Thesis (M.S.)--West Virginia University, 2000. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains xi, 138 p. : ill. (some col.). Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 133-137).

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / INTRODUCCIÓN: La cavidad oral posee una microbiota residente característica, la cual, en un estado de equilibrio, coexiste en armonía con el hospedero y es beneficiosa para el mismo. Esta homeostasis bacteriana puede verse alterada al ser perturbado el hábitat, provocando un desequilibrio de la microbiota residente, lo que induce al desarrollo de patógenos oportunistas que facilitan el progreso de la caries dental, que corresponde a un proceso patológico mediado por bacterias, de origen multifactorial, altamente prevalente y costoso de tratar. Entre estos patógenos, han sido descritas ciertas especies del género Bifidobacterium, las cuales corresponden a bacterias Gram positivo, anaerobias, con propiedades acidogénicas y acidúricas, polimórficamente ramificadas, no móviles y no formadoras de esporas. A la fecha no existen estudios publicados sobre la diversidad de especies y genotipos de Bifidobacterium spp. en la cavidad oral de niños, ni de su asociación con caries. OBJETIVO: Analizar las diversidad de especies y genotipos de Bifidobacterium, en saliva y caries dentinaria de niños chilenos de 7 a 11 años de edad con caries y en saliva de niños libres de caries. MATERIAL Y MÉTODOS: Protocolo aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Odontología. Previo consentimiento de los padres, se tomaron muestras de saliva y caries a niños Chilenos de 7-11 años (9 sin caries y 9 con caries), en la Clínica Odontológica, Universidad de Chile. Las muestras fueron sembradas en el medio de cultivo Triptona - Fitona - Extracto de Levadura modificado (MTPY), selectivo para Bifidobacteriaceae, e incubadas 72 hrs a 37°C en anaerobiosis. De las colonias crecidas, se seleccionaron 16 al azar desde cada muestra, para aislamiento de ADN. A través de la realización de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con oligonucleótidos específicos para Bifidobacteriaceae y oligonucleótidos específicos para amplificación de un fragmento de ADN del gen de 16S rRNA bacteriano, en los casos que no amplificaron con oligonucleótidos específicos para Bifidobacteriaceae. El producto de PCR fue purificado y posteriormente se secuenciaron e identificaron las especies. Finalmente se diferenciaron los genotipos de las especies pertenecientes a la familia Bifidobacteriaceae, mediante PCR basado en secuencias repetitivas (REP-PCR) y se realizaron análisis estadísticos de los resultados. RESULTADOS: No se detectaron Bifidobacterium spp. en la cavidad oral de los sujetos de estudio, sin embargo se aislaron otras especies a partir del medio de cultivo MTPY. Actinomyces odontolyticus fue asociado a la saliva de los niños, independiente de su experiencia de caries. Rothia mucilaginosa se vio asociada a la cavidad oral de los sujetos libres de caries. Lactobacillus spp. se vio asociado a la cavidad oral de sujetos con experiencia de caries. Parascardovia denticolens estuvo fuertemente asociada a sitios de caries. CONCLUSIONES: No se logró validar ni refutar la hipótesis de trabajo del presente estudio, debido a que no fue posible aislar Bifidobacterium spp, desde las muestras de los sujetos participantes. Se encontró asociación entre algunas de las especies aisladas en este estudio, con la experiencia de caries de los sujetos y el tipo de muestra. Los aislados de Parascardovia denticolens presentaron una amplia variedad de genotipos, pero con un mismo origen filogenético. / Adscrito a Proyecto U-inicia Difarp 40/13, VID, U. de Chile

