A terapia fotodinâmica antimicrobiana é uma promissora alternativa para sanificação de tecidos infectados. Entretanto, esta modalidade terapêutica apresenta diferenças quanto à sua eficiência sobre diferentes microrganismos, de acordo com sua morfologia e fisiologia. A associação de H2O2 e PDT pode aumentar a eficiência de ambos os tratamentos, principalmente em infecções provocadas por microrganismos Gram negativos. O objetivo deste trabalho é investigar o efeito antimicrobiano sinérgico existente na reação fotodinâmica em presença do peróxido de hidrogênio e esclarecer os mecanismos envolvidos neste processo fotobioquímico. O efeito fotodinâmico foi avaliado, in vitro, através da redução microbiana de três microrganismos: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans na presença e ausência de H2O2, resultando no aumento de eficiência quando associada ao H2O2. Para elucidar os mecanismos envolvidos no aumento da redução microbiana observada, foram avaliadas, por detecção direta e indireta, a produção de superóxido, radical hidroxila e oxigênio singleto na presença de H2O2 e em sua ausência. Os resultados mostraram que na presença de H2O2 ocorre uma supressão nos mecanismos fotoquímicos, resultado em uma menor produção de espécies reativas de oxigênio. Comparando-se a redução bacteriana em Escherichia coli provocada pelo uso das terapias em separado, ou agindo em conjunto, e confrontando a quantidade de fotossensibilizador captado pelo microrganismo após condicionamento com H2O2 e após PDT, os resultados indicam que os mecanismos de ação da associação PDT e H2O2 podem ser bioquímicos. Os resultados obtidos mostram que em associação com H2O2, a PDT antimicrobiana tem sua eficiência aumentada, produzindo maior redução microbiana em diferentes microrganismos, entretanto, a dinâmica de formação de espécies reativas de oxigênio na presença do peróxido mostrou menor eficiência, tanto para reação tipo I como para reação tipo II. A avaliação dos mecanismos bioquímicos envolvidos neste processo mostra que há um aumento da captação do fotossensibilizador pelo microrganismo após condicionamento prévio da célula com H2O2. / Antimicrobial photodynamic therapy is a promising approach for tissue disinfection. However, this therapy does not have the same efficiency over different microorganisms, according to their morphology and physiology. The use of PDT associated to H2O2 could be able to improve the efficiency of both therapies and achieve better results, mainly over Gram negative infections. The aim of this study is to demonstrate the antimicrobial effect in the photodynamic reaction in the presence of H2O2 and clarify the mechanisms involved in this photo-chemical-biological process. The photodynamic process was evaluated, in vitro, through the microbial killing of Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans in the presence and absence of H2O2. The association resulted in an improvement of the phototherapy when it was associated with H2O2. To elucidate the mechanisms responsible for the more efficient microbial killing, the process was directly and indirectly evaluated regard to the production of superoxide, hydroxyl radicals and singlet oxygen when the photosensitizer was in H2O or H2O2 solution. The results showed that in the presence of H2O2, the photo-chemical process was decreased and the production of reactive oxygen species was lower than expected. Comparing the microbial killing of Escherichia coli using the therapies alone or together and facing to the photosensitizer uptake after H2O2 incubation, the results indicated a biochemical mechanism instead a photochemical improvement. The data demonstrated that the association of H2O2 and antimicrobial PDT achieved higher microbial reduction over different microorganisms, but conversely than expected, the production of reactive oxygen species in the presence of H2O2 was lower for type I reaction and also for type II reaction. The evaluation of the biochemical mechanisms involved in this association showed an improvement in the photosensitizer uptake after previous conditioning of the cell with H2O2.

