AmtB e GlnZ de A. brasilense na regulação da nitrogenase, foi realizado um ensaio de desligamento / religamento da nitrogenase por anaerobiose em mutantes nos respectivos genes. Os resultados mostraram que as proteínas GlnZ e AmtB não participam diretamente da regulação por ADP-ribosilação da nitrogenase. Análises de LC-MS dos níveis de ATP e ADP indicaram redução substancial quando a cultura foi exposta à anaerobiose. Além disso, a adição do desacoplador CCCP, que diminui o ATP intracelular, causou desligamento e ADP-ribosilação da nitrogenase. Portanto, razão ATP/ADP pode estar relacionada ao mecanismo de regulação da atividade da nitrogenase nessas condições. Análise das frações celulares mostrou que, diferentemente da regulação por íons amônio, as proteínas PII não vão para a membrana durante a ADP-ribosilação da nitrogenase. O mesmo ocorre com DraG que permanece no citoplasma. Os resultados sugerem a existência de diferentes vias para o controle da atividade da nitrogenase, que depende do estímulo ao qual as células são submetidas. Palavras-chave: Azospirillum brasilense, regulação pós-traducional, ADP-ribosilação da proteína Fe, sistema DraT/DraG, anaerobiose. / Abstract: The biological nitrogen fixation is catalyzed by a nitrogenase enzymatic complex. This complex contains two metalloproteins: the Fe and MoFe proteins and undergoes to post-translational modification. In Azospirillum brasilense, object of this study, this posttranslational regulation involves the covalent modification in one of the subunits of Fe protein by ADP-ribosylation. This ADP-ribosylation reversibly inactivates the Fe protein and is catalyzed by dinitrogenase reductase ADP-ribosyltransferase (DraT) in response to an increase of ammonium concentration or decrease of cellular energy. The ADP-ribosyl group is removed by dinitrogenase reductase glycohydrolase (DraG), promoting Fe protein and, consequently, nitrogenase re-activation. In response to increased ammonium ions, the PII proteins, as well as the NH3 - channel AmtB, are involved in the regulatory system acting primarily by direct interaction with the target proteins. In A. brasilense, the PII proteins are denominated GlnB and GlnZ and interact with DraT and DraG, respectively, regulating DraT and DraG activities. However, the mechanism by which these enzymes are regulated by cellular energy levels is not fully known. The goal of this study was to contribute to the elucidation of the mechanism of post-translational nitrogenase regulation under anaerobic conditions. Several aspects of energy metabolism regulation in this bacterium were studied. To evaluate the involvement of A. brasilense AmtB and GlnZ in the regulation system, switch-off / on assays of nitrogenase by anaerobiosis were performed. The results confirmed that GlnZ and AmtB proteins do not directly participate in ADP- ribosylation of nitrogenase. LC-MS analysis of ATP and ADP levels showed a marked reduction when the culture was exposed to anaerobic conditions. Furthermore, addition of CCCP, which decreases intracellular ATP, caused switch-off and ADP-ribosylation of nitrogenase. Therefore, the ATP / ADP ratio, lead nitrogenase switch-off. Analysis of the cellular fractions, showed that, unlike the regulation by ammonium ions, the PII proteins did not migrate to the membrane during nitrogenase switch-off, and DraG also remained in the cytoplasm. The results suggest distinct pathway for the control of nitrogenase activity depending on which stimulus the cells are submitted to. Key words: Azospirillum brasilense, post-translational regulation, ADP-ribosylation, DraT / DraG system, anaerobiosis.

