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Functional Analysis of Nuclear beta-Adrenergic Receptors in the MyocardiumVaniotis, George 09 1900 (has links)
Récemment plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été
caractérisés au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nucléaire.
Notre objectif était de déterminer si les sous-types de récepteurs β-adrénergiques (βAR) et leurs machineries de signalisation étaient fonctionnels et localisés à la membrane nucléaire des cardiomyocytes. Nous avons démontré la présence des β1AR et β3AR, mais pas du β2AR à la membrane nucléaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protéines GαS, Gαi, l’adénylate cyclase II, et V/VI y étaient également localisés. Les sous-types de βAR nucléaires étaient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isolés, nous avons observé que l'agoniste non-sélectif isoprotérénol (ISO), et que le BRL37344, un ligand sélectif du β3AR, stimulaient l'initiation de la synthèse de l’ARN, contrairement à l'agoniste sélectif du β1AR, le xamotérol. Cette synthèse était abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des récepteurs nucléaires de type B de l’endothéline (ETB) causaient une réduction de l'initiation de la synthèse d’ARN. Les voies de signalisations impliquées dans la régulation de la synthèse d’ARN par les RCPGs ont ensuite été étudiées en utilisant des noyaux isolés stimulés par des agonistes en présence ou absence de différents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases activées par mitogènes) et de la voie PI3K/PKB. Les protéines impliquées dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB étaient présents dans les noyaux isolés. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthèse d’ARN. Nous avons ensuite pu mettre en évidence par qPCR que la stimulation par l’ISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi qu’une diminution de l'expression d’ARNm de NFκB. En contraste, l’ET-1 n’avait aucun effet sur le niveau d’expression de l’ARNr 18S. Nous avons ensuite montré que la stimulation par l’ISO réduisait l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l'activation de NFκB, tandis que l’inhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de démontrer que les βARs et les ETRs nucléaires régulaient un grand nombre de gènes distincts. Finalement, les βARs et ETRs nucléaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isolés, ce qui pouvait être inhibée par le LNAME. Ces résultats ont été confirmés dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cagés et perméables d’ISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nucléaire
détectée par DAF2-DA, causée par l'ET-1 et l'ISO, pouvait être prévenue par le LNAME.
Finalement, l’augmentation de l’initiation de la transcription induite par l'ISO était aussi bloquée par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggérant que la voie NO-GC-PKG est impliquée dans la régulation de la transcription par les βAR. En conclusion, les βARs et les ETRs nucléaires utilisent des voies de signalisation
différentes et exercent ainsi des effets distincts sur l’expression des gènes cardiaques. Ils représentent donc une avenue intéressante pour le développement de drogues
pharmacologiques. / Recently several G protein-coupled receptors (GPCRs) have been shown to localize to intracellular membranes, in particular the nuclear membrane. As such, we sought to determine if the β-adrenergic receptor (βAR) subtypes and their associated signalling machinery are functionally localized to nuclear membranes. We demonstrated the presence of β1AR and the β3AR, but not the β2AR, in adult ventricular myocyte nuclei by western blotting, confocal microscopy and functional assays. Downstream signalling partners such as GαS, Gαi and adenylyl cyclase II and V/VI were also present. Nuclear-localized βARs were functional with respect to ligand binding and effector activation. In isolated nuclei, the non-selective βAR agonist isoproterenol (ISO) and the β3AR-selective ligand BRL37344, but not the β1AR-selective xamoterol, stimulated
transcription initiation in a pertussis toxin (PTX)-sensitive manner. In contrast, stimulation of type B endothelin receptors (ETB), another GPCR family shown to be
present on the nuclear membrane, decreased de novo RNA synthesis. To investigate the signalling pathway(s) involved in GPCR-mediated regulation of RNA synthesis, nuclei were isolated from intact adult rat hearts and treated with receptor agonists in the
presence or absence of inhibitors of the PI3K/PKB and mitogen-activated protein kinase
(MAPK) pathways. Components of p38, JNK, and ERK1/2 MAPK cascades as well as
PKB were detected in nuclear preparations. Inhibition of PKB with triciribine converted
the activation of the βAR from stimulatory to inhibitory with regards to transcription
initiation. Analysis by qPCR indicated isoproterenol treatment increased 18S rRNA but
decreased NFκB mRNA. In contrast, ET-1 had no effect on 18S rRNA expression.
Further investigation using pathway-specific PCR arrays revealed that isoproterenol
treatment also reduced the expression of several other genes involved in the activation
of NFκB and that ERK1/2 and PKB inhibitors attenuated this effect. Subsequent
genome-wide microarray analysis has revealed that nuclear βAR and ETB regulated a
host of genes in an overlapping but distinct manner. Moreover, both ET-1 and ISO
produced an L-NAME-sensitive increase in NO production in isolated cardiac nuclei.
These observations were confirmed in intact cardiomyocytes using novel caged
analogues of ISO and ET-1 and the cell-permable NO-sensitive fluorescent dye, DAF-2
DA. Briefly, both ET-1 and isoproterenol increased NO production, and this increase
was prevented upon preincubation with L-NAME. Moreover, the ability of isoproterenol
to increase transcription initiation in isolated nuclei was blocked by L-NAME or the
PKG inhibitor KT5823, indicating the NO-GC-PKG pathway is involved in the
regulation of gene expression by nuclear βARs. Hence, we have shown that βARs and
ETRs in the nuclear membrane activate distinct signalling pathways, resulting in
different effects on gene transcription and thus represent potentially important targets
for drug development.