The probiotic bacteria of the genus Bifidobacterium are especially used in the dairy and pharmaceutical industry. They are present in the form of viable cells in pro(syn)biotic fermented milk, dried and freeze-dried products for its positive effects on the health. Lyophilization represents one of the widely used methods for long-term preservation of bifidobacteria. The lyophilization process is challenging, but very needed, and for this reason it is still necessary to explore new cryo(lyo)protective substances, which protect the microbial cultures more effectively before the negative effects of cryopreservation and lyophilization. The aim of the thesis was to test the various mixtures of substances containing specific oligosaccharides, which have prebiotic properties, from the point of view of their potential cryo(lyo)protective effect of lyophilization process. For the purposes of the study, twelve bifidobacterial strains of human and animal origin were selected. As a potential cryo(lyo)protectives were used solutions on the basis of 5x concentrated TPY medium with addition of FOS, 10% fructooligosaccharides (FOS) and the solution on the basis of porcine gastric mucin. Number of viable cells was determined in lyophilisates enriched by the concrete solutions in the time intervals (30 days, 3 months and 6 months) after lyophilization and compared with the control lyophilized samples (fresh cultures without the additive solutions). The potential cryo(lyo)protective effectiveness of 5x concentrated TPY medium solution has been demonstrated only in B. boum, B. breve, B. longum subsp. infantis a Bombiscardovia coagulans, where decreased the number of viable cells about four orders of magnitude. The potential cryo(lyo)protective effectiveness in 10% FOS solution was found only in B. thermacidophilum subsp. porcinum and Bombiscardovia coagulans, where was found half the number of viable cells. The highest potential cryo(lyo)protective effectiveness was observed for a solution on the basis of porcine gastric mucin. The highest number of viable cells was demonstrated in B. animalis subsp. lactis, B. boum, B. longum subsp. infantis, B. longum subsp. longum, B. pseudolongum subsp. globosum and B. thermacidophilum subsp. porcinum lyophilisates using this potential cryo(lyo)protective solution.

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Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / INTRODUCCIÓN: La caries dental es una enfermedad crónica compleja y multifactorial, de componente infeccioso y de alta prevalencia en el ser humano. Se desarrolla producto de la interacción en el tiempo de una producción de ácidos a partir del metabolismo bacteriano, los dientes y la saliva. La microbiota que interactúa en este proceso es muy diversa. Estudios recientes han identificado a miembros de la familia Bifidobacteriaceae como microorganismos participantes de este proceso. Estos estudios son, en su mayoría, en adultos, y no existen análisis que relacionen estos microorganismos con niños. Por otra parte, las bacterias cariogénicas deben presentan mecanismos de patogenicidad para producir la enfermedad, entre los que se han descrito la aciduria, acidogénesis y la adhesión, todas codificadas por genes. En el presente estudio se buscará la presencia de estos mecanismos a partir de los genes ldh, gadB y spaA. OBJETIVO: Determinar la presencia de miembros de la familia Bifidobacteriaceae en saliva y caries de niños Chilenos entre 7 y 11 años de edad y analizar los genes que codifican para los factores de virulencia ldh, gadB y spaA. METODOLOGÍA: Mediante examen clínico, se seleccionó un grupo de 18 niños, 9 niños sin experiencia de caries y 9 con experiencia de caries. Se tomaron muestras de saliva de ambos grupos y muestras de sitio con caries en dentina a niños con experiencia de caries. Se procedió a realizar cultivos en medio MTPY, selectivo para Bifidobacteriaceae. Se aisló ADN genómico desde aislados clínicos seleccionados al azar, se realizó PCR para amplificar un fragmento del ADN del gen 16S ARNr y fueron enviados para su secuenciación. El análisis de estas secuencias permitió identificar las especies presentes en cada muestra. La presencia de los factores de virulencia se realizó por PCR, utilizando partidores específicos para cada gen en análisis (ldh, gadB y spaA). RESULTADOS: Se detectó Parascardovia denticolens, miembro de la familia Bifidobacteriaceae, en el 5,6% de los niños estudiados (n=18). Mediante