For beta > 0, the beta-ensemble corresponds to the joint probability density on the real line proportional to prod_{n > m}^N abs{x_n - x_m}^beta prod_{n = 1}^N w(x_n) where w is the weight of the system. It has the application of being the Boltzmann factor for the configuration of N charge-one particles interacting logarithmically on an infinite wire inside an external field Q = -log w at inverse temperature beta. Similarly, the circular beta-ensemble has joint probability density proportional to prod_{n > m}^N abs{e^{itheta_n} - e^{itheta_m}}^beta prod_{n = 1}^N w(x_n) quad for theta_n in [- pi, pi) and can be interpreted as N charge-one particles on the unit circle interacting logarithmically with no external field. When beta = 1, 2, and 4, both ensembles are said to be solvable in that their correlation functions can be expressed in a form which allows for asymptotic calculations. It is not known, however, whether the general beta-ensemble is solvable. We present four families of particle models which are solvable point processes related to the beta-ensemble. Two of the examples interpolate between the circular beta-ensembles for beta = 1, 2, and 4. These give alternate ways of connecting the classical beta-ensembles besides simply changing the values of beta. The other two examples are "mirrored" particle models, where each particle has a paired particle reflected about some point or axis of symmetry.

PRATA, Mara de Moura Gondim. Avaliação dos mecanismos de proliferação e tipos de morte celular na lesão induzida pela Escherichia coli enteroagregativa e sua modulação por alanil-glutamina e betacaroteno. 2013. 122 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-01-24T12:17:24Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_mmgprata.pdf: 4389191 bytes, checksum: 4ea88bc81357c4bd79732d4483ceb88a (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-01-24T12:17:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_mmgprata.pdf: 4389191 bytes, checksum: 4ea88bc81357c4bd79732d4483ceb88a (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-24T12:17:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_mmgprata.pdf: 4389191 bytes, checksum: 4ea88bc81357c4bd79732d4483ceb88a (MD5) Previous issue date: 2013 / Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) is among the most important agents associated with persistent diarrhea (DP) and was prevalent in studies in children in poor communities in the city of Fortaleza. EAEC cause intestinal injury and inflammation leading to DP and, when combined with malnutrition, can cause a cognitive deficit and infant growth impairment. The current study examined in vitro (IEC-6 and HEp-2) intestinal pathophysiology of three strains: EAEC wild type, EAEC 042 (positive control) and non-pathogenic E.coli HS as well as the role of alanyl-glutamine (AG) and beta-carotene in the mechanisms of proliferation, apoptosis and necrosis in response to the injury caused by EAEC strains. The wild type strain was isolated from a malnourished child. Intestinal cells viability assay in showed a significant reduction (p<0.05) after post-infection with EAEC strains at concentrations of 105UFC/mL in 12, 24 and 48 hours. However, the E.coli HS only changed the intestinal cell viability after 48 hours. EAEC post-infected intestinal cells presented mRNA transcription decrease (p<0.05) of c-jun and c-fos at the period of zero, 6 and 12 hours after infection was terminated, but E.coli HS showed this decrease only after 12h of infection. Intestinal cell apoptosis increased after infection by all strains 24h of infection. However, the cell damage remained intense in the cells treated only with EAEC strains. EAEC 042 increased cell necrosis (p<0.05) in all evaluated periods, but the wild type strain caused damage with only at the period of 24h. All infected cells had a mRNA transcription increase of caspase 8 gene (p<0.05) in12h. NF-kB mRNA transcription increase (p<0.05) was seen in infected cells only in the period of 12h. While transcription levels of IL-8 were extremely high immediately after the infection was interrupted (0h), that was a drastic reduction at 12h after the end of infection. The wild type strain caused a reduction in cell viability linked apoptosis. However, EAEC 042 induced this decrease as also cellular necrosis. E. coli HS showed a different infection profile probably because its lack of virulence genes. AG 1mM supplementation was able to enhance cell proliferation (p<0.05) associated with apoptosis and necrosis reduction (p<0.05) in post-infected cells at the periods of 12, 24 and 48h. However, the presence of AG 1mM in infected cells did not affect the mRNA transcription low levels of c-jun and c-fos as seen after EAEC infection, and failed to block caspase 8 mRNA transcription increase (p<0.05). The IL-8 mRNA transcription temporal reduction was not associated with AG treatment in post-infected cells. Supplementation with AG had positive effects on epithelial protection against damage caused by both EAEC strains in proliferation assay and inhibition of cell death. However, since caspase 8 mRNA transcription decrease was not observed after AG treatment, AG anti-apoptosis feature could be probably related to another mechanism. Beta-carotene cell damage reversal on cell viability assay was statistical significant (p<0.05) 24 hours after infection was ended. Beta-carotene caused 48h apoptosis and necrosis (p<0.05) in wild type strain post-infected cells. Infected cells treated with beta-carotene could not block c-jun and c-fos mRNA transcription reduction and also failed to inhibit caspase 8 mRNA transcription, but beta-carotene itself increased levels of caspase 3 at the period of 12h after infection. Beta-carotene was shown to be potentially harmful to intestinal cells causing cell death probably related to its