Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-11-23T15:39:38Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1177179 bytes, checksum: dec9ea9972e24062fd20a5915e37c787 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-23T15:39:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1177179 bytes, checksum: dec9ea9972e24062fd20a5915e37c787 (MD5) Previous issue date: 2015-07-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A estocagem de leite cru sob temperatura de refrigeração não impede o crescimento de bactérias psicrotróficas produtoras de proteases termorresistentes que comprometem a qualidade e reduzem a vida de prateleira de produtos lácteos. Para minimizar os problemas tecnológicos resultantes da atividade proteolítica, é desejável que proteases sejam detectadas e quantificadas em leite cru por um método rápido. No entanto, não existe um método eficiente para este fim. Este trabalho teve como objetivos identificar as espécies psicrotróficas com potencial de deterioração predominantes em leite cru brasileiro; identificar e caracterizar as proteases resistentes ao calor produzidas por esta microbiota e desenvolver um método rápido para detectar estas proteases em amostras de leite. As condições de armazenamento sob refrigeração foram simuladas e as bactérias psicrotróficas proteolíticas foram isoladas. As bactérias produtoras de proteases termorresistentes foram agrupadas após análise por Rep-PCR. Os testes bioquímicos e o sequenciamento dos genes rDNA 16S e rpoB foram utilizados para identificar representantes de cada grupo. Uma protease termorresistente produzida por Serratia liquefaciens foi caracterizada e o gene que codifica esta enzima foi identificado após análise dos peptídeos trípticos da protease por espectrometria de massa. Placas de microtitulação revestidas com caseína marcada com biotina foram utilizadas para quantificar a atividade proteolítica de amostras de leite e de proteases diluídas em solução tampão. Os isolados bacterianos altamente proteolíticos foram separados em oito grupos diferentes e quatro padrões únicos. Os isolados com potencial proteolítico são correspondentes à espécie Serratia liquefaciens e ao gênero Pseudomonas. Isolados de S. liquefaciens podem produzir uma metaloprotease termorresistente ao tratamento de 95 °C por 8,45 min, identificada como Ser2, com massa molar de, aproximadamente, 52 kDa e semelhante à protease AprX de Pseudomonas spp. Embora sequências de nucleotídeos do gene ser2 sejam conservadas entre os isolados de S. liquefaciens, o potencial de deterioração das estirpes é heterogêneo indicando diferenças nos níveis de expressão gênica, enzima viii ou modificações pós-transcricionais. O imunoensaio desenvolvido neste estudo foi eficiente para a quantificação da atividade de tripsina, papaína, pepsina, termolisina e protease de pâncreas bovino. No entanto, novas pesquisas devem ser realizadas para minimizar a influência dos componentes da amostra de leite nesta técnica para permitir a detecção acurada de proteases. Este trabalho destaca o elevado potencial de deterioração da microbiota encontrada em amostras de leite cru, além do desenvolvimento de um ensaio promissor, útil para a indústria de lacticínios, para detecção e quantificação de atividade proteolítica resultante das práticas agrícolas inadequadas nas propriedades produtoras de leite. / The storage of raw milk at cold temperatures does not prevent growth of psychrotrophic bacteria, which can produce heat-resistant proteases that compromise the quality and reduce the shelf life of dairy products. To minimize the technological problems resulting from proteolytic activity, these enzymes should be detected and quantified in raw milk before processing by a rapid method. However, there is no efficient method for this purpose. This work aimed to identify the predominant psychrotrophic species with spoilage potential in Brazilian raw milk, to identify and characterize the heat-resistant proteases produced by this microbiota and to developed a rapid method to detect these proteases in raw milk samples. The cold storage conditions were simulated and the psychrotrophic proteolytic bacteria isolated. The heat-resistant protease-producing bacteria were typing by Rep-PCR and clustered. Biochemical tests, 16S rDNA and rpoB gene sequencing were used for identifying one representative isolate from each cluster. The heat-resistant protease