PCR se determinó que de los aislados clínicos obtenidos, el 50% dió positivo para el factor de virulencia ldh mientras que para los factores de virulencia gadB y spaA no fue posible obtener un amplificado positivo. No se obtuvieron aislados clínicos para otras especies de Bifidobacteriaceae. La especie Actinomyces odontolyticus fue encontrada abundantemente en muestras de saliva del grupo de niños con experiencia de caries y sin experiencia de caries. Se determinó una asociación estadísticamente significativa de este microorganismo a las muestras de saliva de ambos grupos, al comparar con su presencia en los sitios con caries (p=0,01 y p=0,001). Rothia mucilaginosa se encontró asociada a las muestras de saliva en ausencia de experiencia de caries al comparar con su presencia en sitios con caries (p=0,001). CONCLUSIONES: En niños Chilenos entre 7 y 11 años sólo fue posible detectar la presencia de P. denticolens desde sitios con caries, única especie de los siete géneros de la familia Bifidobacteriaceae. Los aislados clínicos de P. denticolens codifican el gen Idh en un 50% de los aislados, mientras que no codifican para los genes spaA y gadB, por lo que estos aislados no usarían estos mecanismos descritos para la adhesión y resistencia de ambientes ácidos. Se encontraron otras especies bacterianas asociadas al tipo de muestra, como A. odontolyticus encontrada en saliva tanto de niños libres de caries como con experiencia de caries. De este mismo modo existen especies bacterianas relacionadas a la ausencia de caries, como R. mucilaginosa. / Adscrito a Proyecto U-inicia difarp 40/13, VID, U. de Chile

Bacteria, belonging to the Lactobacillus bifidus group, were isolated from rectal swabs obtained from healthy babies receiving breast milk. The fermentation properties of these bacteria in cow's milk were studied. Strains potentially suitable for fermentation in a food product were selected according to their ability to produce lactic acid and no gas from lactose, as well as adhering to characteristics common to the bifidus group (Gram positive, catalase negative and blanching morphology). The five strains chosen for intensive study produced 1.14 to 1.25% lactic acid and less than 0.05% volatile acid. The latter organisms could be cultured readily and coagulated milk in less than 24 hr when using a 5% inoculum. Repeated subculture resulted in a change from the branched to the unbranched bacterial morphology. This transformation, which is not unusual among bifid bacteria, was accompanied by a change in ability to produce lactic acid, but no gas was produced by branched or unbranched strains. A great deal of variability in morphology, growth consistency, and acid production was observed among the more than 500 bacterial strains isolated. However, the bifid populations from Caucasian babies was not noticeably different from those of native Indian babies. All of the five strains selected utilized inulin, dextrin, mannitol, and melezitose. A 24 hr culture of fermented milk yielded a product with a mild pleasant natural flavour which could conceivably be altered, if desired, by adding sweeteners or flavouring agents / Land and Food Systems, Faculty of / Graduate

O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da administração tópica de bactérias probióticas do gênero Bifidobacterium na doença periodontal experimental em ratos. Foram utilizados 32 ratos divididos nos seguintes grupos: CT (controle), DPT (doença periodontal), CT-HN019 (controle + probiótico) e DPT-HN019 (doença periodontal + probiótico). No dia 0 do experimento, a doença periodontal foi induzida nos animais dos grupos DPT e DPT-HN019 por meio da colocação de ligaduras ao redor dos primeiros molares inferiores. Nos Grupos CT-HN019 e DPT-HN019, 2 mL de uma suspensão contendo 109 unidades formadoras de colônia/mL de Bifidobacterium animalis subsp lactis (B. lactis) HN019 foram administrados topicamente na região subgengival dos primeiros molares inferiores nos dias 0, 3 e 7 do experimento. Nos grupos CT e DPT, as administrações tópicas foram realizadas com uma