pro-oxidant effects. / A Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) está entre os mais importantes agentes associados às doenças diarreicas persistentes (DP) e mostrou-se prevalente em estudos na população infantil em comunidades carentes da cidade de Fortaleza. A EAEC causa lesão e inflamação intestinal levando a DP e, quando associada à desnutrição, pode ocasionar um déficit cognitivo e redução do crescimento infantil. Este estudo analisou in vitro (IEC-6 e HEp-2), o papel da alanil-glutamina (AG) e do betacaroteno nos mecanismos de proliferação, apoptose e necrose e em resposta a lesão intestinal induzida por uma cepa EAEC selvagem (LDI001), uma cepa controle EAEC 042 e uma cepa de E. coli HS comensal. A cepa LDI001 foi isolada de uma criança desnutrida. Na viabilidade celular houve uma redução significativa (p<0.05) pós-infecção com as EAECs nas concentrações de 105UFC/mL nos tempos de 12, 24 e 48 horas. Contudo, a cepa comensal apenas alterou no tempo tardio (48h). As células lesionadas por EAEC diminuíram a transcrição (p<0.05) do mRNA dos genes c-jun e c-fos e, apenas tardiamente (12h), com a cepa comensal. A apoptose celular aumentou (p<0.05) após a infecção com todas as cepas em 24h. Porém, o dano persistiu elevado apenas nas células tratadas com as cepas de EAEC. A cepa 042 aumentou as células necróticas (p<0.05) em todos os tempos, embora a LDI001 causou o dano apenas em 24h.Todas as células infectadas sofreram aumento da transcrição (p<0.05) de caspase 8 em 12h. Houve aumento trascricional (p<0.05) de NF-kB em 12h nas células infectadas. Enquanto os níveis de transcrição de IL-8 foram altos imediatamente ao termino da infecção (0h) e houve redução em 12h. A LDI001 causou redução da viabilidade celular vinculada à sua ação apoptótica. A EAEC 042 induziu danos tanto pela apoptose como a necrose celular. A cepa comensal mostrou um perfil diferenciado das outras cepas provavelmente por não apresentar genes de virulência. A suplementação com AG 1mM foi capaz de aumentar a proliferação celular (p<0.05) associado a redução da apoptose e necrose (p<0.05) nas células pós-infectadas nos tempos de 12, 24 e 48h. Contudo, a presença de AG 1mM nas células infectadas não alterou os baixos níveis transcricionais de c-jun e c-fos promovidos pela infecção, e não conseguiu bloquear a transcrição significante (p<0.05) de caspase 8. Os níveis de transcrição de NF-kB ainda permaneceu aumentado (p<0.05) na presença de AG em células pós-infectadas no tempo de 12h. Percebeu-se a continua redução temporal da transcrição de IL-8 não estava associada ao tratamento das células infectadas com AG 1mM. A suplementação com AG obteve efeitos positivos na proteção epitelial contra os danos causados pela infecção das cepas tanto nos processos proliferativos quanto na inibição de morte celular. Contudo, a alanil-glutamina não bloqueou a transcrição de caspase 8 podendo sua função antiapoptótica estar relacionada a outra via de ação no presente modelo em estudo. O tratamento com betacaroteno promoveu a reversão do dano na viabilidade celular significativa (p<0.05) apenas em 24h após infecção. Enquanto a presença do betacaroteno em células pós-infectadas com EAEC selvagem causou aumento de apoptose e necrose (p<0.05) em 48h. Células infectadas tratadas com betacaroteno não aumentaram os níveis de c-jun e c-fos e também não conseguiram bloquear a transcrição de caspase 8 e aumentaram (p<0.05) os níveis de caspase 3 no tempo de 12h. O betacaroteno mostrou-se potencialmente lesivo às células causando morte celular, provavelmente, relacionado aos seus efeitos prooxidantes.

Made available in DSpace on 2015-11-04T13:36:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 raquel_souza_ioc_mest_2014.pdf: 1831146 bytes, checksum: 04aa0a5bc9247dd22f10b502b36fa8d1 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / β - 1,3 - glucanases estão envolvidas na digestão de insetos que utilizam como fonte nutricional detritos ou plantas . Nesse trabalho, nós investigamos o papel dos genes da família 16 das glicosídeo hidrolases (GHF 16) em larvas de Ae. aegypti e sua possível participação na digestão de leveduras. O genoma de Ae. aegypti contém seis genes (Aae GH16. 1 – Aae GH16. 6) que codificam para proteínas da família GH16 , contendo de 2 a 6 éxons. Análises filogenéticas sugerem que em Nemá toceros ocorreram duplicações em alguns genes que contê m a região catalítica conservada nessa família de proteínas (Aae GH16. 1, 2, 3, 5, 6). Ess a s proteínas são similares a outras proteínas de insetos com atividades glucanásicas. A proteína Aae GH16. 4 parece estar relacionad a a proteínas ligantes de β - 1,3 - glucana, não possuindo os resíduos catalíticos conservad os e peptídeo sinal. β - , 1,3 - glucanases e proteínas ligantes de β - glucana são proteínas homológas e parecem ter sido originadas a partir do mesmo gene ancestral , antes da diversificação dos holometábolos. Larvas de Ae. aegypti possuem atividades de β - 1,3 glucanases na cabeça, tubo digestivo e resto do corpo. A s atividade s encontradas no tubo digestivo não foram atribuídas à dieta das larvas. Essas atividades possuem uma faixa de pH ótimo entre 5 - 9 e massas moleculares de 41 kDa a 150 kDa. Larvas de Ae. aegypti se desenvolvem a partir da eclosão dos ovos até a fase adulta em uma dieta exclusiva contendo leveduras Ustilago sp (vivas ou autoclavadas), porém esta condição não provocou uma indução das atividades de β - 1,3 - glucanases. O homogenato do tubo digestivo das larvas parece lisar a parede das leveduras após 4 h de incubação. Todos os genes da família GH16 foram expressos em todos os tecidos e apresentaram diferentes padrões de expressão. Larvas silenci adas para os genes AeGH 16. 