produced by Serratia liquefaciens was characterized. The encoding gene was identified after mass spectrometry analysis of tryptic peptides from the heat-resistant protease. The biotinylated casein was coated on microtiter plates and used as substrate to quantify proteolytic activity in solution and milk samples. Highly proteolytic strains were identified and characterized. The isolates were separated into eight different clusters and four solitary fingerprints. The most proteolytic isolates belonged to Serratia liquefaciens and Pseudomonas species. The S. liquefaciens isolates may produce Ser2, which is a a metalloprotease resistant to the heat treatment of 95 °C for 8.45 min. This metalloprotease showed a molecular weight of approximately, 52 kDa and a heat- resistance similar to AprX from Pseudomonas spp. Although nucleotide sequences of ser2 gene were conserved among S. liquefaciens isolates, the spoilage potential among them was heterogeneous indicating differences in enzyme expression levels or post-transcriptional modifications. The developed immunoassay was efficient for quantification of trypsin, papain, pepsin, thermolysin and protease from bovine x pancreas activity. However, further research should be performed to minimize the influence of milk components on the developed assay for detecting proteases in milk samples. This work highlighted the poor conditions of hygiene in milk farms and the high spoilage potential of the microbiota found in raw milk samples besides the development of a promising assay for detection and quantification of proteolytic activity useful for dairy industry.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-13T18:45:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2125079 bytes, checksum: 2f29b3e644ffe90cb9eac41d4f5568f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T18:45:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2125079 bytes, checksum: 2f29b3e644ffe90cb9eac41d4f5568f1 (MD5) Previous issue date: 2004-05-03 / O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito de fatores determinados pela granelização do leite cru refrigerado na estabilidade do leite. Foram enfati- zados os efeitos da temperatura de refrigeração e do tempo de estocagem na composição da microbiota contaminante do leite cru, na atividade proteolítica do leite, na atividade enzimática residual após tratamento UHT, bem como seu possível efeito na estabilidade do leite UHT. Amostras de leite cru coletadas em tanques de refrigeração, na fonte de produção e no silo de uma indústria processadora de leite UHT, foram analisadas quanto as suas características microbiológicas. Bactérias psicrotróficas proteolíticas Gram-negativas e Gram- positivas foram isoladas do leite cru refrigerado, sendo o gênero Pseudomonas o mais freqüentemente isolado, especialmente a espécie P. fluorescens. Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas fermentadoras de glicose apre- sentaram predominantemente atividade proteolítica a 6,5, 21 e 35oC e bactérias Gram-negativas não-fermentadoras de glicose apresentaram um maior percentual de isolados com atividades associadas de proteases, lipases e lecitinases a 6,5 e 21oC, ressaltando seu maior potencial deteriorador. A presença de atividade de enzimas proteolíticas termorresistentes foi observada em sobrenadantes de culturas de bactérias psicrotróficas proteolíticas. A capacidade de adesão a superfícies de aço inoxidável foi constatada em bactérias psicrotróficas proteolíticas Gram-positivas e Gram-negativas até uma densidade de 10 5 células por cm 2 , quando inoculadas em leite desnatado esterilizado a 7oC, por 48 horas. Observou-se o crescimento de P. fluorescens inoculado em leite desnatado a 2, 4, 7 e 10°C, constatando-se o aumento de sua população, do grau de proteólise e da velocidade específica máxima de crescimento com o aumento da temperatura de estocagem. O tempo, em dias, para a perda de estabilidade térmica dessas amostras foi maior a 2 e a 4oC, em relação a 7 e 10oC. Por meio da eletroforese em gel de poliacrilamida obser- vou-se que a temperatura e o tempo de estocagem influenciaram na hidrólise das frações de caseína e da albumina. As amostras de leite cru integral, coletadas assepticamente e usadas como controle, não diferiram quanto aos perfis eletroforéticos após seis dias de estocagem, nas temperaturas avaliadas, demonstrando a importância de investimentos para a implementação