Avaliar os efeitos da terapia fotodinâmica sobre as funções motoras do sistema nervoso e a dura-máter utilizando os fotossensibilizadores ftalocianina de cloro-alumínio e azul de metileno. Materiais e Métodos: Foram utilizados 56 ratos machos da raça Wistar, divididos em dois grupos. Um grupo foi submetido ao tratamento com terapia fotodinâmica (PDT) e o outro como grupo controle, nos quais foram utilizados os fotosensibilizadores sem a sua foto ativação. Os fotossensibilizadores foram aplicados sobre a dura-máter, após a realização de laminectomia, ao nível da T10. Os métodos de avaliação empregados foram a escala de avaliação funcional de Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) e o estudo da dura-máter por meio da microscopia de luz. Resultados: Não foram observadas alterações nas atividades motoras dos animais submetidos à PDT, em relação ao grupo controle. As avaliações histológica e histopatológica não mostraram diferenças entre o grupo dos fotosensibilizadores ativados e o grupo controle, com relação ao processo inflamatório e à necrose tecidual. Conclusão: A PDT em conjunto com os fármacos fotossensibilizantes, ftalocianina de cloro-alumínio e azul de metileno não induziu efeitos neurotóxicos clínicos e/ou alterações histológicas sobre a dura-máter dos animais estudados. / To determine the effects of photodynamic therapy on motor functional activity and the dura mater using the photosensitizers aluminum chloride phthalocyanine and methylene blue. Material and Methods: Fifty-six male Wistar rats were divided into two groups, one submitted to photodynamic therapy (PDT) and the other submitted to the photosensitizers without their photoactivation (control). The photosensitizers were applied to the dura mater after laminectomy at the T10 level. The methods used for assessment were the Basso, Beattie and Bresnahan (BBB) functional evaluation scale and study of the dura mater by light microscopy. Results: No changes in motor activity were observed in the animals submitted to PDT compared to control. Histological and pathological evaluation did not show differences between the group exposed to activated photosensitizers and the control group regarding the inflammatory process and tissue necrosis. Conclusion: The joint use of PDT with the photosensitizing pharmaceuticals aluminum chloride phthalocyanin and methylene blue did not induce any clinical neurotoxic effects or histological changes in the dura mater of the animals studied.

Orientador: Nasser Ali Daghastanli / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2012

Orientadora: Rosangela Itri / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Nanociências e Materiais Avançados, 2013

O DNA é um alvo constante de modificações químicas, as quais resultam na ativação dos programas de reparo de danos no DNA. O DNA mitocondrial (DNAmt), uma molécula circular contendo aproximadamente 16,6 kb de extensão, é constantemente exposto às espécies reativas de oxigênio (EROs) devido a sua proximidade da cadeia transportadora de elétrons, presente na membrana mitocondrial interna. Quase todas as vias de reparo de DNA presentes no núcleo atuam também na mitocôndria, entretanto, a regulação das vias mitocondriais não é bem compreendida. As proteínas p53, ATM, mTOR e PGC1α participam, dentre outros papéis, do controle do metabolismo energético e das respostas a lesões no DNA nuclear. Dessa forma, decidimos gerar linhagens celulares com níveis reduzidos dessas proteínas como uma ferramenta para o estudo dos seus papéis na manutenção do DNAmt. Para isso, foram geradas linhagens celulares de HEK293 expressando constitutivamente shRNAs alvo-específicos, cuja diminuição da expressão das proteínas alvo foi confirmada através de western blotting. Neste trabalho, também foi estudado o papel