suspensão sham (sem probiótico). Todos os animais foram submetidos à eutanásia 14 dias após o início do experimento. Foram coletados tecido gengival, hemi-mandíbulas e biofilme bucal para avaliação dos seguintes parâmetros: i) microbiota bacteriana (checkerboard DNA-DNA hybridization; ii) expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias (análise Multiplex); iii) imunorreatividade de peptídeos antimicrobianos (reações imunohistoquímicas - estreptavidina-biotina-peroxidase); iv) níveis inserção conjuntiva (análise histomorfométrica) e v) microarquitetura e volume ósseos (microtomografia computadorizada por transmissão de raios X). Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística (p < 0,05). O grupo DPT apresentou maiores valores de porosidade óssea, espaçamento de trabéculas ósseas e nível de inserção conjuntiva, bem como menor número de trabéculas e volume ósseos quando comparado a todos os outros grupos (p < 0,05). No Grupo DPT-HN019, foram observados maiores percentuais de bactérias dos complexos amarelo e azul, bem como maiores expressões de Osteoprotegerina (OPG), Beta-defensina (BD)-1, BD-2 e BD-3 quando comparados àqueles do Grupo DPT (p < 0,05). O Grupo DPT apresentou níveis de Interleucina (IL)-1&beta; Receptor Ativador do Fator Nuclear Kappa-beta (RANKL) maiores que aqueles do Grupo DPT-HN019 (p < 0,05). As razões RANKL/OPG e IL-1&beta;/IL-10 foram mais elevadas no grupo DPT do que no Grupo DPT-HN019 (p < 0,05). Dentro dos limites deste estudo pode-se concluir que o uso tópico de B. lactis HN019 promove um efeito protetor contra a perda óssea e de inserção conjuntiva decorrentes da periodontite experimental em ratos. / The purpose of this study was to evaluate the effects of topical administration of probiotic bacteria of the genus Bifidobacterium on experimental periodontal disease in rats. 32 rats were divided into groups C (control), EP (experimental periodontitis), C-HN019 (control + probiotic) and EP-HN019 (EP+ probiotic). On day 0 of the experiment, periodontitis was induced in the animals of groups EP and EP-HN019 through the placement of ligatures around mandibular first molars. In groups C-HN019 and EP-HN019, 2 mL of suspensions containing 109 colony-forming units/mL of Bifidobacterium animalis subsp lactis (B. lactis) HN019 were topically administered in the subgingival region of mandibular first molars on days 0, 3 and 7 of the experiment. In groups C and EP, topical administrations were performed using a sham suspension (without probiotic). All animals were euthanized 14 days after the beginning of the experiment. Gingival tissue, hemi-mandibles and oral biofilm were collected for evaluation of the following parameters: i) bacterial microbiota (checkerboard DNA-DNA hybridization), ii) expression of pro- and anti-inflammatory cytokines (Multiplex analysis), iii) immunoreactivityof antimicrobial peptides (immunohistochemical reactions - streptavidin-biotin-peroxydase); iV) connective tissue attachment levels (histomorphometric analysis) and v) bone microarchitecture and volume (microtomographic analysis). Data were statistically analyzed (p < 0.05). Group EP presented greater values of bone porosity, trabecular separation and connective tissue attachment loss as well as reduced trabecular number and bone volume when compared with all the other groups (p < 0.05). In group EP-HN019, there were greater percentages of bacteria of the yellow and blue complexes and greater expressions of Osteoprotegerin (OPG) and beta-defensins (BD)-1, BD-2 and BD-3 when compared with group EP (p < 0.05). Group EP presented greater levels of Interleukin (IL)-1&beta; and Receptor Activator of Nuclear Factor-Kappa B ligand (RANKL) than group EP-HN019 (p < 0.05). The increase in the ratios RANKL/OPG and IL-1&beta;/IL-10 was greater in group EP than in group EP-HN019 (p < 0.05). Within the limits of the present study, it can be concluded that the topical use of B. lactis HN019 promotes a protective effect against alveolar bone and connective tissue attachment losses attributable to experimental periodontitis in rats.

