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Eine langdauernde Vorinkubation des GPI bzw. des MVD mit Morphin-haltiger Nährlösung (unter in vitro-Bedingungen wird anstelle von Morphin häufig Normorphin verwendet) führte zur Entwicklung von Toleranz und im Falle des GPI zu einer zusätzlichen Abhängigkeits-ähnlichen Reaktion. Die Toleranz manifestierte sich als verminderte Ansprechbarkeit gegenüber dem in Anwesenheit des Morphins akut applizierten Normorphin, während die Gewebeabhängigkeit sich als starke Naloxon-induzierte Kontraktion bemerkbar machte. Diese Kontraktion beruhte auf einer massiven Ausschüttung von Acetylcholin aus den postganglionär parasympathischen Nervenendigungen. Als Erklärung wurde hinzugezogen, dass Naloxon das Morphin von seinen Rezeptoren verdrängt und eine entzugsähnliche Reaktion auslöst. Da nicht nur eine in vitro-Vorinkubation mit Morphin in den beiden Präparaten zur Empfindlichkeitsabnahme gegenüber Morphin/Normorphin führte sondern auch die mehrtägige, subkutane Implantation eines Morphin-Pellets oder einer Opioid-Lösung enthaltenden osmotischen Minipumpe, haben wir über den letzteren Weg selektive Toleranz gegenüber μ- (Morphin, Fentanyl), δ- (DADLE) und κ-Agonisten (Ethylketocyclazocin, MR 2034, MRZ) hervorgerufen. Nach in vivo-Behandlung mit den genannten Substanzen wurde das GPI präpariert, in einer Nährlösung, die den jeweiligen Agonisten in der ungefähr 80-fachen Toleranz-induzierenden Kon-zentration enthielt, aufgehängt und mit Feldelektroden elektrisch stimuliert. Die Reizparameter wurden so gewählt (supramaximale Spannung, 0.5 ms Reizbreite, 0.1 Hz Frequenz), dass ausschließlich das neuronale Gewebe stimuliert wurde, nicht aber der Glattmuskel. In vorhergehenden Experimenten konnte die Rezeptorausstattung des GPI nicht eindeutig identifiziert werden. Mit der Erzeugung der selektiven Toleranz an µ-Rezeptoren wurde die akute Wirkung von sowohl μ- als auch δ-Rezeptor-Agonisten wesentlich vermindert. Demgegenüber, übten κ-Rezeptor-Agonisten ihre Wirkung in unveränderter Intensität aus. Die vollständige Kreuz-Toleranz zwischen Morphin und DADLE schloss das Vorhandensein eines δ-Rezeptors aus, während die fehlende Kreuz-Toleranz zwischen Normorphin/DADLE einerseits und Ethylketocyclazocin andererseits das Vorhandensein eines κ-Rezeptors belegte. Es bedarf einer Erklärung, weshalb die in vivo-Behandlung mit Fentanyl nur geringe Toleranz gegenüber Normorphin auslöste und vice versa (wenig Kreuz-Toleranz), obwohl sich eine hochgradige Toleranz gegenüber derselben Substanz entwickelte. Es wurde geschlussfolgert, dass es verschiedene Subtypen von μ-Rezeptoren gibt, eines mit Empfindlichkeit gegenüber Morphin/Normorphin und ein anderes gegenüber Fentanyl.

Human colony-stimulating factor-1 (CSF-1) was purified from the serum-free conditioned medium of a human pancreatic carcinoma cell line. The four-step procedure included chromatography on DEAE Sepharose, Con A Sepharose and HPLC on phenyl column and reverse-phase C-3 column. The purity of human CSF-1 was demonstrated by sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDS—PAGE) as a single diffuse band with a molecular weight (Mr) of 42,000-50,000 and was further confirmed by a single amino-terminal amino acid residue of glutamate. Under reducing conditions, purified CSF-1 appeared on SDS-PAGE as a single protein band with a Mr of 21,000-25,000 and concurrently lost its biological activity, indicating that human CSF-1 consists of two similar subunits and that the intact quaternary structure is essential for biological activity. When treated with neuraminidase and endo-8~D~N—acetylglucosaminidase D, the Mr of CSF-1 was reduced to 36,000-40,000 and to a Mr of 18,000-20,000 in the presence of mercaptoethanol.