Bactérias do gênero Azospirillum possuem a capacidade de promover o crescimento vegetal através de mecanismos que não estão claramente elucidados. Contudo, essa característica é muito estudada, tendo em vista a possibilidade de utilizar esses microrganismos na agricultura em detrimento do uso indiscriminado de fertilizantes industriais, que poluem o meio ambiente. O solo é um ambiente altamente variável quanto à disponibilidade de nutrientes e quanto a fatores físico-químicos, por isso, bactérias que ocupam esse nicho possuem um aparato genético capaz de prover uma adaptação plena a este ambiente. A bactéria A. amazonense tem um genoma altamente complexo e pouco estudado. O presente trabalho isolou genes envolvidos na resposta de A. amazonense ao estresse por limitação nutricional de nitrogênio, elemento crucial para a sobrevivência, já que compõe diferentes moléculas biológicas. Um dos objetivos deste trabalho foi o isolamento de genes que codificam proteínas PII em A. amazonense, que estão envolvidas na regulação do metabolismo do nitrogênio. A. amazonense apresenta dois genes parálogos que codificam para proteínas PII, glnB e glnK. Demonstramos que ambos são regulados pela disponibilidade de nitrogênio no meio. A região promotora de glnK possui elementos típicos de genes regulados pelo sistema Ntr: quatro sítios de ligação ao fator de transcrição NtrC e um promotor dependente de σ54. Foi identificada uma seqüência que corresponde a um promotor dependente de σ70 putativo sobreposto a um sítio de ligação a NtrC. O segundo objetivo foi isolar genes regulados pela disponibilidade de nitrogênio através da técnica Micro-RDA. Essa técnica é muito sensível, no entanto há poucos relatos da sua utilização em bactérias, visto provavelmente as dificuldades técnicas do trabalho com o mRNA bacteriano. Através desse procedimento, foram isolados oito genes envolvidos na resposta à limitação de nitrogênio. Sete deles apresentam homologia com genes de bactérias da classe Proteobacteria: dnaK e rpoH (genes que codificam proteínas envolvidas em choque térmico), relA (envolvido na síntese de ppGpp, um mediador da resposta “estringente”), um gene que codifica para uma diguanilato ciclase/fosfodiesterase (envolvido na síntese de c-di-GMP, envolvido na formação de biofilmes), um gene que codifica uma subunidade do complexo I da cadeia transportadora de elétrons, glnA (glutamina sintetase) e gltB (glutamato sintase). A variedade funcional desses genes ilustra o grau de complexidade da resposta de A. amazonense à limitação nutricional de nitrogênio. / Bacteria belonging to the Azospirillum genus are capable of promoting plant growth, but the mechanisms implicated in this feature are not clearly elucidated. This ability has been investigated by several research groups with the main objective of substitute the use of industrialized fertilizers by bacteria inoculation in the soil. The soil is a very dynamic enviroment, so bacteria have developed many genetic resources to survive in this environment. Azospirillum amazonense has a very complex genome and up till now is poorly analysed. This work has isolated different genes implicated in the nitrogen starvation response of A. amazonense. In the first part of this work we investigated the PII coding genes of A. amazonense, that are involved in nitrogen metabolism regulation. A. amazonense has two PII genes, glnK and glnB. Both are regulated by the nitrogen availability in the medium. The glnK regulatory region has typical elements of Ntr regulated genes: four NtrC UAS sequences (upstream activator binding site) and one σ54-dependent promoter. A putative σ70-dependent promoter, that overlaps the NtrC UAS sequence has been found. In the second part of this work we isolated nitrogen regulated genes by the Micro-RDA technique. This tecnique is very sensitive, but there are few reports of its applicability on bacterial species. This occurs probably due to the bacterial mRNA features. In our work we isolated eight nitrogen regulated genes through the micro-RDA procedure and seven of them have shown similarity to proteobacteria genes. The isolated sequences correspond to: dnaK and rpoH genes (implicated in heat shock response), relA gene (involved in stringent response), a diguanylate cyclase/phosphodiesterase gene (implicated in biofilm formation), a complex I subunit gene (electrons transport chain), glnA gene (glutamine syntethase) and gltB gene (glutamate synthase). The functional variability of these genes illustrates the complexity of the nitrogen starvation response of A. amazonense.

Ureases (ureia amido-hidrolases; EC 3.5.1.5) são enzimas níquel dependentes, amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas, que catalisam a hidrólise da ureia à amônia e a dióxido de carbono. Em plantas e fungos, as ureases são hexâmeros formados por subunidades idênticas. Em bactérias, as ureases são formadas por duas ou três subunidades distintas, como é o caso em Helicobacter pylori e Azospirillum brasilense, respectivamente. As bactérias do gênero Azospirillum são microrganismos diazotróficos (capazes de fixar nitrogênio atmosférico), encontrados no solo e em associação com raízes de plantas como o arroz, o trigo e o milho. A principal função da urease em plantas parece estar relacionada à reciclagem do nitrogênio, mas diversas atividades biológicas que independem da atividade ureolítica têm sido demonstradas, sugerindo que esta possa estar envolvida na defesa da planta contra insetos e fungos. A fim de estudar esta enzima, a primeira parte do trabalho objetivou obter a urease recombinante de Azospirillum brasilense FP2. Para isso, o inserto foi clonado no vetor pET-23a por recombinação homóloga in vivo. Seis aminoácidos mostraram-se diferentes, em relação a sequência de proteínas predita do A. brasilense sp245, o que parece diferença entre as cepas de A. brasilense sp245 e FP2. A expressão da enzima recombinante foi otimizada, seguida de purificação feita por cromatografia de afinidade a níquel. No segundo capítulo desse trabalho é apresentada a clonagem, a expressão do gene e a purificação de um peptídeo derivado da urease ubíqua de soja. Esse peptídeo, denominado soyuretox, é colinear com o jaburetox, uma peptídeo recombinante derivado da urease de Canavalia