5 da GHF 16 apresentaram fenótipos de curvas de sobrevivência e taxas de pupação inferiores aos controles. Sob condições de estresse, o fenótipo observado nas larvas se agrava consideravelmente, principalmente nos genes AeGH16.1 e AeGH16.6. Nos experimentos de ensaios enzimáticos d e β - 1,3 - glucanases, insetos silenciados para o gene AeGH16. 5 apresent aram uma atividade muito inferior comparado s aos silenciados para AeGH16.6 ou a os grupos controles (GFP e água) em amostras de tubo digestivo. Ensaios nesses grupos utilizando o resto d o corpo não sofreram alterações. O perfil cromatográfico do tubo digestivo também foi analisado, e novamente insetos silenciados para AeGH16. 5 apresent aram um pico de atividade menor que os demais , sugerindo que esse gene codifica a  - 1,3 - glucanase intestinal em larvas de Ae.aegypti / Insect β - 1 , 3 - glucanases are involved in digestion of detritus and plant hemicellulose. We investigated the role of GH16 genes in Ae.aegypti larvae , and its putative participation in digestion of fungi. The genome of Ae.aegypti contains six genes coding for GHF16 proteins (Aae GH16.1 – Aae GH16.6), containing 2 - 6 exons. Phylogenetic analysis suggest s that Aae GH16.1 , 2, 3, 5 and 6 , which contain the GHF16 conserved catalytic residues , are related to other insect glucanases . These genes apparently suffered duplications in the genomes of Nematocera. Aae GH16.4 is related to β - 1,3 - glucan binding proteins, which have no catalytic activity. β - 1,3 - glucanases and β - glucan binding proteins are homologous proteins, which originated by gene duplication prior to the origin of the Holometabola. Ae.aegypti larvae contain β - 1, 3 - glucanase activity in the head, gut and rest of body. Gut activity is not acquired from food. These activities have optimum pH about 5 - 6 and molecular masses between 41 and 150 kDa. Ae.aegypti develops well from egg to adults feeding on ly on live or autoclaved yeasts and activity of β - 1, 3 - glucanases is not induced by both diets. Larval gut homogenates lyse live Ustilago sp af ter 4 hours of incubation. All GH16 genes showed different levels of expression in the larval head, gut or rest of body. Larvae k nock - down of gene AeGH16. 5 of GHF 16 showed phenotype with survival curve and rate of pupation lower than control s (GFP and water) . However, under stress conditions severe mortalities are observed in AeGH16.1 and AeGH16.6 knocked - down larvae . Enzy matic assays of β - 1 , 3 - glucanase in AeGH16.5 silenced larvae exhibited lower activity in the gut and no change in the rest of body . Chromatographic activity profiles from gut samples after GH16.5 silencing showed lower activity, suggesting that this gene codes for the larval digestive  - 1 , 3 - glucanase

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Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:10:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318382.pdf: 1686846 bytes, checksum: 51ac5e51f122726f40392a9cb814daf3 (MD5) Previous issue date: 2013 / No presente trabalho transfectamos uma cepa de Leishmania amazonensis com um plasmídeo contendo o gene da ?-galactosidase, visando estabelecer um ensaio colorimétrico para triagem de compostos ativos contra amastigotas intracelulares de leishmania. A transfecção não alterou o crescimento de promastigotas em cultura, a infectividade de células THP-1 e de camundongos Balb/c. A atividade da enzima foi diretamente proporcional ao número de parasitos. A inibição do crescimento dos parasitos intracelulares pelo fármaco de referência Anfotericina B, determinada tanto pelo método colorimétrico quanto por contagem microscópica dos parasitos, produziu resultados semelhantes, validando o ensaio. O teste colorimétrico também foi aplicado com sucesso para avaliar a atividade de uma classe de moléculas análogas e derivadas do ácido gálico. O estudo da correlação estrutura atividade mostrou que estas moléculas possuem uma atividade leishmanicida pouco seletiva. Algumas melhorias como a transfecção integrativa e estável, bem como padronização deste método com outras espécies de Leishmania ainda são desejáveis. Contudo, o ensaio com L. amazonensis expressando ?-galactosidase foi robusto, sensível, reprodutível e rápido na avaliação da atividade leishmanicida de compostos <br>

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Universidade Federal da Paraíba, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Programa Multi-Institucional e Inter-Regional de Pós-Graduação em Ciências Contábeis, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-07-13T12:22:39Z No. of bitstreams: 1 2016_LidianeNazarédaSilvaDias.pdf: 2539635 bytes, checksum: 586a6c7303d6a806efe299de3eb71e38 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-26T10:58:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LidianeNazarédaSilvaDias.pdf: 2539635 bytes, checksum: 586a6c7303d6a806efe299de3eb71e38 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T10:58:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LidianeNazarédaSilvaDias.pdf: 2539635 bytes, checksum: 586a6c7303d6a806efe299de3eb71e38 (MD5) / Esta pesquisa foi concebida com o objetivo de investigar quais são os fatores que impactam na corrupção e na ineficiência relacionadas à aplicação de recursos da saúde pública municipal. Baseado nos estudos sobre a Teoria Neo-Institucional, a Teoria da Agência, a Teoria Rent Seeking e a Eficiência Pública identificou-se que o comportamento oportunista do gestor público (no que se refere a corrupção e a ineficiência) pode ser influenciado pela adoção de mecanismos de governança pública (existência de controle e incentivo) e por um ambiente propício ao comportamento rent seeking (relacionado ao volume de receitas e despesas geridas pelo ente público). Para a operacionalização destas variáveis teóricas foram trabalhadas para a governança pública, como dimensão de controle: a gestão fiscal, a fiscalização e a transparência; e como dimensão