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Project I 2-Deoxystreptamine (2-DOS), the most conserved central scaffold of aminoglycosides, is known to specifically recognize the 5'-GU-'3 sequence step through highly conserved hydrogen bonds and electrostatic interactions within and without the context of aminoglycosides (Figure 1a). We proposed that a novel monomeric unnatural amino acid building block using 2-DOS as a template would allow us to develop RNA binding molecules with higher affinity and selectivity than those currently available. Conjugating two or more of the monomeric building blocks by an amide bond would introduce extra hydrogen bonding donors and acceptors that are absent in natural aminoglycosides and increase specificity of binding to a target RNA through a network of hydrogen bonds. In addition, the amide conjugation between the monomeric building blocks places two GU-base recognizing amines at 5 Å… distance, which is equal to the distance of neighboring base stacks in dsRNAs We hypothesized that targeting dsRNAs containing multiple consecutive 5'-GU-'3 sequence steps would become possible by connecting two or more of the monomeric building blocks by amide bonds. According to the proposed hypothesis, we designed three dimeric 2-DOS compounds connected by an amide bond. These three targets include the dimeric 2-DOS substrate connected by an amide bond, the dimeric 2-DOS containing the sugar moiety from Neamine, and a dimeric 2-DOS connected by a urea linker. These compounds were then tested for sequence specific binding against 8 different RNA strands, and for antibacterial activity against E. coli, actinobacter baumannii and klebsiella. Project II A dual optimization approach was used for to enhance the catalytic activity and chemoselectivity for nitro reduction. In this approach the composition of the nanoparticles and electronics effects of the polymer were studied towards nitro reduction. Bimetallic Ruthenium-Cobalt nanoparticles showed exceptional catalytic activity and chemoselectivity compared to monometallic Ruthenium nanoparticles. The electronic effects of the polymer also had a significant effect on the catalytic activity of the bimetallic nanoparticles. The electron-deficient poly(4-trifluoromethylstyrene) supported bimetallic nanoparticles undergo nitro reduction in 20 minutes at room temperature, whereas electron-rich poly(4-methylstyrene) and poly(4-methoxystyrene) supported bimetallic nanoparticles to longer reaction times to go to completion. Electronics of the polymers also effects the change in mechanism of nitroreduction. Polystyrene bimetallic Ruthenium-Cobalt nanoparticles showed excellent yields and chemoselectivity towards nitro functional group in the presence of easily reducible functional groups like alkenes, alkynes, allyl ethers, propargyl ethers. Monometallic ruthenium nanoparticles also showed excellent reactivity and chemoselectivity towards azide reduction in the presence of easily reducible functional groups. Interestingly monometallic ruthenium nanoparticles showed regioselective reduction of primary azides in the presence of secondary and benzylic azides, also aromatic azides can be selectively reduced in the presence of secondary azides. These polystyrene supported nanoparticles are heterogeneous and are easily separated from the reaction mixture and reused multiple times without significant of catalytic activity.

Eine langdauernde Vorinkubation des GPI bzw. des MVD mit Morphin-haltiger Nährlösung (unter in vitro-Bedingungen wird anstelle von Morphin häufig Normorphin verwendet) führte zur Entwicklung von Toleranz und im Falle des GPI zu einer zusätzlichen Abhängigkeits-ähnlichen Reaktion. Die Toleranz manifestierte sich als verminderte Ansprechbarkeit gegenüber dem in Anwesenheit des Morphins akut applizierten Normorphin, während die Gewebeabhängigkeit sich als starke Naloxon-induzierte Kontraktion bemerkbar machte. Diese Kontraktion beruhte auf einer massiven Ausschüttung von Acetylcholin aus den postganglionär parasympathischen Nervenendigungen. Als Erklärung wurde hinzugezogen, dass Naloxon das Morphin von seinen Rezeptoren verdrängt und eine entzugsähnliche Reaktion auslöst. Da nicht nur eine in vitro-Vorinkubation mit Morphin in den beiden Präparaten zur Empfindlichkeitsabnahme gegenüber Morphin/Normorphin führte sondern auch die mehrtägige, subkutane Implantation eines Morphin-Pellets oder einer Opioid-Lösung enthaltenden osmotischen Minipumpe, haben wir über den letzteren Weg selektive Toleranz gegenüber μ- (Morphin, Fentanyl), δ- (DADLE) und κ-Agonisten (Ethylketocyclazocin, MR 2034, MRZ) hervorgerufen. Nach in vivo-Behandlung mit den genannten Substanzen wurde das GPI präpariert, in einer Nährlösung, die den jeweiligen Agonisten in der ungefähr 80-fachen Toleranz-induzierenden Kon-zentration enthielt, aufgehängt und mit Feldelektroden elektrisch stimuliert. Die Reizparameter wurden so gewählt (supramaximale Spannung, 0.5 ms Reizbreite, 0.1 Hz Frequenz), dass ausschließlich das neuronale Gewebe stimuliert wurde, nicht aber der Glattmuskel. In vorhergehenden Experimenten konnte die Rezeptorausstattung des GPI nicht eindeutig identifiziert werden. Mit der Erzeugung der selektiven Toleranz an µ-Rezeptoren wurde die akute Wirkung von sowohl μ- als auch δ-Rezeptor-Agonisten wesentlich