ensiformis. Dados prévios do nosso laboratório demonstram diversas propriedades biológicas do jaburetox, tais como atividade inseticida, capacidade de interagir com bicamadas lipídicas, efeito fungitóxico, dentre outras. Estudos comparativos com o soyuretox mostraram que esse peptídeo apresenta toxicidade para duas leveduras testadas, Candida tropicalis e Saccharomyces cerevisiae. / Urease (urea amidohydrolase, EC 3.5.1.5) are nickel-dependent enzymes widely distributed in bacteria, fungi and plants which catalyze the hydrolysis of urea to ammonia and carbon dioxide. In plants and fungi, ureases are hexamers formed by one type of subunit. In bacteria, ureases are formed by two or three distinct subunits, such as in Helicobacter pylori and in Azospirillum brasilense, respectively. Bacteria of the genus Azospirillum are diazotrophic (capable of fixing atmospheric nitrogen), found in the soil and in association with roots of plants such as rice, wheat and corn. The main function of urease in plants appears to be related to nitrogen recycling, but several biological activities that are independent of ureolytic activity have been demonstrated, suggesting that it may be involved in the defense of plants against insects and fungi. In order to study this enzyme, the first part of the study aimed to obtain the recombinant Azospirillum brasilense FP2 urease. For this end, the insert was cloned into the vector pET-23a by in vivo homologous recombination. Six amino acids were different in relation to the predicted protein sequence of A. brasilense sp245, which seems to difference among strains of A. brasilense sp245 and FP2. Expression of the recombinant protein was optimized, following purification by nickel affinity chromatography. Cloning, expression of the gene and purification of a peptide derived from soybean ubiquitous urease is presented in the second chapter of this work. This peptide, called soyuretox, aligns with jaburetox, a recombinant peptide derived from Canavalia ensiformis urease. Previous data from our laboratory have shown diverse biological properties for jaburetox, such as insecticidal activity, ability to interact with lipid bilayers, fungitoxic effects, among others. Comparative studies with soyuretox, showed that this peptide presents toxicity against yeast, Candida tropicalis and Saccharomyces cerevisiae.

A utilização massiva de fertilizantes químicos na agricultura tem efeitos perniciosos ao ambiente. As bactérias do gênero Azospirillum são amplamente estudadas, pois são capazes de promover o crescimento vegetal. Essa característica lhes confere potencial para serem utilizadas na agricultura como uma alternativa ecologicamente compatível. Embora a espécie Azospirillum amazonense seja menos conhecida, o estudo de sua biologia molecular poderia contribuir para a elucidação dos mecanismos envolvidos na promoção do crescimento vegetal. Na primeira parte deste trabalho, foram descritas ferramentas genéticas que podem facilitar o estudo da biologia molecular de A. amazonense. Métodos de conjugação e eletroporação foram otimizados utilizando vetores com origens de replicação de amplo espectro (pVS1 e pBBR1). Além disso, mutantes para o gene glnK foram gerados utilizando o sistema do vetor pK19MOBSACB. Finalmente, um protocolo de análise de promotores baseado na expressão de proteínas fluorescentes foi desenvolvido para permitir estudos de regulação gênica. Na segunda parte do trabalho, uma análise abrangente das características do draft do genoma de A. amazonense foi realizada. Essa espécie apresenta um repertório versátil de genes, crucial para seu modo de vida na rizosfera. Genes putativos relacionados com metabolismo de nitrogênio e de carbono, produção de energia, produção de fitormônio, transporte, quorum sensing, resistência a antibióticos, síntese de bacteriofitocromo, quimiotaxia e motilidade foram identificados. Os genes da fixação do nitrogênio e da nitrilase poderiam estar diretamente relacionados com a promoção do crescimento vegetal. A identificação de genes da RubisCO sugere que A. amazonense seja capaz de fixar carbono, característica do seu metabolismo antes desconhecida. Outro aspecto relevante é que alguns genes de A. amazonense, como os da nitrogenase e da RubisCO, são mais próximos filogeneticamente aos genes de membros da ordem Rhizobiales do que dos de espécies do mesmo gênero. / The massive use of chemical fertilizers in agriculture has harmful effects to the environment. Bacteria from the Azospirillum genus are widely studied, since they are able to promote plant growth. This feature gives them the potential to be used in agriculture as an ecologically compatible alternative. Although the Azospirillum amazonense is a lesserknown species, the study of its molecular biology could contribute to a better understanding of the mechanisms implicated in plant growth. In the first part of this study, genetic tools that can support the study of the molecular biology of A. amazonense were described. Conjugation and electrotransformation methods were established utilizing vectors with broad host-replication origins (pVS1 and pBBR1). Furthermore, glnK-specific A. amazonense mutants were generated utilizing the pK19MOBSACB vector system. Finally, a promoter analysis protocol based on fluorescent protein expression was optimized to aid genetic regulation studies on this bacterium. In the second part of this study a comprehensive analysis of the genomic features of this species was presented. The species A. amazonense presents a versatile repertoire of genes crucial for its plant-associated lifestyle. Genes of A. amazonense related to nitrogen/carbon metabolism, energy production, phytohormone production, transport, quorum sensing, antibiotic resistance, chemotaxis/motility and bacteriophytochrome biosynthesis were identified. Noteworthy genes were the nitrogen fixation genes and the nitrilase gene, which could be directly implicated in plant growth promotion, and the carbon fixation genes, which had previously been poorly investigated in this genus. One important finding was that some A. amazonense genes, like the nitrogenase genes and RubisCO genes, were closer phylogenetically to genes from Rhizobiales members than to those from species of its own order.