de incentivo: a reeleição; para ambiente propício ao comportamento rent seeking foi trabalhada a dimensão de volume de receitas e despesas. No que tange aos fatores que impactam a corrupção na aplicação de recursos na saúde pública (em termos de chances média de ocorrência), os resultados evidenciaram que: i) municípios da região Norte possuem maiores chances média de corrupção; ii) a fiscalização exercida pelos Conselhos Municipais de Saúde (CMS), como fator de governança pública, diminui as chances de corrupção; iii) o maior volume de despesa, como fator de ambiente propício ao comportamento rent seeking, aumenta a corrupção; iv) estas variáveis foram capazes de explicar 18,74% da variabilidade do Índice de Corrupção Municipal, estando os resultados de acordo com a teoria. Quanto aos fatores que impactam a ineficiência relacionada à aplicação de recursos da saúde pública (em termos de chances média de ocorrência) encontrou-se evidencias de que: i) municípios da região Centro-Oeste possuem maiores chances média de ineficiência; ii) os municípios mais ricos e com menor IDHM possuem maiores chances médias de ineficiência; iii) os municípios com melhor gestão fiscal e com maior atuação do CMS, como fatores de governança pública controle e fiscalização, respectivamente, possuem menores chances de incorrerem em ineficiência; vi) o maior volume de despesas e receitas geridas pelo município, como fatores de ambiente propício ao comportamento rent seeking, diminuem a chance média de ineficiência; viii) essas variáveis foram capazes de explicar 22,34% da variabilidade do Índice de Ineficiência Municipal, estando apenas as referente ao comportamento rent seeking divergindo da teoria, apesar disso, elas foram significativas, representaram fatores que influenciam na ineficiência. Conclui-se que a governança pública e o ambiente propício ao comportamento rent seeking são fatores que impactam na corrupção e na ineficiência relacionadas à aplicação de recursos da saúde pública municipal, confirmando a hipótese geral da tese. Quanto à originalidade da tese, destaca-se a forma de mensuração dos desperdícios de recursos a partir da análise fatorial; a criação de um índice de inércia na atuação do CMS; e a utilização da Regressão Beta e Beta Inflacionada. Como principal contribuição, tem-se a definição de modelos de previsão das chances médias de ocorrência de corrupção e ineficiência relacionadas à aplicação de recursos da saúde pública municipal. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This research was designed in order to investigate which factors impact on corruption and inefficiency related to the application of municipal public health resources. Based on the seminal studies of Neo-institutional theory, Agency Theory, Rent Seeking Theory and Public Management Efficiency it was verified that the opportunistic behavior of the public manager (regarding to corruption and inefficiency) can be influenced by adoption public governance mechanisms (existence of control and incentive) and a conducive environment to rent seeking behavior (related to the volume of revenue and expenditure managed by the public entity). In order to implement these theoretical variables, they were worked to public governance, as dimension of control: fiscal management, supervision and transparency; and as dimension of incentive: the re-election; for a conducive environment to rent seeking behavior was worked the dimension of revenue and expenses volume. Regarding to the factors that affect corruption in the use of resources in public health (in terms of average probability of occurrence), the results showed that: i) municipalities in the northern region have higher average chances of corruption; ii) the review carried out by the Municipal Health Councils (CMS) as public governance factor, reduces the chances of corruption; iii) the bigger spending volume, as a factor of conducive environment to rent seeking behavior, increases corruption; iv) these variables were able to explain 18.74% of the variability of the Municipal Corruption Index, showing that the results are according to the theory. Regarding to factors that impact the inefficiency related to resource application in public health (in terms of average probability of occurrence) evidence point that: i) municipalities in the Midwest Region have higher average chances of inefficiency; ii) the richest municipalities with less IDHM have higher average chances of inefficiency; iii) the municipalities with better fiscal management and higher performance of the CMS, as factors of public governance, control and surveillance, respectively, have lower chances of incurring in inefficiency; vi) the greater volume of expenditure and revenue managed by the municipality, as factors of conducive environmental to rent seeking behavior, decreases the average chance of inefficiency; viii) these variables were able to explain 22.34% of the variability of the Municipal Inefficiency Index, letting only those relating to rent seeking behavior deviating from the theory, nevertheless they were significant, representing factors that influence in inefficiency. It concluded that public governance and a conducive environment to rent seeking behavior are factors that impact on corruption and inefficiency related to the application of the resources of the municipal public health, confirming the general hypothesis of the thesis. Concerning to thesis originality, stands out a way of measuring the waste of resources from the factorial analysis; the creation of an inertia index in CMS acting; and the use of beta regression and inflated beta regression. As the main contribution, has been the development of predictive models of the average chances of occurrence of corruption and inefficiency related to the application of resources of the municipal public health.