vermindert. Demgegenüber, übten κ-Rezeptor-Agonisten ihre Wirkung in unveränderter Intensität aus. Die vollständige Kreuz-Toleranz zwischen Morphin und DADLE schloss das Vorhandensein eines δ-Rezeptors aus, während die fehlende Kreuz-Toleranz zwischen Normorphin/DADLE einerseits und Ethylketocyclazocin andererseits das Vorhandensein eines κ-Rezeptors belegte. Es bedarf einer Erklärung, weshalb die in vivo-Behandlung mit Fentanyl nur geringe Toleranz gegenüber Normorphin auslöste und vice versa (wenig Kreuz-Toleranz), obwohl sich eine hochgradige Toleranz gegenüber derselben Substanz entwickelte. Es wurde geschlussfolgert, dass es verschiedene Subtypen von μ-Rezeptoren gibt, eines mit Empfindlichkeit gegenüber Morphin/Normorphin und ein anderes gegenüber Fentanyl.:Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis…………………………………………………………………………… 2 Wissenschaftlicher Anteil der Promovendin an der Publikation……………………….. 3 Bibliographische Beschreibung……………………………………………………………. 4 I. Einleitung………………………………………………………………………………… 5 Grundlegende Erklärungen……………………………………………………………. 5 Multiple Opioidrezeptoren……………………………………………………………… 5 II. Wissenschaftlicher Hintergrund………………………………………………………..8 Eigene Publikationen…………………………………………………………………… 8 Fragestellungen der Dissertation………………………………………………………8 III. Zusammenfassung der Arbeit…………………………………………………………. 9 IV. Originalmitteilungen…………………………………………………………………... 3 V. Derzeitiger Stand der Opioidforschung……………………………………………31 Opioidrezeptortypen…………………………………………………………………… 31 Transduktionsmechanismen der Opioidrezeptoren; Toleranz und Abhängigkeit…………….. 32 Zentrale und periphere Opioidanalgesie…………………………………………….. 38 Schlussfolgerungen……………………………………………………………………. 39 VI. Literaturverzeichnis……………………………………………………………………. 40 Eigenständigkeitserklärung……………………………………………………………….. 44 Lebenslauf und Publikationsverzeichnis…………………………………………… 45 Danksagung………………………………………………………………………………… 49

Nicotine exerts a therapeutic effect in ulcerative colitis (UC) but the mechanism underlying this effect, is not clear. However, this effect may imply that nicotine has some, as yet to be discovered, effect on the immune system. The aim of the work described in this thesis was to characterise the nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) on human peripheral blood lymphocytes in term of receptor subtype. To achieve this, a combination of radioligand binding assays, pharmacological and molecular biological techniques were used. The data obtained from the binding studies suggested that the presence of one binding site for (-)- nicotine on human peripheral blood lymphocytes with a Kd 15 ± 5.759 nM (1.5 ± 5.759 x 10-8 M) and Bmax 2253 ± 409 sites/cell. The competition studies showed that ligands competing with [3H]-(-)-nicotine were (-)-nicotine, epibatidine and α-bungarotoxin, while others ligands for nAChRs displaced radiolabelled nicotine in insignificant quantities. Thus, radioligand-binding experiments suggest that the binding site for nicotine on human peripheral blood lymphocytes is a nAChR containing α7 and possibly α4 or/and b2 containing nAChR subunits. No evidence was obtained to suggest the presence of a non-cholinergic nicotine receptor. Furthermore, considerable subject to subject variation in the specific binding of radiolabelled nicotine was observed. Because of this only tentative conclusions could be drawn from radioligand binding data. Polymerase chain reaction (RT-PCR) was then used to demonstrate mRNA for the subunits of nAChRs suggested by radioligand binding studies. Data obtained show that the human peripheral blood lymphocytes tested, expressed mRNAs for α4, α5, α7, β2 neuronal nAChRs subunits and β1 muscle nAChR subunit. Expression of the α5 mRNA subunit of nAChR was observed in the lymphocytes in each sample of lymphocytes tested. In contrast, the expression pattern of mRNAs for α4, α7, β1, and β2 mRNAs subunits of nAChRs, varied between individuals. Finally, Western blot analysis was used to confirm that mRNA expression resulted in the expression of protein for nAChR subunits in human peripheral lymphocytes using monoclonal antibodies against α4, α5, α7, and β2 nAChR subunits, which had been detected by RT-PCR. The results obtained from the Western blot analysis show that protein for α4, α5, and α7 nAChR subunits was expressed in most, but not all of the human peripheral blood lymphocyte samples tested and some of the bands obtained were faint. In contrast, protein for the β2 nAChR subunit was observed in a few samples tested and the bands were faint. From the results obtained in this study, it is possible to conclude that human peripheral blood lymphocytes may contain nAChRs with subunit compositions of α4β2, α4β2α5, and/or α7. However, further studies are necessary to show whether or not the single binding site for nicotine demonstrated by radioligand binding experiments is due to one or all of these nAChRs. Thus, the findings of the present study suggest the presence of nAChR on human peripheral blood lymphocytes. Nicotine and its effect may occur through these non- neuronal nAChRs mechanisms. Such a mechanism of action could account for the beneficial of nicotine in ulcerative colitis. Furthermore, a compound that acts on these receptors, but not on nAChRs found on other cells may have therapeutic utility in the treatment of inflammation.