de práticas higiênicas de obtenção e conservação da matéria-prima. O tratamento UHT reduziu, em média, 93,2% da atividade proteolítica presente no leite cru integral usado como matéria-prima para o processamento do leite UHT, indicando a presença de atividade proteolítica residual de origem bacteriana e, ou, endógena. Observou-se o aumento da massa de sedimentos, do grau de proteólise e da atividade proteolítica durante a estocagem do leite UHT integral a 37°C, por 120 dias. Em nenhuma das amostras de leite UHT foram consta- tadas contaminações por bactérias mesofílicas e por bactérias mesofílicas esporuladas, além de indícios de gelificação. Todas as amostras permane- ceram termicamente estáveis durante o período de validade do produto. / This work aimed at investigating the effect of variables determined for refrigerated bulk raw milk on milk stability. Emphasis was given to the effects of refrigeration temperature and storage time on raw milk s contaminant microbiota composition, proteolytic activity, residual enzymatic activity after UHT treatment as well as their possible effect on UHT milk stability. Samples of bulk raw milk, collected from cooling tanks at the production sites and from a silo of a UHT milk processing industry were analyzed for microbiological characteristics. Gram-negative and Gram-positive proteolytic psychrotrophs were isolated from the refrigerated raw milk, with the genus Pseudomonas being the most frequently isolated strain, especially the species P. fluorescens. Gram-positive and Gram-negative glucose-fermenting bacteria presented a predominantly proteolytic activity at 6.5, 21, and 35oC and Gram-negative non-glucose fermenting bacteria presented a higher percentage of isolates with activities associated to proteases, lipases, and lecithinase at 6.5 and 21oC, indicating their higher deteriorating potential. The presence of heat-resistant proteolytic activity was observed in the supernatants of psychrotrophic bacterial cultures. The capacity to adhere to stainless steel surfaces was confirmed in Gram- positive and Gram-negative proteolytic psychrotrophics up to a density of 10 5 cells per cm 2 inoculated in sterilized skim milk at 7oC after 48 h of incubation. The maximum specific growth rate and the proteolytic activity of P. fluorescens inoculated in skim milk increased with increasing storage temperatures (2, 4, 7 and 10°C). Heat-stability loss (in days) for these samples was higher at 2 and at 4oC, in relation to 7 and 10oC. Temperature and storage time influenced the hydrolysis of casein and albumim. The raw whole milk samples, aseptically collected and used as control, showed no changes in the eletrophoretic profiles after six storage days under the temperatures evaluated, showing the importance of investing on the implementation of hygienic practices of raw material acquisition and conservation. The UHT treatment reduced, on average, 93.2% of the proteolytic activity in the raw whole milk used as raw material for UHT milk processing, indicating the presence of residual proteolytic activity of bacterial and, or endogenous origin. Increased sediment mass, proteolysis degree, and proteolytic activity were observed during storage of UHT whole milk at 37°C, for 120 days. None of the UHT milk samples were found to be contaminated with sporulating mesophilic bacteria or showed signs of gelation. All the samples remained heat stable during shelf-life. / Tese importada do Alexandria

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA13MA125.pdf: 1115012 bytes, checksum: 736f2a82baac7129fc498949399b0b87 (MD5) Previous issue date: 2013-11-28 / The milk is rich in proteins, lipids, water and carbohydrates, making it an excellent environment for bacterial contamination from different origins and for its proliferation. Bacterial multiplication depends on its capacity of adaptation to the environment and time available. In dairy farms, milk can be storage under cold in bulk tanks models of two and four milking capacity, with a chilling capacity of 50% and 25% respectively of its total volume, in each milking process. The use of cold storage in milk production reduced the occurrence of acid milk, however, increased the proliferation of psychrotrophic microorganisms. These microorganisms presents proteolytic capacity over casein without modifing the milk acidity. This proteolytic capacity could be responsible for unstable