O experimento foi conduzido nas instalações de gestação e maternidade da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, em Pirassununga, para avaliar o efeito da administração de bactérias probióticas ácido-láticas sobre o ganho de peso de um determinado grupo de leitões logo após o nascimento e antes da primeira mamada do colostro. Para efeito de comparação, criou-se outro grupo de leitões placebo que receberam água destilada em igual volume e manejo. Todos os animais foram pesados semanalmente desde o nascimento até o desmame ocorrido com 21 dias de idade. Os intervalos de ganho de peso médio diário também foram considerados. O probiótico testado não foi eficiente em alterar significativamente o ganho de peso dos animais (P>0,05), porém os leitões que o receberam, obtiveram numericamente maior ganho de peso médio diário, bastante evidente aos 7 e 14 dias de idade, podendo-se justificar a hipótese da existência de uma economia de nutrientes aproveitados pelo hospedeiro que possuía uma microbiota estável e saudável. / The experiment was carried in the gestation and farrowing environment of the Faculty of Veterinary Medicine and Zootechny at University of Sao Paulo, in Pirassununga, to evaluate the effect of lactic acid probiotic bacteria administration on weight gain of a specific group of piglets just after the birth and before first colostrum suckling. For a better comparison, we designed another group of piglets, placebo, which received distilled water in the same volume and manner as probiotic group. All the animals were weighed weekly since birth until weaning, occurred with 21 days old. The average daily weight gain ranges also were considered. The tested probiotic did not change efficiently the weight gain of the animals (P>0,05), however, probiotic treated animals had greater average daily weight gain counts, mainly obvious at 7 and 14 days old, being able to justify the hypothesis of the nutrients economy existence, used by the host, owner of a stable and healthy microbiota.

O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da administração tópica de bactérias probióticas do gênero Bifidobacterium na doença periodontal experimental em ratos. Foram utilizados 32 ratos divididos nos seguintes grupos: CT (controle), DPT (doença periodontal), CT-HN019 (controle + probiótico) e DPT-HN019 (doença periodontal + probiótico). No dia 0 do experimento, a doença periodontal foi induzida nos animais dos grupos DPT e DPT-HN019 por meio da colocação de ligaduras ao redor dos primeiros molares inferiores. Nos Grupos CT-HN019 e DPT-HN019, 2 mL de uma suspensão contendo 109 unidades formadoras de colônia/mL de Bifidobacterium animalis subsp lactis (B. lactis) HN019 foram administrados topicamente na região subgengival dos primeiros molares inferiores nos dias 0, 3 e 7 do experimento. Nos grupos CT e DPT, as administrações tópicas foram realizadas com uma suspensão sham (sem probiótico). Todos os animais foram submetidos à eutanásia 14 dias após o início do experimento. Foram coletados tecido gengival, hemi-mandíbulas e biofilme bucal para avaliação dos seguintes parâmetros: i) microbiota bacteriana (checkerboard DNA-DNA hybridization; ii) expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias (análise Multiplex); iii) imunorreatividade de peptídeos antimicrobianos (reações imunohistoquímicas - estreptavidina-biotina-peroxidase); iv) níveis inserção conjuntiva (análise histomorfométrica) e v) microarquitetura e volume ósseos (microtomografia computadorizada por transmissão de raios X). Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística (p < 0,05). O grupo DPT apresentou maiores valores de porosidade óssea, espaçamento de trabéculas ósseas e nível de inserção conjuntiva, bem como menor número de trabéculas e volume ósseos quando comparado a todos os outros grupos (p < 0,05). No Grupo DPT-HN019, foram observados maiores percentuais de bactérias dos complexos amarelo e azul, bem como maiores expressões de Osteoprotegerina (OPG), Beta-defensina (BD)-1, BD-2 e BD-3 quando comparados àqueles do Grupo DPT (p < 0,05). O Grupo DPT apresentou níveis de Interleucina (IL)-1&beta; Receptor Ativador do Fator Nuclear Kappa-beta (RANKL) maiores que aqueles do Grupo DPT-HN019 (p < 0,05). As razões RANKL/OPG e IL-1&beta;/IL-10 foram mais elevadas no grupo DPT do que no Grupo DPT-HN019 (p < 0,05). Dentro dos limites deste estudo pode-se concluir que o uso tópico de B. lactis HN019 promove um efeito protetor contra a perda óssea e de inserção