Ureases (ureia amido-hidrolases; EC 3.5.1.5) são enzimas níquel dependentes, amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas, que catalisam a hidrólise da ureia à amônia e a dióxido de carbono. Em plantas e fungos, as ureases são hexâmeros formados por subunidades idênticas. Em bactérias, as ureases são formadas por duas ou três subunidades distintas, como é o caso em Helicobacter pylori e Azospirillum brasilense, respectivamente. As bactérias do gênero Azospirillum são microrganismos diazotróficos (capazes de fixar nitrogênio atmosférico), encontrados no solo e em associação com raízes de plantas como o arroz, o trigo e o milho. A principal função da urease em plantas parece estar relacionada à reciclagem do nitrogênio, mas diversas atividades biológicas que independem da atividade ureolítica têm sido demonstradas, sugerindo que esta possa estar envolvida na defesa da planta contra insetos e fungos. A fim de estudar esta enzima, a primeira parte do trabalho objetivou obter a urease recombinante de Azospirillum brasilense FP2. Para isso, o inserto foi clonado no vetor pET-23a por recombinação homóloga in vivo. Seis aminoácidos mostraram-se diferentes, em relação a sequência de proteínas predita do A. brasilense sp245, o que parece diferença entre as cepas de A. brasilense sp245 e FP2. A expressão da enzima recombinante foi otimizada, seguida de purificação feita por cromatografia de afinidade a níquel. No segundo capítulo desse trabalho é apresentada a clonagem, a expressão do gene e a purificação de um peptídeo derivado da urease ubíqua de soja. Esse peptídeo, denominado soyuretox, é colinear com o jaburetox, uma peptídeo recombinante derivado da urease de Canavalia ensiformis. Dados prévios do nosso laboratório demonstram diversas propriedades biológicas do jaburetox, tais como atividade inseticida, capacidade de interagir com bicamadas lipídicas, efeito fungitóxico, dentre outras. Estudos comparativos com o soyuretox mostraram que esse peptídeo apresenta toxicidade para duas leveduras testadas, Candida tropicalis e Saccharomyces cerevisiae. / Urease (urea amidohydrolase, EC 3.5.1.5) are nickel-dependent enzymes widely distributed in bacteria, fungi and plants which catalyze the hydrolysis of urea to ammonia and carbon dioxide. In plants and fungi, ureases are hexamers formed by one type of subunit. In bacteria, ureases are formed by two or three distinct subunits, such as in Helicobacter pylori and in Azospirillum brasilense, respectively. Bacteria of the genus Azospirillum are diazotrophic (capable of fixing atmospheric nitrogen), found in the soil and in association with roots of plants such as rice, wheat and corn. The main function of urease in plants appears to be related to nitrogen recycling, but several biological activities that are independent of ureolytic activity have been demonstrated, suggesting that it may be involved in the defense of plants against insects and fungi. In order to study this enzyme, the first part of the study aimed to obtain the recombinant Azospirillum brasilense FP2 urease. For this end, the insert was cloned into the vector pET-23a by in vivo homologous recombination. Six amino acids were different in relation to the predicted protein sequence of A. brasilense sp245, which seems to difference among strains of A. brasilense sp245 and FP2. Expression of the recombinant protein was optimized, following purification by nickel affinity chromatography. Cloning, expression of the gene and purification of a peptide derived from soybean ubiquitous urease is presented in the second chapter of this work. This peptide, called soyuretox, aligns with jaburetox, a recombinant peptide derived from Canavalia ensiformis urease. Previous data from our laboratory have shown diverse biological properties for jaburetox, such as insecticidal activity, ability to interact with lipid bilayers, fungitoxic effects, among others. Comparative studies with soyuretox, showed that this peptide presents toxicity against yeast, Candida tropicalis and Saccharomyces cerevisiae.