As glicosidases são enzimas que apresentam uma grande variedade de enovelamentos, assim como uma alta especificidade frente a diferentes substratos. Estas enzimas têm em comum a presença de dois resíduos catalíticos, responsáveis pela clivagem das ligações glicosídicas. O uso de glicosidases nas indústrias têxtil e alimentícia, no processamento de polpa de papel e na síntese de oligossacarídeos tem incentivado a engenharia destas proteínas no sentido de melhorar suas propriedades catalíticas e estabilidade. Estudos estruturais das glicosidases têm aumentado nosso entendimento de seus mecanismos de ação catalitica, assim como dos processos de interação proteína-carboidrato. Neste trabalho apresentamos os estudos cristalográficos de duas glicosidases de fungos, sendo elas a beta-galactosidase de Penicillium sp. e a Exo-inulinase de Aspergillis awamori, assim como estudos por espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) da beta-xylosidase de Trichoderma reesei. As estruturas cristalográficas da beta-galactosidase e de seu complexo com galactose foram determinadas pela técnica de substituição isomórfa simples com espalhamento anômalo (SIRAS) até 1.9 A angstron de resolução para a estrutura sem substrato e 2.0 angstron de resolução para o complexo. A estrutura do complexo com galactose foi usada para identificar os resíduos catalíticos, sendo o resíduo Glu 200 identificado como doador de próton e o resíduo Glu 299 como o nucleófílo. As estruturas cristalográficas da Exo-inulinase de Aspergillus awamori e de seu complexo com frutose foram também determinadas pela técnica de substituição isomórfa simples com espalhamento anômalo (SIRAS) até 1.55 angstron e 1.8 angstron de resolução, respectivamente. A partir da estrutura do complexo foi possível identificar os resíduos Asp41 e Glu241 como o nucleófilo e o doador de próton, respectivamente. Além disto, foi possível verificar que o Asp189, o qual faz parte do motivo conservado Arg-Asp-Pro (RDP), é importante no reconhecimento do substrato através de duas pontes de hidrogênio. Com o intuito de obter informações estruturais sobre a P-xylosidase seu envelope foi determinado a partir dos dados do espalhamento de raios-X a baixos ângulos. O envelope da p-xylosidase em solução foi calculado a 20 A de resolução, sendo o raio de giro e a dimensão máxima 36.9 angstron e 90 angstron, respectivamente. Usando algoritmos de reconhecimento de possíveis domínios foi determinado que esta proteína apresenta, além dos dois domínios característicos da família GHF3, um barril TIM e um domínio alfa/beta, um terceiro domínio. A predição da estrutura secundária e os dados de dicroísmo circular indicam que este terceiro domínio apresentaria um enovelamento tipo beta. / Glycosidases belong to a group of enzymes displaying a great variety of protein folds and substrate specificities. Two critically located acidic residues make up the catalytic machinery of these enzymes, responsible for the cleavage of glycosidic bonds. The applications of glycosidases in textile, food, and pulp processing, as well as in catalysts and oligosaccharide synthesis have encouraged the engineering of these proteins in order to obtain improved catalytic properties and stability. Furthermore, structural studies extend our understanding of the catalytic mechanism and the role of glycosidases in the recognition processes of their different substrates. In this work, we describe crystallographic studies of two fungi glycosidases, beta-galactosidase from Penicillium sp and Exo-inulinase from Aspergillis awamori, and the small-angle x-ray scattering (SAXS) studies of another glycosidase, beta-xylosidase (from Trichoderma reesei). The crystallographic structures of j3-galactosidase its complex with galactose were solved by single isomorphous replacement with anomalous scattering (SIRAS) using the quick cryo-soaking technique, at 1.90 angstron and 2.10 angstron resolution, respectively . The X-ray structure of the enzyme-galactose complex was useful in identifying the residue Glu 200 as the proton donor and residue Glu 299 as the nucleophile involved in catalysis. The x-ray structure of exo-inulinase and its complex with fructose were also solved by SIRAS using the quick cryo-soaking technique at 1.55 angstron and 1.8 angstron resolutions, respectively. The solved structure of the enzyme-fructose complex revealed two catalytically important residues, Asp41 and Glu241, as nucleophile and proton donor, respectively. It was also possible to see that residue Asp189, which belongs to the Arg-Asp-Pro motif, provides hydrogen bonds important for substrate recognition. In order to gain structurai insights about the beta-Xylosidase from Trichoderma reesei, we calculated their SAXS envelope. The low resolution shape of this enzyme in solution was obtained fiom synchrotron x-ray scattering data at 20 angstron resolution. The radii of gyration and the maximum dimension of the beta-Xylosidase were calculated to be 36.9 angstron and 90 angstron, respectively. In contrast to the fold of the only structurally characterized member of GHF-3, the beta-D-glucan exohydrolase, which has two distinct domains, the shape of the beta-xylosidase indicates the presence of three domains located in the same plane. Domain recognition algorithms were used to show that the C-terminal part of the mino acid sequence of the protein forms the third domain. Circular dichroism spectroscopy and secondary structure prediction programs show that this additional domain adopts predominantly the B-conformation.