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The effect of zilpaterol hydrochloride on feedlot performance and carcass characteristics in weaner steersMantiziba, Chipo Winnie 12 January 2015 (has links)
An experiment was conducted using forty-one Bonsmara steers (age ± 7 months) to
determine the effect of zilpaterol hydrochloride (ZH) on the growth performance and
carcass characteristics. The trial was structured using a completely randomized design
with two treatments, control and ZH group. The steers were fed ZH for 28 consecutive
days at the end of the finishing period and ZH was withdrawn from the diet 2 days prior to
slaughter of the animals. The steers were placed in individual pens and weighed
fortnightly throughout the 4 months trial. Zilpaterol hydrochloride (ZH) was included in the
diet at a rate of 8.3 mg/kg of DM. Feeding of ZH increased (P< 0.05) body weight (BW)
gain and ADG (1.102 vs. 1.444) and tended to increase (P = 0.067) feed efficiency (F:G)
during the last month of the finishing period. There were no significant differences (P>
0.05) in daily dry matter intakes (DMI). For the control group, high treatment weight gains
were significantly associated with high initial weight (r = 0.424, P = 0.049) and also high
pre-treatment body weight (r = 0.678, P= 0.001). Treatment weight gain increased as the
initial and pre-treatment weight gain increased in the control group. For the steers that
were fed ZH, there was no significant correlation between the treatment body weight gain
with initial weight (r = 0.097, P = 0.694) and also pre- treatment live weight (r = 0.393, P =
0.096). Supplementation of ZH significantly increased (P < 0.0001) the dressing
percentage (56.4% vs. 58.4%) and had no significant (P>0.05) effect on the carcass
weight. The outcome of the study suggest that supplementation of ZH in the diet during
the last month of the finishing period enhances growth performance and shows the
repartitioning capacity of the feed additive as a beta- agonist. / Agriculture and Animal Health / M. Sc. (Agriculture (Animal Science)
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Funktionelle Untersuchungen von Ahnak durch Protein-Protein-Wechselwirkungen und in Ahnak-DefizienzmodellenPetzhold, Daria 14 December 2007 (has links)
Ahnak ist ein ubiquitäres Protein, das an einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt ist. In der Herzmuskelzelle ist Ahnak überwiegend am Sarkolemma lokalisiert und bindet an Aktin und an die regulatorischen Beta2-Untereinheit des L-Typ-Kalzium-Kanals. Das Ziel dieser Arbeit war die Funktion von Ahnak im Herzen mit Hilfe eines Knock-out-Maus-Modells und in Bindungsstudien zu untersuchen. Morphologische Untersuchungen zeigten, dass das Längenwachstum adulter Kardiomyozyten bei Ahnakdefizienz signifikant reduziert war. Die Kontraktionseigenschaften adulter isolierter Ahnak-defizienter Kardio-myozyten (im Alter von 6 Monaten) waren ebenfalls verändert. Die Kontraktions- und Relaxaktionsgeschwindigkeiten waren erhöht. Eine Erhöhung des diastolischen Kalzium-Spiegels zeigten die Kardiomyozyten schon im Alter von 3 Monaten. Diese beobachteten phänotypischen Veränderungen lassen vermuten, dass die Aktivität des L-Typ-Kalzium-Kanals erhöht ist. In dieser Arbeit konnte das PXXP-Motiv, in der C-terminalen Ahnak-Domäne, als die hochaffine Beta2-Bindungsstelle (KD ~ 60 nM) identifiziert werden. Substitution von Prolin gegen Alanin verringerte zwar die Bindung zur Beta2-Untereinheit dramatisch (KD ~ 1 µM), hob sie aber nicht auf. In weiteren Bindungsstudien zeigte sich, dass die natürlich vorkommende Missensmutation I5236T die Bindung zur regulatorischen Beta2-Untereinheit verstärkte, dagegen verminderte die PKA-abhängige Phosphorylierung der beiden Proteinpartner die Bindung. Experimente am ganzen isoliert perfundierten Herzen zeigten, dass Ahnak-Knock-Out-Herzen geringer Beta-adrenerg stimulierbar waren. Ahnak scheint wie eine physiologische Bremse des kardialen Kalzium-Kanals zu wirken. / Ahnak is an ubiquitous protein with in unique structure, which has been implicated in cell type specific functions. In cardiomyocytes, ahnak is predominantly localized at the sarcolemma and is associated with actin and with the regulatory beta2 subunit of the L-type calcium-channel. The aim of this work was to unravel the function of ahnak in the heart, using a knock-out-mouse model and binding studies. Morphological studies showed a significant decrease in the cell-length of ahnak deficient cardiomyocytes. The contractile parameters of isolated adult ahnak deficient cardiomyocytes (in the age of 6 month) were altered. The development of tension and relaxation were increased. An increase of diastolic calcium was already observed at the age of 3 month. In general the observed phenotypic changes suggested an increased activity of the L-type calcium-channel. In this study, a PXXP-motif, which locates in ahnaks C-terminus, was identified as the high affinity beta2 subunit binding site (KD ~ 60 nM). Substitution of both proline residues by alanine reduced, but did not abolish the binding (KD ~ 1 µM). Further binding studies revealed that the natural occurring ahnak missense mutation I5236T increases the binding affinity to the regulatory beta2 subunit. By contrast PKA dependant phosphorylation of both protein partners decreases the interaction. In studies with isolated perfused working heart preparations, the ahnak deficient hearts were less beta-adrenergic stimulated than hearts from wild type. Taken together ahnak seems to be a physiological brake of the cardiac calcium-channel.
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Über die differentielle Regulation von Ionenkanälen in spezifischen Nanodomänen atrialer und ventrikulärer Kardiomyozyten / Differential Regulation of Ion Channels in Specific Nanodomains of Atrial and Ventricular CardiomyocytesBrandenburg, Sören 29 June 2017 (has links)
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