Bactérias do gênero Azospirillum possuem a capacidade de promover o crescimento vegetal através de mecanismos que não estão claramente elucidados. Contudo, essa característica é muito estudada, tendo em vista a possibilidade de utilizar esses microrganismos na agricultura em detrimento do uso indiscriminado de fertilizantes industriais, que poluem o meio ambiente. O solo é um ambiente altamente variável quanto à disponibilidade de nutrientes e quanto a fatores físico-químicos, por isso, bactérias que ocupam esse nicho possuem um aparato genético capaz de prover uma adaptação plena a este ambiente. A bactéria A. amazonense tem um genoma altamente complexo e pouco estudado. O presente trabalho isolou genes envolvidos na resposta de A. amazonense ao estresse por limitação nutricional de nitrogênio, elemento crucial para a sobrevivência, já que compõe diferentes moléculas biológicas. Um dos objetivos deste trabalho foi o isolamento de genes que codificam proteínas PII em A. amazonense, que estão envolvidas na regulação do metabolismo do nitrogênio. A. amazonense apresenta dois genes parálogos que codificam para proteínas PII, glnB e glnK. Demonstramos que ambos são regulados pela disponibilidade de nitrogênio no meio. A região promotora de glnK possui elementos típicos de genes regulados pelo sistema Ntr: quatro sítios de ligação ao fator de transcrição NtrC e um promotor dependente de σ54. Foi identificada uma seqüência que corresponde a um promotor dependente de σ70 putativo sobreposto a um sítio de ligação a NtrC. O segundo objetivo foi isolar genes regulados pela disponibilidade de nitrogênio através da técnica Micro-RDA. Essa técnica é muito sensível, no entanto há poucos relatos da sua utilização em bactérias, visto provavelmente as dificuldades técnicas do trabalho com o mRNA bacteriano. Através desse procedimento, foram isolados oito genes envolvidos na resposta à limitação de nitrogênio. Sete deles apresentam homologia com genes de bactérias da classe Proteobacteria: dnaK e rpoH (genes que codificam proteínas envolvidas em choque térmico), relA (envolvido na síntese de ppGpp, um mediador da resposta “estringente”), um gene que codifica para uma diguanilato ciclase/fosfodiesterase (envolvido na síntese de c-di-GMP, envolvido na formação de biofilmes), um gene que codifica uma subunidade do complexo I da cadeia transportadora de elétrons, glnA (glutamina sintetase) e gltB (glutamato sintase). A variedade funcional desses genes ilustra o grau de complexidade da resposta de A. amazonense à limitação nutricional de nitrogênio. / Bacteria belonging to the Azospirillum genus are capable of promoting plant growth, but the mechanisms implicated in this feature are not clearly elucidated. This ability has been investigated by several research groups with the main objective of substitute the use of industrialized fertilizers by bacteria inoculation in the soil. The soil is a very dynamic enviroment, so bacteria have developed many genetic resources to survive in this environment. Azospirillum amazonense has a very complex genome and up till now is poorly analysed. This work has isolated different genes implicated in the nitrogen starvation response of A. amazonense. In the first part of this work we investigated the PII coding genes of A. amazonense, that are involved in nitrogen metabolism regulation. A. amazonense has two PII genes, glnK and glnB. Both are regulated by the nitrogen availability in the medium. The glnK regulatory region has typical elements of Ntr regulated genes: four NtrC UAS sequences (upstream activator binding site) and one σ54-dependent promoter. A putative σ70-dependent promoter, that overlaps the NtrC UAS sequence has been found. In the second part of this work we isolated nitrogen regulated genes by the Micro-RDA technique. This tecnique is very sensitive, but there are few reports of its applicability on bacterial species. This occurs probably due to the bacterial mRNA features. In our work we isolated eight nitrogen regulated genes through the micro-RDA procedure and seven of them have shown similarity to proteobacteria genes. The isolated sequences correspond to: dnaK and rpoH genes (implicated in heat shock response), relA gene (involved in stringent response), a diguanylate cyclase/phosphodiesterase gene (implicated in biofilm formation), a complex I subunit gene (electrons transport chain), glnA gene (glutamine syntethase) and gltB gene (glutamate synthase). The functional variability of these genes illustrates the complexity of the nitrogen starvation response of A. amazonense.