non-acid milk (UNAM). The purpose of this study was to evaluate the effect of the cold storage length of time and temperature of raw milk in bulk tanks of two and four milking models on psychrotrophic bacterial count (PBC), casein stability in alcohol test and occurrence of UNAM. The study was conducted in 19 dairy farms in two rehearsal and each farm had a direct expansion bulk milk tank of two or four milking models. Dairy farms with an interval of four milking between milk transportation to the processing industry were selected, thus the milk had a 36 hours of cold storage in the dairy farm. Samples were collected before and after each milking for bacterial total count (BTC), physical-chemical analysis and PBC. Samples of 12 from a total of 19 dairy farms were collected for casein quantification. The length of time of cold storage did not affect the BTC and PBC (P > 0,05). The bulk tank model only affected the PBC (P < 0,05), presenting a lower mean tank s model of two milking when compared with models of four milking (3,61±0,104 and 4,00±0,120 CFU/mL(log10)). The PBC did not affected the casein fractions, however the length of time of cold storage affected the &#1179; and &#946; casein fraction concentrations. The reductions in these casein fractions did not affect the casein stability in the alcohol test. The length of time of cold storage affected the casein stability (P < 0,05) in the alcohol test without affecting the UNAM occurrence. Bulk tanks, when used properly in concern of raw milk volume to be chilled, allow the BTC and PBC rates to remain stable. The length of time of cold storage does not affect BTC and PBC but affects the casein concentration and casein stability in the alcohol test without affecting the UNAM occurrence / O leite é um meio nutritivo facilmente colonizado por bactérias de diferentes origens, com taxa de proliferação condicionada à capacidade do micro-organismo adaptar-se ao ambiente e do tempo disponível. Na propriedade rural o leite pode ser armazenado por até 48 horas em tanques de expansão direta modelo de duas ou quatro ordenhas, os quais diferem na capacidade de resfriamento a cada ordenha, respectivamente, esses equipamentos são capazes de resfriarem 50% e 25% de seu volume a cada ordenha. A conservação do leite sob resfriamento pode não ser suficiente para o controle de micro-organismos psicrotróficos, os quais apresentam atividade proteolítica sobre a caseína sem alterar a acidez do leite, podendo ser um fator desencadeador do leite instável não ácido (LINA). O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do tempo e temperatura de estocagem do leite cru em tanques de expansão direta modelos de duas e quatro ordenhas sobre a contagem bacteriana total (CBT) e contagem de bactérias psicrotróficas (CBP), assim como, determinar o efeito do tempo e da CBP sobre a estabilidade da caseína ao teste do álcool e a ocorrência de LINA. O experimento foi conduzido em 19 propriedades leiteiras localizadas nas regiões Serrana e Meio-oeste Catarinense, as quais possuíam equipamentos de refrigeração do leite por expansão direta modelo duas ou quatro ordenhas com taxa de ocupação de no mínimo 60%. Nas propriedades rurais foram avaliadas informações referentes ao intervalo de 36 horas entre a captação de leite a granel para a indústria de laticínios, as quais incluíam monitoramento temperatura leite, temperatura ambiente e umidade relativa do ar, aplicação de questionários aos responsáveis pela ordenha e coletas de amostras de leite antes e após a cada ordenha para análise de CBT, CBP, composição e teste físico-químicos (pH, acidez titulável e concentração alcoólica), sendo que em 12 das propriedades as frações de caseína foram quantificadas em duplicata. O tempo de estocagem do leite cru não afetou a CBT e CBP (P > 0,05). O modelo de tanque de expansão afetou somente a CBP (P < 0,05), com média inferior para amostras de leite de tanques de duas ordenhas em relação a quatro ordenhas (3,61±0,104 e 4,00±0,120 UFC/mL(log10)). A CBP não afetou as frações das caseínas e caseína total, entretanto, o tempo de estocagem do leite cru reduziu (P < 0,05) a concentração das frações &#1179; e &#946; da caseína e caseína total. A redução das frações de caseína não demonstrou efeito sobre a estabilidade do leite ao teste do álcool. O tempo de estocagem reduziu a (P < 0,05) a estabilidade do leite ao teste do álcool, entretanto não cursou com o aumentou a ocorrência de LINA. Conclui-se que tanques de resfriamento por expansão, utilizados dentro de suas especificações quanto ao volume de leite a ser resfriado, permitem a manutenção da CBT e CBP . O tempo de estocagem não afeta a CBT e CBP, entretanto reduz a concentração de caseína e a estabilidade do leite ao teste do álcool, sem alterar a ocorrência de LINA