de p53 na resposta ao estresse oxidativo mitocondrial provocado por azul de metileno (AM). O AM é um corante fotoativo capaz de atravessar membranas biológicas e, em células de mamíferos, se acumula em organelas, tais como a mitocôndria. Uma vez que p53 participa de diversas funções celulares e transloca para a mitocôndria sob condições de estresse, onde pode induzir apoptose ou modular o reparo de DNAmt, nós investigamos se p53 está envolvido na indução de morte celular após tratamento com AM fotoativado. Para isso, foram utilizados 2 clones com níveis reduzidos de p53 obtidos na primeira etapa deste trabalho. Sob condições normais, foi demonstrado que o silenciamento de p53 induziu uma forte redução do número de cópias de DNAmt e estimulou a proliferação celular quando fornecemos glicose ou galactose como substratos energéticos. A depleção de p53, ou a sua inibição farmacológica, resultaram em uma ligeira proteção quando as células foram submetidas ao tratamento com AM. Também foi demonstrado que AM provoca morte celular apoptótica de uma maneira dependente de p53, uma vez que a depleção dessa proteína protegeu a população do acúmulo de células em sub-G1. Portanto, nossos resultados sugerem que AM induz morte celular apoptótica em células HEK293, de uma maneira dependente de p53. Esse efeito pode ser mediado diretamente por p53, ou ainda, pelo seu papel na manutenção do número de cópias do DNAmt. / DNA is constantly being chemically modified, which results in activation of the DNA damage response program. The mitochondrial DNA (mtDNA), a circular molecule of 16.6 kb in length, is primary target of reactive oxygen species (ROS) due its proximity to the electron transport chain, in the mitochondrial inner membrane. Almost all known DNA damage repair pathways operating in the nucleus were also found in the mitochondrion; however, their regulation remains not well understood. The proteins p53, ATM, mTOR e PGC1α have many cellular functions, including control of energy metabolism and cell fate after stress. Thus, we hypothesized that those proteins could participate in maintaining of mtDNA, through direct or indirect roles. To test this hypothesis, we generated isogenic knockdown cell lines to further use them to study their role in the mtDNA damage response. For that, were generated HEK293 knockdown cell lines that stably express target-specific shRNAs. Efficient knockdown was checked using western blotting. Here, we also studied the role of p53 in the cellular response to mitochondrial oxidative stress induced by methylene blue (MB). MB is a photoactive dye that crosses biological membranes due to its lypophylic character and, in mammalian cells, accumulates in organelles such as mitochondria; however, its cytotoxic mechanism is not well understood. As the p53 protein participates in several cellular functions and translocates to mitochondria under stress conditions, where it can induce apoptosis or modulate mtDNA repair, we investigated whether p53 was involved in MB + light-induced cell death using p53 knockdown clones selected from the cell lines generated in the first phase of this work. Under normal conditions, p53 knockdown caused a decrease in mtDNA copy number and stimulated cellular growth supported by either glucose or galactose. After MB treatment, p53-kd cells showed a slight decrease in cell death compared to scrambled shRNA controls. Evaluation of cell death after MB treatment, using flow cytometry analysis, indicated that MB was able to induce significant levels of apoptotic cell death, which was dependent on p53 levels. Taken together, our results suggest that MB induces cell death, probably via apoptosis, in a p53 dependent manner. This effect may be mediated by p53 directly or by its role in mtDNA copy number maintenance.