Orientador : Antonio Celso Novaes de Magalhães / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T20:46:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Didonet_AgostinhoDirceu_D.pdf: 8523062 bytes, checksum: 8287121de7a0cd18565e1db65fd106c4 (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: A utilização de bactérias promotoras do crescimento radicular (PGPR) do gênero Azospirillum, em associação com raízes de trigo, mostrou-se capaz de promover o crescimento da planta, aumentando a produtividade. O modo de ação pelo qual estas bactérias atuam no desenvolvimento radicular ainda não está perfeitamente esclarecido. Várias propostas têm sido encaminhadas na tentativa de explicar os fenômenos relacionados à promoção do crescimento por bactérias da rizosfera, dentre as quais a maior eficiência de absorção de nutrientes e de água, a Intensificação da fixação biológica do N2 e os efeitos de substâncias com atividade hormonal, são mais freqüentemente citadas. Isoladamente, nenhuma das opções descritas são suficientes para o esclarecimento dos mecanismos de ação destas bactérias na promoção do crescimento. No presente trabalho foram utilizadas três diferentes estirpes de Azospirillum: JA 03 - Azospirillum lipoferum e JA 04 - Azospirillum brasilense, Isoladas da região tritícola do Rio Grande do Sul; e a 245 - Azospirillum brasilense, utilizada como referência, em função dos seus já conhecidos efeitos. Experimentos iniciais, demonstraram que colônias da estirpe JA 03 apresentaram maior capacidade de multiplicação em temperaturas mais baixas (28 - 30°C), e produziram maior quantidade de ácido indolil-3-acétlco (IAA), tanto na presença quanto na ausência de 100 mg/l de triptofano, do que as estirpes JÁ 04 e 245. Além disso, a estirpe JÁ 03 demonstrou alta capacidade de utilizar nitrato para a respiração, em condições de baixa disponibilidade de oxigênio, acumulando até 800 mg/ml de nitrito no meio, sem afetar o seu crescimento. Esta quantidade de nitrito foi pelo menos 20 vezes superior ao produzido pelas demais estirpes testadas. A inoculação das sementes de trigo com estas estirpes, mostrou que todas induziram aumento no comprimento radicular de plântulas estioladas que variaram de 33,3 até 47,5%, em relação ao controle, e também causaram maior ramificação radicular (4,8 até 18,3%), com destaque para as plântulas inoculadas com a estirpe JA 03. Tendo em vista que estas bactérias colonizam a rizosfera e os espaços Intercelulares das raízes de plântulas Inoculadas, e que seus efeitos sobre o crescimento da raiz pressupõe Intensa atividade, o primeiro encaminhamento experimental foi dirigido ao estudo da ação da Inoculação na extrusão de prótons pelo sistema radicular. Nas situações testadas, a Inoculação com a estirpe JA 03 promoveu maior acidificação do meio de crescimento radicular (100,8%), além de apresentar menor sensibilidade à presença de orto-vanadato, um inibidor da atividade da H+-ATPase da plasmalema, em relação às plântulas não inoculadas. Considerando que um dos pré-requisitos conhecidos para a ocorrência de alongamento celular é a acidificação da parede celular (teoria do crescimento ácido), foi Investigado o fenômeno de extrusão de prótons associado ao efeito do IAA e também do nitrito, uma vez que a estirpe JA 03 apresenta capacidade de produzir ambas as substâncias em meio de cultura. A adição de IAA ou nitrito no meio de crescimento de raízes de plântulas de trigo provocou um aumento significativo da acidificação do ambiente das raízes, sendo que o efeito do IAA foi mais sensível à presença de orto-vanadato do que o do nitrito. Utilizando segmentos de raiz de plântulas de trigo, obtidos da região de alongamento radicular, foi possível demonstrar que a adição de IAA e de nitrito, na concentração de 10-7M, induziu aumento do crescimento do tecido, sendo que o efeito permaneceu até 48h após a incubação. Efeito similar foi demonstrado quando se utilizou o sobrenadante da estirpe JA03 crescida em meio contendo nitrato, que acumulou 363,6 mg/ml de nitrito, numa diluição que correspondeu a 0,8 x 10-7M de nitrito. O sobrenadante do meio de multiplicação desta bactéria, quando crescida em meio contendo amônia, não apresentou nenhum efeito no crescimento. A utilização de Procaína, um anestésico de ação local, adicionada no meio de Incubação dos segmentos de raiz, afetou em menor escala (cerca de 50%) o crescimento mediado por IAA, e quase totalmente o efeito mediado por nitrito. Esta ação, associada ao efeito do orto-vanadato, demonstrou a existência das duas fases de crescimento associadas ao efeito da auxina, e Indicou que o efeito do nitrito está associado à manutenção de um potencial transmembrana. A adição de trifluorperazina (TFP), um antagonista da Ca-calmodulina, Inibiu o crescimento dos segmentos tratados com IAA e nitrito, porém de forma mais pronunciada o efeito devido ao nitrito. Este efeito do TFP, indica, provavelmente, o envolvimento de mensageiros metabólicos específicos, tais como Ca2+ e eventualmente fosfoinositídeos (lP3), nas respostas ao crescimento mediado por IAA e nitrito. Além disso, a utilização de reagentes de grupamentos sulfidrílicos de proteínas com diferentes permeabilidades na membrana, como NEM (Netilmaleimida), diamida, laa (iodoacetamida) e p-HMB (p-hidroximercuribenzoato), sugerem