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA15MA173.pdf: 751760 bytes, checksum: 23f614e28b7b6a81f91e72de196f5cb7 (MD5) Previous issue date: 2015-06-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Milk production is an important income for family farmers, but to act competitively in the market the dairy sector needs to raise the quality of its raw material. The study aimed to evaluate the factors that influence water quality and milk quality and unstable non-acid milk (UNAM) occurrence in family farms of Planalto Norte of Santa Catarina, Brazil. The study also aimed to assess the influence of water quality used in farm on the milk quality, and to establish relation between bacterial contamination and concentration of CMP in milk. The farms were characterized by a semi-structured questionnaire guide. Samples were collected for analysis of milk composition, somatic cell count (SCC), total bacterial count (TBC) and psychrotrophic bacterial count (PBC). It carried out the alcohol test, titratable acidity and pH, and CMP index was determined by high-performance liquid chromatography. Analyzes performed in water were CBP, Escherichia coli, coliforms at 35ºC and mesophilic aerobic. The food offered to animals also were analyzed. Data were subject to factor and cluster analysis, and broken-line model analysis using SAS statistical package. The most appropriate strategies of animal feed, with consequent improvement of animal productivity and increase of lactose content in milk were related to a lower occurrence of UNAM, which had little relation with farm structure and with season. The farm structure also had little influence on milk microbiological quality. Already the milking management influenced the bacterial contamination, and these were related to CMP concentration in milk. The water quality used in dairy farms was not related to milk quality. Rainfall and water source affected the microbiological contamination in water / A produção de leite é uma importante fonte de renda para agricultura familiar, mas para atuar de modo competitivo no mercado o setor lácteo precisa elevar a qualidade da sua matéria-prima. O estudo objetivou avaliar os fatores que influenciam na qualidade da água e do leite e na ocorrência de leite instável não ácido (LINA) em propriedades de agricultura familiar do Planalto Norte de Santa Catarina. O trabalho também objetivou verificar a influência da qualidade da água utilizada na propriedade sobre a qualidade do leite produzido, além de estabelecer a relação entre a contaminação bacteriana e a concentração de caseinomacropeptídeo (CMP) no leite. As propriedades foram caracterizadas por meio de um questionário guia semi-estruturado. Foram coletadas amostras de leite para analisar sua composição, contagem de células somáticas (CCS), contagem bacteriana total (CBT), e contagem de bactérias psicrotróficas (CBP). Realizou-se o teste do álcool, análises de acidez titulável e pH, e determinou-se o índice CMP por cromatografia líquida de alta eficiência. Na água, foram realizadas análises de CBP, Escherichia coli, coliformes a 35ºC e aeróbios mesófilos. Também foram analisados os alimentos oferecidos aos animais. Os dados foram submetidos à análise fatorial e de agrupamento, e regressão segmentada (broken-line) utilizando o pacote estatístico SAS. As estratégias mais adequadas de alimentação animal, com consequente melhoria da produtividade e aumento do teor de lactose no leite, tiveram influência na menor ocorrência de LINA, que por sua vez apresentou pouca relação com a infra-estrutura das propriedades e com as estações do ano. A infra-estrutura das propriedades também teve pouca relação com a qualidade microbiológica do leite. Já o manejo de ordenha mostrou influência na contaminação bacteriana, que relacionou-se com a concentração de CMP no leite. A qualidade da água utilizada nas propriedades leiteiras não apresentou relação com a qualidade do leite. A precipitação pluviométrica e a origem da água afetaram a sua contaminação microbiológica