Orientador: Helia Harumi Sato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-10T08:10:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_GiselledeArruda_M.pdf: 925514 bytes, checksum: 300372a4285d7efd417f8a717a850023 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A enzima ß-1,3-glucanase da bactéria Cellulosimicrobium cellulans 191 é capaz de lisar a parede celular de diversas leveduras dentre elas as linhagens de Kluyveromyces sp., produtoras da enzima intracelular ß-galactosidase. Este trabalho visou a produção de ß-1,3-glucanase lítica de Cellulosimicrobium cellulans 191 para obtenção das preparações enzimáticas bruta concentrada e purificada com alta atividade lítica para aplicação na obtenção de protoplastos de leveduras e lise das células de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus para extração de b-galactosidase. A ß-1,3-glucanase extracelular foi produzida pela bactéria Cellulosimicrobium cellulans 191 em meio otimizado composto de 10g/L de parede celular de levedura, 2,0g/L de (NH4)2SO4; 0,2g/L de MgSO4.7H2O em tampão fosfato 0,2M, pH 7,5 como descrito por SCOTT e SCHEKMAN (1980) e modificado por SOARES (2002). Foi obtida maior produção da ß-1,3-glucanase na fermentação do microrganismo em frascos aletados a 30ºC, 200rpm por 24 horas do que em fermentador contendo o mesmo meio a 30ºC, 1,5vvm por 24 horas, obtendo-se 0,724 e 0,351U/mL, respectivamente. Os sobrenadantes dos meios fermentados em frascos agitados e em fermentador de 5L apresentaram atividade de 0,120 e 0,064U/mL de protease, respectivamente. Foi estudada a influência dos compostos sacarose (10mM), lactose (10mM), maltose (10mM), glicerol (10mM), gelatina (125mg/mL), albumina de ovo (125mg/mL), sulfato de amônio (10mM), EDTA (10mM), b-mercaptoetanol (10mM) e cisteína (10mM) na preservação da atividade de ß-1,3-glucanase da preparação enzimática bruta a 45ºC, 50ºC e 55ºC, no entanto, nenhum dos compostos testados aumentou a estabilidade da enzima. Foi testada a concentração da preparação enzimática bruta de ß-1,3-glucanase por liofilização, ultrafiltração, fracionamento com sulfato de amônio, pela remoção de água com carboximetilcelulose (CMC) e precipitação com os solventes orgânicos acetona e etanol. A concentração da preparação enzimática bruta de ß-1,3-glucanase utilizando-se sacos de diálise e CMC em pó para a adsorção da água mostrou-se como o método mais eficiente, sendo que a enzima foi concentrada 6,38 vezes com manutenção de 96% da atividade inicial. A preparação enzimática bruta de ß-1,3-glucanase foi purificada aproximadamente 2 vezes por fracionamento com sulfato de amônio 30% de saturação. A ß-1,3-glucanase da preparação enzimática bruta foi purificada aproximadamente 6,66 vezes através de fracionamento com sulfato de amônio a 30% de saturação, dessalinização em coluna de exclusão Sephadex PD10 e cromatografia em coluna de troca iônica DEAE-Sephacelè, com rendimento de 18%. Dentre as linhagens das leveduras Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Kluyveromyces drosophilarium, Kluyveromyces marxianus NRRL7571, Kluyveromyces marxianus NRRL1196, a primeira foi selecionada como maior produtora da enzima b-galactosidase. As preparações enzimáticas bruta concentrada e purificada de ß-1,3-glucanase apresentaram capacidade de lisar as células de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus a 37ºC. Para a formação de protoplastos foi utilizado 0,1U de ß-1,3-glucanase por mL de suspensão de levedura equivalente a 1,3mg de massa celular seca, durante 1 hora a 37ºC. A extração da ß-galactosidase de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus foi testada pelos métodos químico (solventes orgânicos), enzimático (ß-1,3-glucanase) e físico (ultrasonicação). O método de pré-tratamento enzimático e posterior aplicação de ultrasonicação apresentou melhores resultados seguido pelos métodos de permeabilização com etanol 50%, b-1,3-glucanase purificada, ultrasonicação, permeabilização com tolueno 20% e ß-1,3-glucanase bruta, obtendo-se, respectivamente, atividades de ß-galactosidade (massa celular seca) iguais a 25,13U/mg/min; 14,00U/mg/min; 13,11U/mg/min; 10,95U/mg/min; 10,75U/mg/min e 7,25U/mg/min utilizando-se lactose como substrato. A b-galactosidase bruta apresentou atividade ótima em pH 7,0 e 32ºC e mostrou-se estável na faixa de 30 a 35ºC após 3 horas em pH 7,0 e na faixa de pH entre 6,5 e 7,5 após 3 horas a 35ºC. A b-galactosidase de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus foi purificada 2,3 vezes após fracionamento com sulfato de amônio a 60% de saturação, diálise e cromatografia em coluna de troca iônica DEAE-Sephacelè, com rendimento de 31%. As preparações enzimáticas bruta e purificada da ß-glucanase lítica da bactéria Cellulosimicrobium cellulans podem ser utilizadas na obtenção de protoplastos de leveduras e extração de enzimas intracelulares de leveduras / Abstract: The enzyme ß-1,3-glucanase from the bacteria Cellulosimicrobium cellulans 191 is capable of lysing the cell wall of various yeasts including strains of Kluyveromyces sp., producers of the intracellular enzyme ß-galactosidase. This work aimed to produce lytic ß-1,3-glucanase from Cellulosimicrobium cellulans 191 in order to obtain crude, concentrated and purified enzyme preparations with high lytic activity, for application in the obtaining of yeast protoplasts and in the lysis of Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus to extract ß-galactosidase. Extracellular ß-1,3-glucanase was produced by the bacteria Cellulosimicrobium cellulans 191 in an optimised culture medium composed of 10g/L yeast cell wall, 2.0g/L (NH4)2SO4 and 0.2g/L MgSO4.7H2O in 0.2M phosphate buffer, pH 7.5. The production of ß-1,3-glucanase from the microorganism was greater in flasks with flaps incubated at 30ºC and 200rpm for 24 hours than in a fermenter containing the same medium and incubated at 30ºC and 1.5vvm for 24 hours, obtaining yields of 0.724U/mL and 0.351U/mL, respectively. The supernatants from the media fermented in the shaken flasks and in the 5L fermenter presented protease activities of 0.120U/mL and 0.064U/mL, respectively. The influences of sucrose (10mM), lactose (10mM), maltose (10mM), glycerol (10mM), gelatine (125mg/mL), egg albumin (125mg/mL), ammonium sulphate (10mM), EDTA (10mM), b-mercaptoethanol (10mM) and cysteine (10mM) in the preservation of the ß-1,3-glucanase activity of the crude enzyme preparation at 45ºC, 50ºC and 55ºC, were studied, but none of the compounds tested increased the stability of the enzyme. Concentration of the crude ß-1,3-glucanase preparation was tested using freeze drying, ultrafiltration, ammonium sulphate fractionation, by the removal of water using carboxymethylcellulose (CMC) and by precipitation with the organic solvents acetone and ethanol. Concentration of the crude ß-1,3-glucanase preparation using dialysis bags and powdered CMC to adsorb the water was shown to be the most efficient method, the enzyme being concentrated 6.38 times with 96% maintenance of the initial activity. The crude ß- 1,3- glucanase preparation was purified about two-fold by ammonium sulphate fractionation at 30% saturation. The ß-1,3-glucanase of the crude enzyme preparation was purified about 6.66 times using