que tanto a resposta devida à IAA como nitrito, estão associadas à proteínas com grupamentos SH essenciais. laa, NEM, diamida e p-HMB Inibiram o crescimento mediado por nitrito e afetaram parcialmente a resposta devida ao IAA. p-HMB anulou completamente o efeito de ambos IAA e nitrito. Nossos resultados sugerem que, aparentemente, os efeitos do IAA e nitrito no crescimento são comandados por diferentes mecanismos; enquanto IAA apresenta uma primeira fase de resposta, de curta duração, relacionada com o relaxamento da parede celular, e a segunda resposta, de longa duração, dependente da Incorporação de material de parede celular, o efeito do nitrito parece estar mais associado à resposta de longa duração, que também provoca relaxamento de parede celular / Abstract: Several experimental evidences have indicated that the association of the soil borne bacteria of the genus Azospirillum with wheat roots can promote plant growth. Inoculation of Azospirillum strains in etiolated wheat seedlings induced significant elongation of the primary root (one strain), in addition to lateral root differentiation (another strain). Our results suggest that the response of bacteria inoculation is probably associated with the capacity of some nitrate-grown bacteria strains to produce appreciable amounts of Indol Acetic Acid (IAA) and nitrite, the later being released into the external medium, particularly under the lower oxygen concentration prevailing In the rhyzosphere. The hormonal-like nitrite effects have been investigated, both In Intact seedlings and root segments. When the diffusate of bacteria medium was added to root segments active elongation occurred, the effect extending up to 24 hours or 48 hours of incubation. Comparable effects were observed as exogenous nitrite was supplied to the root medium, the maximum response measured at 10.7M concentration. Treatment with 10.7M IAA induced essentially the same response. The evaluation of the extent of acidification of the root medium showed that both IAA and nitrite cause proton extrusion, which was inhibited by orto-vanadate solely In the IAA-treated segments. IAA promotion of root elongation was inhibited by Procaine (a membrane depolarizing compound), nitrite-Induced root growth being less affected. The IAA-Induced growth response seems strictly dependent upon active H+ extrusion, whereas nitrite effect might the linked to the existing transmembrane potential. Incubation of the root segments with sulphydryl agents that present differential membrane permeation characteristics, such as lodoacetamlde (lAA), Nethylmaleimide (NEM), Diamide and p-hydroxymercurlobenzoate (p-HMB), suggested that both IAA and nitrite effects might be associated with SH-proteins. Nitrite induced growth was inhibited by lAA, NEM, Diamide and p-HMB, whereas IAA dependent elongation was affected to a lesser extent by the three former compounds; p-HMB completely abolished the growth response of both IAA and nitrite. The promotion of root growth by exogenously supplied IAA and nitrite decreased In segments treated with Trifluoperazine (TFP), a Ca-Calmodulin antagonist, the inhibition being more pronounced In the nitrite treatment. Our data suggest that nitrite an IAA effects are governed by somewhat distinct mechanisms: IAA Is particularly effective on the short-term growth response (181 response) In addition to the long-term growth response (2nd response), leading to wall loosening and matrix Incorporation, respectively. Nitrite affects longer-term events which also result In wall relaxation. The TFP effects probably indicate the requirement of specific metabolic messengers, such as Ca2+ and eventually Phospholnositldes-IP3 (Li+ effect), for hormonal-signaling root growth processes / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutor em Ciências Biológicas

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The present study was aimed at revealing the early signalling events during the interaction of the diazotrophic soil bacterium Azospirillum brasilense with its host plant Arabidopsis thaliana. Furthermore, taking advantage of the micro array technique, a comprehensive overview of Arabidopsis genes has been undertaken which are affected upon association with A. brasilense The characterization of the early responses of Arabidopsis plants upon inoculation with Azospirillum brasilense strain Sp7 clearly indicated parallels with the initial events in plant pathogen interaction. For instance, not only bacterial preprations (lysates) form Azospirillum elicited an apoplastic alkalinization of the culture medium, but also the live bacteria, which were even more effective. Besides, in a luminol based assay, the bacterial lysates triggered production of the reactive oxygen species (ROS) in the Arabidopsis leaf discs. Interestingly, the elongation factor receptor mutants (efr) were completely insensitive to Azospirillum, suggesting elongation factor Tu (EF-TU) recognition as elicitor by Arabidopsis. This hypothesis was further validated with a bioinformatic approach. The N terminus initial 26 amino acids from Azospirillum EF-TU gene (elf26) showed more similarity to the elf26 sequences of bacteria like Agrobacterium tumefaciens which elicit responses in the plants through EF-TU rather than Pseudomonas syringae where the