conjuntiva decorrentes da periodontite experimental em ratos. / The purpose of this study was to evaluate the effects of topical administration of probiotic bacteria of the genus Bifidobacterium on experimental periodontal disease in rats. 32 rats were divided into groups C (control), EP (experimental periodontitis), C-HN019 (control + probiotic) and EP-HN019 (EP+ probiotic). On day 0 of the experiment, periodontitis was induced in the animals of groups EP and EP-HN019 through the placement of ligatures around mandibular first molars. In groups C-HN019 and EP-HN019, 2 mL of suspensions containing 109 colony-forming units/mL of Bifidobacterium animalis subsp lactis (B. lactis) HN019 were topically administered in the subgingival region of mandibular first molars on days 0, 3 and 7 of the experiment. In groups C and EP, topical administrations were performed using a sham suspension (without probiotic). All animals were euthanized 14 days after the beginning of the experiment. Gingival tissue, hemi-mandibles and oral biofilm were collected for evaluation of the following parameters: i) bacterial microbiota (checkerboard DNA-DNA hybridization), ii) expression of pro- and anti-inflammatory cytokines (Multiplex analysis), iii) immunoreactivityof antimicrobial peptides (immunohistochemical reactions - streptavidin-biotin-peroxydase); iV) connective tissue attachment levels (histomorphometric analysis) and v) bone microarchitecture and volume (microtomographic analysis). Data were statistically analyzed (p < 0.05). Group EP presented greater values of bone porosity, trabecular separation and connective tissue attachment loss as well as reduced trabecular number and bone volume when compared with all the other groups (p < 0.05). In group EP-HN019, there were greater percentages of bacteria of the yellow and blue complexes and greater expressions of Osteoprotegerin (OPG) and beta-defensins (BD)-1, BD-2 and BD-3 when compared with group EP (p < 0.05). Group EP presented greater levels of Interleukin (IL)-1&beta; and Receptor Activator of Nuclear Factor-Kappa B ligand (RANKL) than group EP-HN019 (p < 0.05). The increase in the ratios RANKL/OPG and IL-1&beta;/IL-10 was greater in group EP than in group EP-HN019 (p < 0.05). Within the limits of the present study, it can be concluded that the topical use of B. lactis HN019 promotes a protective effect against alveolar bone and connective tissue attachment losses attributable to experimental periodontitis in rats.

O experimento foi conduzido nas instalações de gestação e maternidade da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, em Pirassununga, para avaliar o efeito da administração de bactérias probióticas ácido-láticas sobre o ganho de peso de um determinado grupo de leitões logo após o nascimento e antes da primeira mamada do colostro. Para efeito de comparação, criou-se outro grupo de leitões placebo que receberam água destilada em igual volume e manejo. Todos os animais foram pesados semanalmente desde o nascimento até o desmame ocorrido com 21 dias de idade. Os intervalos de ganho de peso médio diário também foram considerados. O probiótico testado não foi eficiente em alterar significativamente o ganho de peso dos animais (P>0,05), porém os leitões que o receberam, obtiveram numericamente maior ganho de peso médio diário, bastante evidente aos 7 e 14 dias de idade, podendo-se justificar a hipótese da existência de uma economia de nutrientes aproveitados pelo hospedeiro que possuía uma microbiota estável e saudável. / The experiment was carried in the gestation and farrowing environment of the Faculty of Veterinary Medicine and Zootechny at University of Sao Paulo, in Pirassununga, to evaluate the effect of lactic acid probiotic bacteria administration on weight gain of a specific group of piglets just after the birth and before first colostrum suckling. For a better comparison, we designed another group of piglets, placebo, which received distilled water in the same volume and manner as probiotic group. All the animals were weighed weekly since birth until weaning, occurred with 21 days old. The average daily weight gain ranges also were considered. The tested probiotic did not change efficiently the weight gain of the animals (P>0,05), however, probiotic treated animals had greater average daily weight gain counts, mainly obvious at 7 and 14 days old, being able to justify the hypothesis of the nutrients economy existence, used by the host, owner of a stable and healthy microbiota.