ammonium sulphate fractionation at 30% saturation, desalting in a Sephadex PD10 exclusion column and ion exchange column chromatography using DEAE-Sephacelè, with an 18% yield. Of the following yeast strains, Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Kluyveromyces drosophilarium, Kluyveromycesmarxianus NRRL7571 and Kluyveromyces marxianus NRRL1196, the first one was selected as the greatest producer of the enzyme ß-galactosidase. The crude, concentrated and purified ß-1,3-glucanase preparations were capable of lysing the cells of Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus at 35ºC. In order to form protoplasts a ß-1,3-glucanase preparation with 0.1U activity was used per mL yeast suspension equivalent to 1.3mg dry cell mass, for 1 hour at 35ºC. Physical (ultrasound), chemical (organic solvents) and enzymatic (ß-1,3-glucanase) methods were tested for their efficiency in extracting ß-galactosidase from Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus. The method using an enzymatic pre-treatment followed by the application of ultrasound gave the best results, followed by methods of permeabilization by ethanol 50%, purified ß-1,3-glucanase, ultrasonication, toluene 20% and crude ß-1,3- glucanase, obtaining ß-galactosidase activities (dry cell mass) of, respectively, 25.13U/mg/min, 14.00U/mg/min, 13.11U/mg/min, 10.95U/mg/min, 10.75U/mg/min e 7.25U/mg/min using lactose as the substrate. The crude ß-galactosidase preparation showed optimum activity at pH 7.0 and 32ºC and was stable in the range from 30-35ºC after 3 hours at pH 7.0 and between pH 6.5 and 7.5 after 3 hours at 35ºC. The ß-galactosidase from Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus was purified 2.3 fold after ammonium sulphate fractionation at 60% saturation, dialysis and ion exchange column chromatography on DEAE-Sephacelè, with a 31% yield. The crude and purified lytic ß-glucanase preparations of Cellulosimicrobium cellulans bacteria can be used to obtaining yeast protoplasts and extraction of intracellular enzymes of yeasts / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientadores: Francisco Maugeri Filho, Renato de Azevedo Moreira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-21T19:53:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_Gilcenara_M.pdf: 1974223 bytes, checksum: 647b7e3918cb207ca7de16931074a977 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A celulose é um material amplamente encontrado na natureza. A hidrólise deste material é resultado de um complexo enzimático que age em sinergismo, denominado celulase. Neste complexo a enzima ß-glicosidase (EC 3.2.1.21) é responsável pelo passo final da hidrólise para formação do produto glicose. Esta enzima tem várias aplicações nos diversos setores industriais, atuando principalmente de forma suplementar, ou seja, é acrescida ao sistema enzimático assim aumentando a cinética da hidrólise. Na indústria alimentícia pode-se destacar a extração e clarificação de sucos, a hidrólise de vegetais para preparação de pures, para alimentação infantil ou geriátrica. Este trabalho se propõe a determinar os parâmetros envolvidos no processo de separação e purificação da ß-glicosidase, a partir de um complexo enzimático, Celulase Tr (Cellumax), para então aplicá-los ao sistema CARE (Continuous Affinity Recycle Extraction). No processo de purificação foram utilizadas técnicas cromatográficas. Iniciou-se com cromatografia de filtração em gel, seguida de cromatografia de troca iônica. Obtiveram-se melhores resultados com o uso de CM-Sephadex C-50. As frações correspondentes aos picos obtidos nesta cromatografia foram concentradas e aplicadas em coluna de Superose 12 R acoplada ao sistema de FPLC (Faster Performance Liquid Chromatography) a fim de confirmar a pureza da enzima ß-glicosidase. O material obtido foi submetido a análise de eletroforese em gel de poliacrilamida/dodecil sulfeto de Sódio (PAGE/SDS), garantindo desta forma que a enzima estava realmente pura. Os resultados obtidos mostram que é possível a aplicação do processo CARE para separar e purificar a ß-glicosidase. Como continuidade a este trabalho, sugere-se a determinação das constantes cinéticas envolvidas na adsorção-dessorção da resina usada no sistema CARE / Abstract: Cellulose is a very common natural substance. The hydrolysis of this material is caused by an enzyme complex, acting synergistically, known as cellulase. In such a complex, the enzyme ß-glucosidase (EC 3.2.1.21) is responsible for the final step of hydrolysis to form glucose. This enzyme has numerous industrial applications. Particularly important among applications in the food industry we may include the lightening of juices and the hydrolysis of vegetables for production of purees, for infants and elderly. This work was carried out to try to find the parameters involved in the separation and purification of , ß-glucosidase, from an enzymatic complex called Cellulase Tr (Cellumax), and then, to apply them in the CARE (Continuous Affinity Recycle Extraction) system. The purification process began with gel filtration chromatography and followed by ion-exchange chromatography. The best results were obtained using CM-Sephadex C-50. The peak fractions obtained with ion-exchange cromatography were concentrated and applied to a Superose 12 R column in a FPLC system to confirm the purity of the , Abstract: Cellulose is a very common natural substance. The hydrolysis of this material is caused by an enzyme complex, acting synergistically, known as cellulase. In such a complex, the enzyme Abstract: Cellulose is a very common natural substance. The hydrolysis of this material is caused by an enzyme complex, acting synergistically, known as cellulase. In such a complex, the enzyme ß-glucosidase (EC 3.2.1.21) is responsible for the final step of hydrolysis to form glucose. This enzyme has numerous industrial applications. Particularly important among applications in the food industry we may include the lightening of juices and the hydrolysis of vegetables for production of purees, for infants and elderly. This work was carried out to try to find the parameters involved in the separation and purification of , ß-glucosidase, from an enzymatic complex called Cellulase Tr (Cellumax), and then, to apply them in the CARE (Continuous Affinity Recycle Extraction) system. The purification process began with gel filtration