potent elicitor is flagellin 22. Universal transcriptome profiling of Arabidopsis thaliana seedlings upon inoculation with Azospirillum brasilense over a time course of six, twenty four and ninty six hours revealed very little genetic responses in the early time points. However, a bulk of genes was differentially regulated in 96 hours post inoculation (96hpi). The nature of these genes indicated that the bacterial treatment, among others, greatly affect the processes like cell wall modification, hormone metabolism, stress and secondary metabolism. Additionally expression levels of a numer of transcription factors (TFs) related to basic helix loop helix (BHLH) and MYB domain containing TF families were altered with Azospirillum inoculation. Particularly the BHLH TFs were among the most highly regulated genes. The array results from Azospirillum treated plants were further compared with the already available data emnating from treatment with flagellin 22 (flg22), oligogalacturonides (OGs) and Agrobacterium tumefaciens. Noteworthy, very different set of genes were affected upon inoculation with Azospirillum in relation to other treatments. Secondly a cluster of proteins involved in the biosynthesis of aliphatic glucosinolates (GSL) were uniquely induced upon Sp7 exposure. Genes operating in flavonoid biosynthesis also showed a distinct regulation trend in the comparative analysis. Taken together, the study in question provides insights into the early signalling events in the context of Azospirillum-Arabidopsis association and the bacterial signals recognized by the plants. The array data, at the same time, elucidates the genetic factors of Arabidopsis triggered upon association with Azospirillum brasilense. / Die vorliegende Arbeit befasst sich mit den physiologischen und genetischen Reaktionen im Zuge der Interaktion von Arabidopsis thaliana mit dem freilebenden, Stickstoff-fixierenden Bodenbakterium Azospirillum brasilense. Qualitativ konnten gemeinsame Mechanismen der frühen physiologischen Antworten von Arabidopsis auf Lysate von mutualistischen (Azospirillum brasilense) oder pathogenen (Pseudomonas syringae und Agrobacterium tumefaciens) Mikroorganismen festgestellt werden. So reagierten Arabidopsis (Col-0 ) Pflanzen auf Lysate dieser Bakterien mit einem Anstieg der cytosolischen Calcium-Konzentration sowie des extrazellulären pH Werts, mit der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und einer Depolarisierung des Membranpotentials. Diese Antworten untschieden sich jedoch zum Teil erheblich in ihrer Amplitude. Weitere Untersuchungen konnten zeigen, dass Flagellenproteine von Azospirillum nicht durch Arabidopsis erkannt werden. Somit unterscheidet sich der Erkennungsmechanismus der Azospirillen von dem der Pseudomonaden, welche aufgrund ihrer Flagellenproteine durch den FLAGELLINSENSING-2 (FLS2) Rezeptor in Arabidopsis perzipiert werden. Die Arabidopsis Mutante ELONGATIONFACTOR RECEPTOR (efr) war insensitiv gegenüber Azospirillumlysaten. Dies legte nahe, dass die Erkennung von Azosprillum über eine Erkennung des bakteriellen Elongationsfaktors (EF-Tu) durch den EFR Rezeptor verläuft. Die anschließende Klonierung des Azospirillum EF-Tu Gens zeigte positionspezifische Unterschiede in der abgeleiteten Aminosäuresequenz gegenüber Referenzsequenzen aus Escherichia coli oder Agrobacterium tumefaciens und erklärt somit die „imperfekte“ Erkennung durch den EFR Rezeptor. Der zeitliche Verlauf der genetischen Antwort von Arabidopsis im Zuge der Interaktion mit Azospirillum wurde mit Hilfe „Micro-Array“ basierter Transkriptionansanalysen 6, 24 und 96 Stunden nach Inokulation (hpi) der Pflanzen untersucht. Dabei wurden nach 6 und 24 hpi lediglich 30 bzw. 60 differenziell regulierte Transkripte gefunden. Diese Beobachtung steht im Gegensatz zu Studien pathogener Elizitoren wie Flagellinen, in welchen bereits nach wenigen Stunden mehr als eintausend differenziell regulierte Transkripte in Arabidopsis gefunden wurden. Dieser Effekt konnte in den Interaktionsstudien mit Azospirillum erst nach 96 hpi beobachtet werden. Die Analyse der genetischen Antwort ergab, dass 96 hpi insbesondere Gene in ihrer Expression verändert waren, deren Produkte im Zusammenhang mit Zellwandmodifikationen, dem Hormonmetabolismus, der Stressanpassung sowie der sekundären Metabolismus stehen. Darüber hinaus konnten Gene aus der Familie der sog. „basic-helix-loop-helix“ und „MYB“ Transkriptionsfaktoren identifiziert werden, die einer spezifischen Regulation durch Azospirillum unterlagen. Die vergleichende Analyse der Araydaten mit Datensätzen, die im Zuge von Pathogen-Arabidopsis Interaktionen gewonnen wurden zeigte, dass insbesondere die Biosynthese von aliphatischen Glykosiden und Flavonolen eine typische Antwort der Pflanze auf die mutualistischen Azospirillum Bakterien darstellt. Die vorgestellte Arbeit liefert somit erste Erkenntnisse zur physiologischen und genetischen Antwort von Arabidopsis auf Azospirillum und ermöglicht die vergleichende Betrachtung dieser Antworten im Kontext der Interaktion von Pflanzen mit pathogenen Mikroorganismen. Die im Rahmen dieser Arbeit identifizierten, differenziell regulierten Gene bieten neue Ansatzpunkte zum vertieften Studium der Wechselwirkung von mutualistischen, wachstumsfördernden Bakterien mit höheren Pflanzen.