O câncer de mama apresenta-se como um dos maiores problemas de saúde pública no mundo por ser, entre as mulheres, o primeiro em incidência e o segundo em número de óbitos. Este tipo de câncer apresenta alto grau de recorrência devido a falha no tratamento do tumor primário e o aparecimento de metástases da doença é a principal causa de mortalidade. As estratégias de tratamento nesse estágio não são específicas e comprometem a qualidade de vida das pacientes. A terapia fotodinâmica (PDT) aparece como uma alternativa terapêutica promissora. No entanto, a eficácia da PDT para o tratamento de tumores da mama, bem como os mecanismos que conduzem à morte celular permanecem obscuros. Para este propósito, neste estudo, nos propusemos a investigar mais profundamente os mecanismos moleculares envolvidos na morte celular induzida MB-PDT. Observou-se que a MB-PDT induz massiva morte celular em células tumorais preferencialmente. As células não-tumorigênicas foram significativamente mais resistentes à terapia em comparação com as células malignas. Análises morfológicas e bioquímicas das células em processo de morte apontou para mecanismos alternativos à apoptose clássica. A autofagia induzida por MB-PDT resultou em citoproteção ou citotoxicidade, dependendo do modelo de célula utilizado. No entanto, o comprometimento de uma destas vias não impediu o destino fatal das células tratadas com MB-PDT. Ao analisar os mecanismos de necrose regulada, observamos que a necroptose desempenhou um papel importante na morte celular induzida por MB-PDT. Adicionalmente, nossos resultados mostraram uma localização preferencial do MB nos lisossomos, o que nos levou a analisar o comprometimento destas organelas. Nós demonstramos por meio da atividade de catepsinas no citosol das células tratadas com MB-PDT, evidências de que a permeabilização da membrana lisossomal é outro mecanismo de necrose regulada responsável pelos efeitos citotóxicos da MB-PDT. Além de resistência à morte celular, as células tumorais também desenvolvem mecanismos de evasão do sistema imune. Neste estudo, também demonstramos que a MB-PDT tem o potencial de aumentar o número de células de linfócitos T CD4+. Por fim, também mostramos a eficácia da terapia em induzir morte celular seletiva às células tumorais em um modelo que recapitula a morfologia do epitélio glandular. Em resumo, demonstramos que vários mecanismos de morte celular são ativados por MB-PDT, uma vez que o comprometimento de uma via de morte celular não impediu o destino fatal das células tratadas com MB-PDT. No geral, os resultados obtidos nesta tese apontam a MB-PDT como uma terapia alternativa e eficaz para o tratamento do câncer de mama, exibindo uma ação de amplo espectro em células com diferentes mecanismos de resistência a vias de morte celular clássica, uma propriedade fundamental para uma terapia contra o câncer. Finalmente, as nossas observações destacam o potencial de MB-PDT como uma estratégia altamente eficaz para tratar o câncer de mama com segurança e possivelmente outros tipos de tumores. / Breast cancer is the main cause of mortality among women presenting high recurrence due to primary treatment failure. Photodynamic therapy (PDT) appears as a promising therapeutic alternative. However, the efficacy of PDT to treat breast tumors as well as the mechanisms that lead to tumorigenic cell death remain unclear. For this purpose, in this study, we set out to deeper investigate the molecular mechanisms involved in MB-PDT induced cell death. We observed that MB-PDT differentially induces massive cell death of tumor cells. Non-malignant cells were significantly more resistant to the therapy compared to malignant cells. Morphological and biochemical analysis of dying cells pointed to alternative mechanisms rather than classical apoptosis. MB-PDT-induced autophagy resulted in either cytoprotection or cytotoxicity depending on the cell model used. However, impairment of one of these pathways did not prevent the fatal destination of MB-PDT treated cells. When analyzing regulated necrosis mechanisms, we observed that necroptosis played an important role in MB-PDT-induced cell death. Additionaly, our results have shown preferential lysosomal MB localization. Furthermore, we have also presented evidences that the lysosome membrane permeabilization is another regulated necrosis mechanism responsible for MB-PDT cytotoxic effects. It is known that in addition to resistance to tumor cell killing therapies, malignant cells develop molecular mechanisms in order to evade the immune system. In this study, we have also been able to show that the MB-PDT has the potential to increase the number of T lymphocytes CD4+. Additionally, when using a physiological 3D culture model that recapitulates relevant features of normal and tumor breast tissue morphology, we found that MB-PDT differential action in killing tumor cell was even higher than what was detected in 2D cultures. In summary, we demonstrated that different cell death mechanisms are being activated upon MB-PDT induction, since impairment of only one cell death pathway did not prevent the fatal destination of MB-PDT treated cells. Overall, our observations point MB-PDT as an alternative and effective therapy for breast cancer treatment, displaying a broad-spectrum action on tumors with different resistance mechanisms to classic cell death pathways, a desired property for improving an anticancer therapy. Finally, our observations underscore the potential of MB-PDT as a highly efficient strategy to safely treat breast cancer and possibly other types of tumors.

Esta tese apresenta uma proposta para caracterização da fração fina de solos tropicais, baseada na superfície específica dos argilo-minerais nela presentes. A partir da superfície específica, determinada pela adsorção do corante azul de metileno, são estabelecidos graus de atividade para os solos analisados. Essa atividade é então comparada com a previsão de comportamento dos solos, obtida da classificação MCT (Miniatura, Compactado e Tropical). Para tanto, é feita uma avaliação dos fatores que influem nos ensaios de adsorção de azul de metileno (método da mancha) e, são comparados, exaustivamente, para 297 amostras de solos, os resultados da adsorção de azul de metileno com a previsão de comportamento dada pela MCT. Conclui-se que a utilização da adsorção de azul de metileno é promissora para a caracterização da fração fina de solos tropicais, permitindo estabelecer, com razoável segurança, a atividade dos argilo-minerais presentes e que existe uma boa concordância entre os resultados da adsorção de azul de metileno e os fornecidos pela classificação MCT. / A strategy to identify the thin fraction of tropical soils, based on the specific surfaces of its clay minerals, is presented in this work. The specific surface, obtained through the adsorption of methylene blue, helps to establish the activity levels of the studied soils. These levels are compared with the expected behavior of the same soils, obtained from the MCT classification (Miniature, Compacted, Tropical). The factors that can affect the adsorption tests made with methylene blue (using the spot test) are evaluated and 297 soil samples are exhaustively tested and compared with the expected behavior defined in the MCT classification. The main conclusion of the work is that the activity levels found with methylene blue adsorption seem to be a promising strategy for the identification of the thin fraction of tropical soils. It helps to assert, with a good degree of confidence, the activity levels of the mineral clay portions, showing a good agreement with the results of the MCT classification.

O presente trabalho descreve o preparo, a caracterização e o uso de eletrodo modificado com polímero de azul de metileno (PMB) imobilizado sobre a superfície de eletrodo de carbono vítreo (GCE-PMB) na análise do herbicida glifosato. O método utilizado para a preparação dos filmes do PMB foi a eletropolimerização. Os filmes preparados por este método apresentam características diferenciadas tais como robustez, estabilidade e propriedade redox satisfatória. As condições experimentais otimizadas foram a velocidade de varredura (50 mV s-1), o intervalo de potencial (-0,4 a +1,2 V), o número de ciclos (30) e o pH da solução do eletrólito suporte (pH 8). A solução de eletrólito suporte foi preparada a partir das soluções de tampão fosfato (0,05 mol L-1) e NaNO3 (0,1 mol L-1), pH 8. A mesma foi utilizada no preparo da solução de azul de metileno (MB) (0,25 x 10-3 mol L-1), no pré-tratamento do eletrodo de carbono vítreo (GC) por voltametria cíclica (CV) e no preparo de soluções para os estudos iniciais com o GCE-PMB. O pré-tratamento da superfície do eletrodo de GC foi realizado aplicando + 0,9 V por 240 s seguido de várias varreduras cíclicas de -0,4 a +1,0 V com velocidade de varredura de 50 mV s-1 até obter um perfil estável do voltamograma do eletrodo. Após o preparo do GCE-PMB, a atividade eletrocatalítica do eletrodo foi investigada para o Ácido Ascórbico (AA) e a L-Cisteína (L-Cys) por CV de -0,4 a +0,6. Foi observado aumento da corrente de pico e diminuição do sobrepotencial em relação ao eletrodo de GC. Nos estudos na presença do glifosato, o GCE-PMB apresentou resposta eletroquímica direta, por voltametria cíclica, para o glifosato (1,0 x 10-3 mol L-1) em solução de KCl 0,1 mol L-1 (pH 5,3) de -0,4 a +0,6 V e velocidade de varredura 50 mV s-1. A resposta voltamétrica apresentou picos anódico e catódico em 0,2 e 0, respectivamente. Para os estudos realizados por meio da técnica de voltametria de onda quadrada (SWV), os parâmetros freqüência, amplitude e incremento de varredura foram otimizados. A partir desses estudos foi possível obter informações relevantes sobre a interação do GCE-PMB com o glifosato. Os resultados mostraram que é possível observar a eletroatividade do herbicida glifosato sobre uma superfície eletródica sem a presença de metais como agentes complexantes. / This work describes the preparation, characterization and the use of the modified electrode with methylene blue polymer (PMB) immobilized onto the surface of glassy carbon electrode (GCE-PMB) in the analysis of the herbicide glyphosate. Concerning the methodology aspects, the method used for the preparation of the films PMB was the electropolymerization. The films prepared by this method present a differentiated characteristic such as robustness, stability and good redox properties. The optimized experimental conditions are the scan rate (50 mV s-1), the potential range (-0.4 to +1.2 V), the number of cycles (30) and the pH of the supporting electrolyte (pH 8). The supporting electrolyte solution was prepared from phosphate buffer solutions (0.05 mol L-1) and NaNO3 (0.1 mol L-1), pH 8. The same solution was used to prepare the solution of methylene blue (MB) (0.25 x 10-3 mol L-1), the pretreatment of the GC electrode by cyclic voltammetry (CV). It was also utilized in preparing solutions for the initial studies with GCE-PMB. The pre-treatment of the electrode surface of GC was performed, considering 0.9 V during 240 s, followed by several cyclic scans from -0.4 to 1.0 V (with scan rate of 50 mV s-1) until a stable profile of the voltammogram. After preparing the GCE-PMB, electrocatalytic activity it was investigated for Ascorbic Acid (AA) and L-Cysteine (L-Cys) by CV from -0.4 to +0.6 V. It was observed increase in peak current and decrease the overpotential comparing to glassy carbon electrodes. The GCE-PMB presented direct electrochemical response, for glyphosate (1 x 10-3 mol L-1) in KCl 0.1 mol L-1 (pH 5.3) from -0.4 to +0.6 V and scan rate 50 mV s-1. The voltammetric response showed anodic and cathodic peaks in 0.2 and 0, respectively. Using the square wave voltammetry (SWV), the parameters frequency, amplitude and scan increment were optimized. It was possible to find relevant information about the interaction between GCE-PMB and glyphosate. These results showed that is possible observe the electroactivity of glyphosate on a modified electrodic surface in absence of metals or complexing agents.

O DNA é um alvo constante de modificações químicas, as quais resultam na ativação dos programas de reparo de danos no DNA. O DNA mitocondrial (DNAmt), uma molécula circular contendo aproximadamente 16,6 kb de extensão, é constantemente exposto às espécies reativas de oxigênio (EROs) devido a sua proximidade da cadeia transportadora de elétrons, presente na membrana mitocondrial interna. Quase todas as vias de reparo de DNA presentes no núcleo atuam também na mitocôndria, entretanto, a regulação das vias mitocondriais não é bem compreendida. As proteínas p53, ATM, mTOR e PGC1α participam, dentre outros papéis, do controle do metabolismo energético e das respostas a lesões no DNA nuclear. Dessa forma, decidimos gerar linhagens celulares com níveis reduzidos dessas proteínas como uma ferramenta para o estudo dos seus papéis na manutenção do DNAmt. Para isso, foram geradas linhagens celulares de HEK293 expressando constitutivamente shRNAs alvo-específicos, cuja diminuição da expressão das proteínas alvo foi confirmada através de western blotting. Neste trabalho, também foi estudado o papel de p53 na resposta ao estresse oxidativo mitocondrial provocado por azul de metileno (AM). O AM é um corante fotoativo capaz de atravessar membranas biológicas e, em células de mamíferos, se acumula em organelas, tais como a mitocôndria. Uma vez que p53 participa de diversas funções celulares e transloca para a mitocôndria sob condições de estresse, onde pode induzir apoptose ou modular o reparo de DNAmt, nós investigamos se p53 está envolvido na indução de morte celular após tratamento com AM fotoativado. Para isso, foram utilizados 2 clones com níveis reduzidos de p53 obtidos na primeira etapa deste trabalho. Sob condições normais, foi demonstrado que o silenciamento de p53 induziu uma forte redução do número de cópias de DNAmt e estimulou a proliferação celular quando fornecemos glicose ou galactose como substratos energéticos. A depleção de p53, ou a sua inibição farmacológica, resultaram em uma ligeira proteção quando as células foram submetidas ao tratamento com AM. Também foi demonstrado que AM provoca morte celular apoptótica de uma maneira dependente de p53, uma vez que a depleção dessa proteína protegeu a população do acúmulo de células em sub-G1. Portanto, nossos resultados sugerem que AM induz morte celular apoptótica em células HEK293, de uma maneira dependente de p53. Esse efeito pode ser mediado diretamente por p53, ou ainda, pelo seu papel na manutenção do número de cópias do DNAmt. / DNA is constantly being chemically modified, which results in activation of the DNA damage response program. The mitochondrial DNA (mtDNA), a circular molecule of 16.6 kb in length, is primary target of reactive oxygen species (ROS) due its proximity to the electron transport chain, in the mitochondrial inner membrane. Almost all known DNA damage repair pathways operating in the nucleus were also found in the mitochondrion; however, their regulation remains not well understood. The proteins p53, ATM, mTOR e PGC1α have many cellular functions, including control of energy metabolism and cell fate after stress. Thus, we hypothesized that those proteins could participate in maintaining of mtDNA, through direct or indirect roles. To test this hypothesis, we generated isogenic knockdown cell lines to further use them to study their role in the mtDNA damage response. For that, were generated HEK293 knockdown cell lines that stably express target-specific shRNAs. Efficient knockdown was checked using western blotting. Here, we also studied the role of p53 in the cellular response to mitochondrial oxidative stress induced by methylene blue (MB). MB is a photoactive dye that crosses biological membranes due to its lypophylic character and, in mammalian cells, accumulates in organelles such as mitochondria; however, its cytotoxic mechanism is not well understood. As the p53 protein participates in several cellular functions and translocates to mitochondria under stress conditions, where it can induce apoptosis or modulate mtDNA repair, we investigated whether p53 was involved in MB + light-induced cell death using p53 knockdown clones selected from the cell lines generated in the first phase of this work. Under normal conditions, p53 knockdown caused a decrease in mtDNA copy number and stimulated cellular growth supported by either glucose or galactose. After MB treatment, p53-kd cells showed a slight decrease in cell death compared to scrambled shRNA controls. Evaluation of cell death after MB treatment, using flow cytometry analysis, indicated that MB was able to induce significant levels of apoptotic cell death, which was dependent on p53 levels. Taken together, our results suggest that MB induces cell death, probably via apoptosis, in a p53 dependent manner. This effect may be mediated by p53 directly or by its role in mtDNA copy number maintenance.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:56:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 910904 bytes, checksum: c726c0e05bf38f910085210325321242 (MD5) Previous issue date: 2010-08-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Candida species are part of the commensal microbiota of the oral cavity of most healthy individuals. The emergence of new species of Candida and the selection of lines tolerant to conventional antifungal agents stimulates the development of new therapies for the treatment of infections caused by species of Candida. In this context stands the photodynamic therapy (PDT) which is capable of killing fungal cells by administration of a photosensitizing substance followed by the application of light in the visible wavelength. This study evaluated, in vitro, the efficacy of PDT in photoinactivation of Candida species (C. albicans, C. krusei, C. tropicalis and C. guilhermondii) using the photosensitizing agent methylene blue (150&#956;g/ml) and irradiation with a diode laser operating in the visible red (&#654;660nm, 40mW). Initially, the tested microorganisms were inoculated in test tubes containing liquid culture medium and incubated overnight at 37°C. Then cell s uspensions were obtained containing 106 cfu / ml. These suspensions were transferred to 96-holes plates and exposed to 03 doses of laser light (Group 1- 60J/cm2 (2,4J), Group 2- 120J/cm2 (4,8J), Group 3-180J/cm2 (7,2J)). Additional suspensions were treated with only the photosensitizer, with only the laser light or with 0.85% saline (control group). Each experimental condition was performed twice. After the treatments, 1&#956;l aliquots of the suspensions were plated on Sabouraud Dextrose Agar. The plates were incubated at 37°C for 24-48h and after this period there was the counting of colonies (cfu / ml). The three doses evaluated determined significant inactivation of Candida spp. (P <0.05). The 180J/cm2 dose was the most effective, inactivating 78% of cfu/ml followed by doses of 120J/ cm2 and 60J/cm2 with inactivation average of 62% and 42% respectively. A statistically significant difference between the rates of inactivation of C. albicans, C.krusei, C. tropicalis and C. guilhermomdii at doses of 60 J/cm2 and 120 J/cm2 (p> 0.05) was not verified. However, at a dose of 180 J/cm2 C. albicans was the most susceptible species to the effects of PDT. We conclude that photodynamic therapy (PDT) has demonstrated effectiveness in the inactivation of Candida spp. / As espécies de Candida fazem parte da microbiota comensal da cavidade bucal da maioria dos indivíduos saudáveis.. A emergência de novas espécies de Candida e a seleção de linhagens tolerantes aos antifúngicos convencionais estimula o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para o tratamento das infecções causadas por espécies de Candida.Nesse contexto destaca-se a terapia fotodinâmica (TFD) que é capaz de eliminar células fúngicas através da administração de uma substância fotosensibilizadora seguido da aplicação de luz em comprimento de onda visível e compatível. Este estudo avaliou, in vitro, a eficácia da TFD na fotoinativação de espécies do gênero Candida (C. albicans, C. krusei, C. tropicalis e C. guilhermondii) por meio do agente fotossensibilizador azul de metileno (150&#956;g/ml) e da irradiação com um Diodo Laser (660nm, 40mW)). Inicialmente os microrganismos avaliados foram inoculados em tubos de ensaio contendo meio de cultura líquido e incubados overnight a 37°C. Em seguida foram obtidas suspensões celulares contendo 106 ufc/ml, as quais foram transferidas para placas de 96 orifícios e expostas a 03 doses de luz Laser (Grupo1- 60J/cm2 (2,4J), Grupo2- 120J/cm2 (4,8J), Grupo 3-180J/cm2 (7,2J). Suspensões adicionais foram tratadas apenas com o fotossensibilizador, apenas com a luz Laser ou com solução salina 0,85% (grupos controle). Cada condição experimental foi realizada 2 vezes. Após a aplicação dos tratamentos, alíquotas de 1&#956;l das suspensões foram plaqueadas em Agar Sabouraud Dextrose. As placas foram incubadas a 37°C por 24-48h e após esse período foi realizada a contagem das colônias (ufc/ml). As três doses avaliadas determinaram inativação significativa de Candida spp. (p<0,05). A dose de 180J/cm2 foi a mais eficaz, inativando 78% das ufc seguida pelas doses de 120J/ cm2 e 60J/cm2 com inativação média de 62% e 42% respectivamente. Não foi verificada diferença estatística significativa entre as taxas de inativação de C.albicans, C.krusei, C. tropicalis e C. guilhermomdii nas doses de 60 J/cm2 e 120 J/cm2 (p> 0,05). No entanto, na dose de 180 J/cm2 C. albicans foi a espécie mais susceptível aos efeitos da TFD. Conclui-se que a terapia fotodinâmica (PDT) demonstrou efetividade na inativação de Candida spp.