chromatography and followed by ion-exchange chromatography. The best results were obtained using CM-Sephadex C-50. The peak fractions obtained with ion-exchange cromatography were concentrated and applied to a Superose 12 R column in a FPLC system to confirm the purity of the , ß-glucosidase. For the material obtained with Superose, a PAGE/SDS analysis was undertaken to garantee the purity of the enzime. The results obtained make possible the application of CARE process to the separation and purification of ß-glucosidase. In addition, from the results it is possible to calculate the kinetic constants involved in the resin adsorption-desorption used in the CARE system. ß-glucosidase (EC 3.2.1.21) is responsible for the final step of hydrolysis to form glucose. This enzyme has numerous industrial applications. Particularly important among applications in the food industry we may include the lightening of juices and the hydrolysis of vegetables for production of purees, for infants and elderly. This work was carried out to try to find the parameters involved in the separation and purification of , ß-glucosidase, from an enzymatic complex called Cellulase Tr (Cellumax), and then, to apply them in the CARE (Continuous Affinity Recycle Extraction) system. The purification process began with gel filtration chromatography and followed by ion-exchange chromatography. The best results were obtained using CM-Sephadex C-50. The peak fractions obtained with ion-exchange cromatography were concentrated and applied to a Superose 12 R column in a FPLC system to confirm the purity of the , ß-glucosidase. For the material obtained with Superose, a PAGE/SDS analysis was undertaken to garantee the purity of the enzime. The results obtained make possible the application of CARE process to the separation and purification of ?-glucosidase. In addition, from the results it is possible to calculate the kinetic constants involved in the resin adsorption-desorption used in the CARE system.-glucosidase. For the material obtained with Superose, a PAGE/SDS analysis was undertaken to garantee the purity of the enzime. The results obtained make possible the application of CARE process to the separation and purification of ß-glucosidase. In addition, from the results it is possible to calculate the kinetic constants involved in the resin adsorption-desorption used in the CARE system. / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Orientador: Glaucia Maria Pastore / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T05:10:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_Rosangelados_M.pdf: 814194 bytes, checksum: 40aac8890d5062af1c1b42f9e06c6d35 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Os galactooligossacarídeos (GOS), um grupo de oligossacarídeos, são carboidratos não digeríveis (NDOs), resistentes à hidrólise das enzimas digestivas do intestino, tem os efeitos fisiológicos similares ao da fibra dietética. Sua ingestão aumenta a proliferação das Bifidobacterium e dos Lactobacilus no intestino. Eles são considerados como ingredientes prebióticos. Devido aos possíveis benefícios à saúde, associados com o consumo destes compostos, seu uso como Alimento Funcional tem crescido rapidamente, particularmente no Japão e Europa. Este trabalho teve como objetivo a extração da enzima _-galactosidase a partir do microrganismo Scopulariopsis sp, de avaliar o efeito da temperatura, tempo de reação, concentração de enzima e lactose, de modo a obter condições mais eficientes para a produção de GOS, além disso, comparar esses resultados com os GOS produzidos com a enzima comercial obtida por Aspergillus oryzae. Como resultado, observamos que a linhagem de Scopulariopsis sp sintetizou grandes quantidades de b-galactosidase por fermentação semi-sólida, que foi produzida constitutivamente. A enzima semi-purificada foi precipitada de etanol 70%. O extrato foi caracterizado bioquimicamente, mostrando ter pH ótimo de 5,0 e a melhor temperatura a 45ºC, para atividade de transgalactosilação. A enzima obtida a partir de Scopulariopsis sp converteu 20% de lactose em oligossacarídeos (80.8mg/mL de 4¿galactosyl-lactose), comparando com a _- galactosidase de Aspergillus oryzae, que converteu 6% de lactose em oligossacarídeos (25.6mg/mL de 4¿galactosyl-lactose), utilizando lactose 40% (p/v), à 45ºC, pH 5.0 e 10U/mL e o melhor tempo foi o de 12h de reação. Também houve a produção de outro galactooligossacarídeo de estrutura não identificada ainda, sendo necessário estudos adicionais que elucidem a estrutura e atividade destes GOS / Abstract: The galactooligosaccharides (GOS), a group of oligosaccharide, are not digerible carbohydrates (NDOs), they are resistant to hydrolysis by digestive enzymes from intestine and have similar dietary fiber physiological effect. Its ingestion increases the Bifidobacterium and Lactobacillus proliferation in the intestine. They are considered prebiotic ingredients. Due to the possible health benefits associated with the consumption of these compounds, their use as functional ingredients has grown quickly, particularly in Japan and Europe. They aim of this work was to extract the _-galactosidase from Scopulariopsis sp, and to evaluate the temperature conditions, reaction time, lactose and enzyme concentration, to improve the GOS production, beyond that, to make a comparison with the GOS obtained by commercial enzyme produced by Aspergillus oryzae. As result the Scopulariopsis sp strain had, accumulated great amounts of _- galactosidase on semisolid fermentation and the enzyme was produced continuosly. The enzyme solution was precipitated by using 70% ethanol. The extract was biochemically characterized showing the otimum pH of 5.0, and the best temperature was 45ºC, for transgalactosylation activity. The enzyme isolated from Scopulariopsis sp has converted 20% of lactose into oligosacharides (80.8mg/mL of 4'galactosyl-lactose), comparing with _-galactosidase from Aspergillus oryzae, a commercial enzyme, that converted 6% of lactose into oligosacharides (25.6 mg/mL of 4'galactosyl-lactose), using lactose 40% (p/v), at 45ºC, pH 5.0 and 10U/mL, and the best reaction time was at 12h of reaction. We also observed the production of other galactooligosaccharide with nonidentified structure, been necessary additional research to discover their structure and activity / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos