<p dir="ltr"><i>Pseudomonas aeruginosa</i> (<i>P. aeruginosa</i>) is a Gram-negative bacterium responsible for many infections in immunocompromised humans. This multi-drug resistance human pathogen can form biofilms, which help protect it from not only clinical treatment but also from main homeostasis and metabolism. Understanding biofilm structures is critical to help combat biofilm formation and develop better ways to treat <i>P. aeruginosa</i> infections. A molecule that helps biofilm formation and virulence infections for <i>P. aeruginosa</i> is pyocyanin, which is believed to be correlated with the invasiveness of the bacteria and the stabilization of biofilms. To better understand the role of pyocyanin in assisting <i>P. aeruginosa</i> with survival, we applied optical imaging to study pyocyanin in biofilms and under blue light treatment. Using nonlinear optical imaging methods, we could successfully detect the aggregation of pyocyanin in biofilms. Furthermore, we discovered that pyocyanin protects <i>P. aeruginosa</i> from blue light inactivation. In addition, we found that blue light treatment alters the structure of pyocyanin, leading to irreversible changes that produce distinct spectra in UV-Vis and fluorescence signals. <i>These results provide new insights into how pyocyanin protects </i><i>P. aeruginosa</i> in blue light treatment. Further investigation would lead to better treatment strategies for more effective treatment of <i>P. aeruginosa</i> and biofilms for various infections.</p>

Organic pollutants such as carbon and nitrogen are effectively removed through nature-based solutions, particularly treatment wetlands, research is increasingly focusing on the behavior of and effects to the environment caused by micropollutants. The release of these anthropogenic chemicals into the environment creates a complex mixture of chemicals that can cause quantifiable adverse biological effects. While resent studies indicate the ability of treatment wetlands to remove micropollutants, major questions regarding the removal efficacy of biological effects, the most efficient design aspects (aerated vs. non-aerated; planted vs. non-planted; single-stage vs. two-stage), the resiliency of a treatment wetland, and the potential for optimization are still unsolved. This dissertation investigated these topics by combining cutting-edge methods from engineering, analytical chemistry, and environmental toxicology. The existing knowledge gaps were addressed and the understanding of treatment technologies as well as the potential of treatment technologies to reduce micropollutants and biological effects was improved. In this research, seven treatment wetlands and a municipal wastewater treatment plant were examined over the course of an entire year, to identify the most effective design of the treatment plants in terms of biological effect removal. Intensified wetlands showed higher annual removal efficacy (41 - >99%) than the non-aerated (conventional) horizontal flow wetland (24 – 78%) for investigated micropollutants and biological effects. Removal efficacy for carbamazepine, which is considered to be resistant to aerobic biodegradation, was observed to be higher in the non-aerated horizontal flow treatment wetland than in the intensified wetlands (24 %, 0 – 3 %, respectively). Benzotriazole, diclofenac, activation of aryl hydrocarbon receptor, activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma, and oxidative stress response were removed to a greater extend through the intensified treatment wetlands than by the municipal wastewater treatment plant. Also, for the first time, the effluent qualities of the treatment wetlands were compared with recently proposed effect-based trigger (EBT) values for surface water. The effluent bioanalytical equivalent concentrations (BEQs) for all intensified treatment wetlands and the municipal wastewater treatment plant were close to or even below the surface water EBTs, except for estrogenicity. This indicates the great benefit of using nature-based solutions for water treatment because the treated effluent would not impose a negative ecological effect on a receiving water. Aeration and therefore an elevated oxidation reduction potential was identified as a key environmental condition for increased removal of micropollutants and biological effects. In particular, the two-stage system (aerated vertical flow constructed wetland followed by an unsaturated vertical flow sand filter) achieved the highest removal efficacies for conventional parameters (66 to >99%), micropollutants (94 – 99%, except carbamazepine: 3%) and biological effects (91 – 99%). But also, the less cost-intensive one-stage treatment wetlands (aerated horizontal flow and aerated vertical flow) achieved high quality effluents for the observed parameters. With different aeration strategies, aerobic and anaerobic zones were created in an aerated horizontal flow treatment wetland. The sharp increase of the oxidation reduction potential resulted in a higher mass removal for the moderately biodegradable micropollutants benzotriazole (> 91 %; test system with 50% aeration), and diclofenac (81 %; test system with 50% aeration). But the removal efficacy of biological effects decreased with the enlargement of the non-aerated zone in the treatment wetland. Nevertheless, the combination of aerated and non-aerated zones can reduce moderate micropollutants. The advantage of high removal efficacy for micropollutants and biological effects through aeration comes with the susceptibility to technical disturbances such as a power failure or an air pump failure. A simulated aeration interruption of six days resulted in a poorer water quality (comparable to that of a conventional non-aerated horizontal flow treatment wetland). After switching the aeration back on, the investigated system recovered within a few days for most of the conventional wastewater parameters (8 – 22 d) and micropollutants (3 – 22 d). Results showed that removal of biological effects are negatively affected for a longer period of time (>22 d) than what was indicated by classical parameters or micropollutants alone. These results mark the importance of the use of bioassays for future water quality assessment. With respect to the removal of biological effects, three treatment wetland designs can be recommended: the two-stage system (aerated vertical flow treatment wetland followed by an unsaturated vertical flow sand filter); and the less cost-intensive one stage systems: aerated horizontal flow treatment wetland and aerated vertical flow treatment wetland. The aerated horizontal flow treatment wetland is also resistant to an aeration interruption of a couple of days and recovers, even if it takes longer (indicated by the in vitro bioassays) than indicated through conventional wastewater parameters and micropollutants. The complementary approach of this dissertation contributes to the further understanding of treatment wetlands. Furthermore, the research work provides new insights into removal efficacy of biological effects under various treatment wetland design aspects. This dissertation is intended to help generate and better understand a new generation of treatment technologies.

A avaliação de sedimentos contendo de mistura complexa de substâncias contaminantes é um grande desafio, especialmente em reservatórios localizados próximos a áreas urbanas, onde existe um grande número de fontes de poluição, como é o caso do reservatório Rio Grande. Com o objetivo de proceder uma análise integrada, nós realizamos uma bateria de biotestes usando amostras de sedimento do reservatório Rio Grande e células permanentes da linhagem RTL-W1 e bactérias expostas a extrato acetônico (teste de citotoxicidade, teste de EROD, teste cometa, teste do micronúcleo e teste de flutuação de Ames) e também embriões de Danio rerio (teste de contato com o sedimento). Após a exposição dos embriões, nós retiramos o córion e realizamos medição de metais (ICP-MS) em embriões não coagulados (digestão: H2O2 e HNO3 sob radiação UV). Nós realizamos análises químicas de HPAs alvos no extrato e de dinâmica de metais, esta última avaliada como heterogeneidade temporal e remobilização para a coluna d\'água. O extrato do sedimento se mostrou citotóxico (NR50 = 10,3 mg sedimento equivalente /mL; n=4) e o sedimento se mostrou com elevado potencial tóxico para embriões de peixe (EC50 48h=12 mg sedimento/ mL; n=4). Não foram detectados metais no tecido de embriões não coagulados. Teste de EROD revelou alta atividade enzimática, com EC25 TCDD = 0,82 mg of SEQ/mL, e Bio-TEQ = 1884 pg/g (n=6). A concentração total de HPAs analisados no extrato foi de 763,6 &#181;g/kg; apesar disso, apenas 4.64 % do Bio-TEQ pôde ser explicado pelo PAH-TEQ. O teste de flutuação de Ames e o teste cometa revelaram altos potenciais para mutageno e genotóxicos. Os metais estudados aparentemente não são a causa primária para o efeito agudo observado, assim como os HPAs analisados. Porém, nós encontramos uma alta concentração de metais no sedimento, além de uma heterogeneidade temporal de curto tempo coincidente com a passagem de uma frente fria, e uma possível remobilização de metais para a coluna d\'água, o que levanta a necessidade de um melhor entendimento da dinâmica dos metais em um ambiente aquático como o estudado (tropical e polimítico), além da necessidade de um planejamento cuidadoso de desenhos experimentais de estudos de sedimentos (considerando as escalas temporal e espacial e a massa d\'água como um todo). Análise Integrada por meio de ponderação das evidências indicou a necessidade de ações de manejo para o sedimento do reservatório Rio Grande. No entanto, deve ser realizada a caracterização do risco, no contexto de uma Análise de Risco Ecológica, antes que se decida qual ação tomar, de forma a melhor dirigir o problema. Estudos complementares devem priorizar testes com organismos com exposição crônica a amostras do sedimento do Rio Grande; PCBs e dioxinas devem ser considerados como possíveis indutores de atividade de EROD; análises químicas do sedimento devem ser expandidas e considerar outros compostos orgânicos; técnicas de fracionamento de sedimento devem ser empregadas visando o estabelecimento de causalidade em respeito aos compostos orgânicos / Assessment of complex mixture sediments is a great challenge, especially for reservoir located near urban areas where a multitude of pollution sources is present, such as Rio Grande reservoir. Aiming an integrated assessment, we performed a battery of bioassays on sediment from Rio Grande reservoir, using permanent cell line RTL-W1 and bacteria exposed sediment acetonic extracts (cytotoxicity test, EROD assay, comet assay, micronucleus assay and Ames Fluctuation test) and Danio rerio embryos (whole sediment contact). After exposure, we measured metal (ICP-MS) in dechorionated non-coagulated fish embryos (digestion: H2O2 and HNO3 under UV light radiation). PAH was also measured in extracts and metal dynamics was evaluated as temporal heterogeneity and remobilization to water column. Sediment extract was highly cytotoxic (NR50 = 10.3 mg sediment equivalent /mL; n=4) and whole sediment showed high toxic potential to fish embryos (EC50 48h=12 mg sediment/ mL; n=4). No metal could be detected in the non-coagulated fish eggs, although metals were found in high concentrations with potential to cause negative effect. EROD assay showed dioxin-like activity, with EC25 TCDD = 0.82 mg of SEQ/mL, and Bio-TEQ as high as 1884 pg/g (n=6). Sum of target PAH in sediment extract was 763.6 &#181;g/kg; though 4.64 % of Bio- TEQ could be explained by PAH-TEQ. Ames Fluctuation test and comet assay reveled high potentials for mutageno- and genotoxicity. Studied metals appear not to be the cause of primary acute effect observed toxicity tests, nor seam target PAHs. Yet, we observed high concentration of metal in sediment, short-time temporal heterogeneity of metals coupled with front cold passage and possible remobilization into the water column, what raises the need for better understanding of metal dynamics in such aquatic environment (tropical polymithic) and careful planning for sediment sampling designs (considering temporal and spatial scales and the whole water column above the sediment). Integrated assessment through Weight-of-Evidence (WOE) approach indicates the need of management actions regarding sediment from Rio Grande reservoir. However, characterization of the risk in within an Ecological Risk Assessment (ERA) framework should precede action, in order to better address the problem. Further studies should prioritize chronic exposure of organisms to sediment samples from Rio Grande; PCBs and dioxins should be considered as possible EROD activity inducer; chemical analysis should be expanded and consider other organic chemicals; sediment fractionation technique should also be applied in order to provide insights on causality from organic compounds.

O Estado de São Paulo, devido a seu alto grau de industrialização, grande densidade demográfica e técnicas de produção agrícola, tem grande arte de seus mananciais impactados. As avaliações da qualidade da água são de vital importância para o manejo adequado e recuperação desses sistemas, todavia os programas atuais de monitoramento são incompletos no sentido de não permitirem uma avaliação global dos efeitos dos contaminantes sobre a biota aquática. Esses programas enfocam preferencialmente a coluna d\'água, porém é o sedimento o compartimento preferencial de armazenamento e transformações de contaminantes e nutrientes. Para que, associados a outros estudos e métodos de análise, possam ser desenvolvidas as bases metodológicas para a definição de critérios de qualidade de sedimentos, foram realizados bioensaios crônicos com amostras de sedimento de seis represas do sistema do Rio Tietê (Pedro Beicht, Rasgão, Billings, Barra Bonita, Promissão e Bariri), nos períodos de outubro e novembro de 2000 e de 2001, bem como testes para a determinação da faixa de sensibilidade de Chironomus xanthus às substâncias dicromato de potássio - K2Cr2O7 (4,82 ~ 9,41 mg/L), sulfato de zinco - ZnSO4 (1,46 ~ 13,47 mg/L), cloreto de cádmio - CdCl2 (0,34 ~ 1,11 mg/L), sulfato de cobre - CuSO4(1,13 ~ 1,77 mg/L), cloreto de potássio - KCl (2,91 ~ 3,77 g/L) e atrazina (1,43 ~ 2,72 mg/L). Os resultados dos testes com amostras ambientais indicaram maior toxicidade nos reservatórios de Rasgão e Billings e em menor grau em Barra Bonita e Bariri. / The são Paulo State, due to its high levels of industrialization, great demographic density and agricultural techniques, has most of its water resources compromised. The water quality assessments are fundamental to the appropriate management and recover of these systems, however the existing monitoring programs are incomplete and do not allow the assessment of all the effects that the contaminants can carry out in the aquatic biota. The main approach of these programs is the water column, but the sediment is the preferential compartment of contaminants and nutrient storing and alteration. Associated to other studies and analyses, this work intends to help to develop the methodological basis to define the sediment quality criteria by doing chronic bioassays with sediment samples of six reservoir of the Tietê river system (Pedro Beicht, Rasgão, Billings, Barra Bonita, Promissão e Bariri) , as well as determining the Chironomus xanthus sensibility to the substances K2Cr207 (4,82 ~ 9,41 mg/L), ZnSO4 (1,46 ~ 13,47 mg/L), CdCl2 (0,34 ~ 1,11 mg/L), CuSO4 (1,13 ~ 1,77 mg/L), KCl (2,91 ~ 3,77 g/L) and atrazine (1,43 ~ 2,72 mg/L). The environmental bioassays showed that the highest toxicity was found in Rasgão and Billings reservoirs while Barra Bonita and Bariri showed minor levels of toxic effects.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a viabilidade do uso das espécies Chironomus xanthus e Chironomus riparius na avaliação da qualidade de sedimentos e da contaminação por metais por meio de diferentes ensaios ecotoxicológicos. As amostras de sedimento foram coletados no rio Monjolinho e tributários (14 estações de amostragem). Foi realizada a análise da qualidade da água e do sedimento do sistema utilizando diversas variáveis, tais como nutrientes e metais, sendo possível observar um gradiente crescente de contaminação da nascente em direção à foz do rio Monjolinho. As concentrações dos agrotóxicos organoclorados foram superiores àquelas estabelecidas pela resolução CONAMA 357/05 em apenas algumas estações. Os resultados dos bioensaios laboratoriais com sedimentos indicaram toxicidade aguda em duas estações (Federal e Usina) e nos ensaios in situ observaram-se maiores porcentagens de mortalidade em relação aos ensaios laboratoriais. Os metais Cd e Cu estiveram acima do limite estabelecido pela resolução CONAMA 357/05 em algumas estações de amostragem e, portanto, foram utilizados nos testes de toxicidade aguda e crônica com C. xanthus. Observou-se para o IV instar a \'CL IND.50\' 96h de 0,30 mg/L de Cu e de 0,70 mg/L de Cd. Os testes crônicos com o I instar foram realizados utilizando as concentrações de 1,0 e 70,0 \'mü\'g/L de Cd e 20,0 \'mü\'g/L de Cu e tiveram duração de 16 dias. Na concentração de 1,0 \'mü\'g/L de Cd os resultados foram similares aos apresentados para o controle, exceto para a deformidade do mento. Na concentração de 70,0 \'mü\'g/L de Cd os efeitos foram a redução na sobrevivência, no tamanho do corpo, cápsula cefálica e atraso no tempo de emergência (3 dias). Na exposição ao Cu, não foi observada diferença significativa em nenhum parâmetro analisado quando comparado ao controle. Nos testes de evitamento com C. riparius, verificou-se que as larvas de I instar não evitaram o sedimento contaminado com 2,0 mg/L de Cu e as larvas de II ínstar não evitaram compartimentos com as maiores concentrações de Cu (3,4 mg/L) promovido no experimento de fluxo contínuo. As fêmeas adultas depositaram seus ovos tanto no meio contaminado (1,3 mg/L de Cu) quanto no meio não contaminado, indicando a não preferência. Porém, observaram-se efeitos adversos nas taxas de eclosão e viabilidade dos ovos e das larvas. Com esses resultados conclui-se que as espécies C. xanthus e C. riparius podem ser utilizadas em estudos de toxicidade de sedimentos e de avaliação de risco ecológico, como na contaminação por metais, porém, diferentes parâmetros de avaliação do teste devem ser estudados e cuidadosamente utilizados dependendo da finalidade do estudo. / The purpose of this study was to evaluate the use of Chironomus xanthus and Chironomus riparius to assess sediment quality and metal contamination using different ecotoxicological bioassays. Sediment was collected from Monjolinho river and tributaries (14 sampling stations). Water and sediment analyses were performed by different variables including nutrients and metals. There was an increase of the contamination levels from the fountainhead to the mouth of the river. Organochloride pesticide showed high concentrations (above CONAMA 357/05) in a few number of sampling stations. Laboratory bioassays with sediment demonstrated acute toxicity in two sampling stations (Federal and Usina), and in situ bioassays showed higher percentages of mortality than laboratory bioassay. Acute and chronic toxicity tests were performed with C. xanthus exposed to Cd and Cu. These metals were selected because they presented concentration values above limit established by the CONAMA resolution 357/05. The \'LC IND.50\' 96h for 4th instar larvae was 0.30 mg/L of Cu and 0.70 mg/L of Cd. Chronic tests were carried out in 16 days using 1st instar larvae; the test concentrations were 1.0 and 70.0 \'mü\'g/L of Cd and 20.0 \'mü\'g/L of Cu. No differences were observed between control and 1.0 \'mü\'g/L of Cd, except to mentum deformities. Adverse effects were observed at 70.0 \'mü\'g/L for Cd. These effects were reduction in survival, body length and cephalic capsule width, as well as, emergence time delay (3 days). No differences were observed between control and treatment in relation to Cu. Avoidance tests using C. riparius showed that 1st instar larvae did not avoid sediment contaminated with 2.0 mg/L of Cu. Similarly, 2nd instar larvae of C. riparius submitted to the flow-through system did not avoid the compartments with the higher concentration of copper (3.4 mg/L). Egg-laying females deposited egg-masses in both contaminated (1.3 mg/L of Cu) and uncontaminated media. Therefore, there was no preference in relation to oviposition. On the other hand, adverse effects were observed for eclosion and eggs hatchability. The conclusion is that C. xanthus and C. riparius can be used in toxicity bioassays to asses sediment quality and ecological risk, like metal contamination, but different end points have to be selected and applied carefully used depending on the study purpose.

A vinhaça é um resíduo da produção de álcool após a fermentação do mosto e destilação do vinho, resultando de 10 a 15 litros para cada litro de etanol produzido. Este efluente altamente colorido é um sub-produto rico em nutrientes, principalmente materia orgânica, tendo um alto potencial poluente quando disposto no ambiente. Os fungos ligninolíticos podem ser utilizados para a remediação de poluentes, como a vinhaça, pela ação de enzimas peroxidases. Foram utilizadas em ensaios para descoloração da vinhaça três linhagens de fungos ascomicetos e cinco de basidiomicetos sendo que o basidiomiceto Pleurotus sajor-caju CCB 020 se destacou dos demais. A descoloração foi concomitante com o aumento das atividades de lacase e manganês peroxidase. Entretanto ficou evidende que a lacase é a enzima de maior importância na descoloração. P. sajor-caju é comestível tendo seus valores nutricionais determinados na literatura. A vinhaça desencadeou o processo de estresse oxidativo no fungo, fato observado através da elevação da atividade de enzimas (superóxido dismutase, catalase e glutationa redutase) associadas a mecanismos de detoxificação de espécies ativas de oxigênio. Quando comparado com crescimento em meio sintético, o cultivo submerso de P. sajor-caju em vinhaça demonstrou aumento na produção de biomassa (1,06 g 100 mL-1), e aumento na atividade das enzimas como a lacase (variando entre 400 e 450 UI L-1) alcançada entre o 9° e 10º dia e para MnP alcançada no 12° dia de cultivo (variando de 60 a 100 UI L-1), a 28ºC, com agitação constante. Nos mesmos tratamentos foram observadas reduções de: 82,76% na DQO, de 75,29% da DBO, da coloração em 99,17% e da turbidez em 99,73%, indicando a participação destas enzimas na despolimerização de compostos fenólicos e pigmentos de melanoidinas. Após 15 dias de tratamento com o fungo, foi evidenciada a redução de toxicidade da vinhaça determinada por exposição aos organismos: Pseudokirchneriella subcapitata, Daphnia magna, Daphnia similis e Hydra attenuata. Foi concluído que o uso do sistema vinhaça e P. sajor-caju pode ser aplicado em bioprocessos de remoção de cor e na degradação de compostos complexos da vinhaça, ocorrendo destoxicação e melhora em suas qualidades podendo ser indicada como água de reuso, produção de enzimas lacases e manganês peroxidase e aproveitamento de biomassa. / Vinasse is a residue resulting from the production of alcohol after pulp fermentation and distillation of the wine, ensuing from 10 to 15 liters for each liter of ethanol produced. This high colored effluent is a by-product rich in nutrients, mainly organic matter, having a high pollutant potential when disposed in the environment. Lignolytic fungi can be utilized in the remediation of pollutants, such as vinasse, by the action of peroxidases. Assays for the decolorization of vinasse by three ascomycetes fungi and five basidiomycetes were performed and consequently selecting the fungus Pleurotus sajor-caju CCB 020. The activities of manganese-dependent peroxidases (MnP) and laccases and the quantification of the decolorization after the treatment of the vinasse by P. sajor-caju were evaluated and it was observed that this fungus can be utilized to biodegrade and decolorize the vinasse at a concentration of 100% without the necessity of dilution. P. sajorcaju is an edible fungus with nutritional values determined in the literature. The vinasse trigged the process of oxidative stress in the fungus, fact observed through the elevation of the enzyme activities (superoxide dismutase, catalase and glutathione reductase) associated to mechanisms of detoxifying reactive oxygen species. When compared to the growth in synthetic medium, the tests in submerged vinasse cultivation with P. sajor-caju demonstrated a raise in the biomass production (1,06 g 100 mL-1), and in the enzyme activities such as laccase (varying from 400 to 450 U L-1) reached between the 9th and 10th day of growth and for MnP at the 12th day of cultivation (varying from 60 a 100 U L-1), indicating the participation of these enzymes in the depolymerization of phenolic compounds and melanoidins pigments. In the same treatments were observed reductions of 82,76% in COD, 75% of BOD, 99,17% in the color and 99,73% for the turbidity. After the treatment with the fungus, a reduction in the toxicity was evident through the exposition of Pseudokirchneriella subcapitata, Daphnia magna, Daphnia similis e Hydra attenuata. It was concluded that the system P.sajor caju/vinasse can be utilized as a bioprocess for color removal and degradation of complex molecules. It was observed an improvement in the characteristics and detoxification allowing it to be utilized as reused water, laccase and manganese peroxidase enzymes production and for fungal biomass production with a high nutritional value.

Submitted by Mariana Dornelles Vargas (marianadv) on 2015-05-26T13:54:04Z No. of bitstreams: 1 analise_potencial.pdf: 1430284 bytes, checksum: 12436295c40ce78cf9c53abb0f1e16e3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-26T13:54:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 analise_potencial.pdf: 1430284 bytes, checksum: 12436295c40ce78cf9c53abb0f1e16e3 (MD5) Previous issue date: 2012-10-26 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A bactéria Bacillus thuringiensis exibe alta atividade tóxica específica para insetos devido à sintese de delta-endotoxinas, codificadas por genes cry. A presente pesquisa visou avaliar a atividade tóxica de cepas de Bacillus thuringiensis oriundas de regiões orizícolas do Estado do Rio Grande do Sul, como agente de controle de insetos-praga da cultura do arroz irrigado e milho Spodoptera frugiperda e Ostrinia nubilalis, a fim de selecionar cepas potenciais para o controle das mesmas e identificar se as atividades enzimáticas dos receptores alcalino fosfatase (ALP) e aminopeptidase (APN) podem ter um importante papel na resistência de B. thuringiensis. Neste trabalho foram utilizados testes fenotípicos e técnicas de PCR para a identificação das subclasses do gene cry1; perfil de proteínas para a observação da composição do complexo esporo-cristal, rep-PCR para a observação da variabilidade genética, DNA plasmidial, quantificação das enzimas ALP e APN para se observer perfil de resistência das cepas e a atividade tóxica frente aos insetos-praga. Os ensaios de quantificação de proteínas de ALP e APN apresentaram níveis reduzidos, sendo um biomarcador potencial para a resistência de toxinas Cry. Os resultados dos estudos de rep-PCR demonstraram um elevado grau de similaridade entre as regiões orizícolas, provavelmente associadas à especiação ecológica. Na caracterização do perfil protéico, os resultados revelaram diferenças entre as cepas em estudo, sendo algumas semelhantes àquelas utilizadas como padrão da análise (Bt. thuringiensis 4412; Bti IPS 82 e Bt. sorovar HD1). Nos ensaios do perfil plasmidial, as cepas formaram três padrões distintos. Para os dados de toxicidades avaliados pelos bioensaios com as lagartas de primeiro ínstar de O. nubilalis, todas as cepas testadas apresentaram mortalidade superior a 75%, com destaque à cepa Bt.1893-15 que causou 95%. Nos dados dos ensaios biológicos realizados contra as lagartas de S. frugiperda, a cepa Bt. 3420-11 destacou-se com mortalidade superior a 88%. / The bacterium Bacillus thuringiensis presents a high specific activity against insects due to delta-endotoxin syntheses, codified by cry genes. This study aimed to evaluate the toxic activity of strains of B. thuringiensis derived from rice fields of Rio Grande do Sul, as an agent of control of insect pest of rice and corn Spodoptera frugiperda and Ostrinia nubilalis, in order to select potential strains to control and identify whether the enzymatic activity of alkaline-phosphatase (ALP) and aminopeptidase (APN) receptors may play an important role in the resistance of B. thuringiensis. In this study we used phenotypic tests and PCR techniques to identify subclasses of gene cry1; proteins profile to observe the composition of the spore- crystal complex, rep-PCR for the observation of genetic variability, plasmid DNA, quantification of the enzymes ALP and APN to observe resistance profile of strains and bioassay capacity against insect pests. Assays for quantification of proteins ALP and APN showed reduced levels being a potential biomarker for resistance to Cry toxins. The results of studies of rep-PCR demonstrated a high degree of similarity between the rice regions, probably associated with ecological speciation. Regarding the protein profile characterization, the results revealed differences between the strains, some being similar to those used as standard analysis (Bt thuringiensis 4412, Bt IPS 82 and Bt HD1). In trials of plasmid profile, the strains formed three distinct patterns. In data and toxicity assessed by bioassays against first instar O. nubilalis larvae, all tested strains showed mortality exceeding 75%, highlighting the Bt strain 1893-15, which caused 95% mortality. In the data of the biological assays conducted against S. frugiperda larvae, the Bt strain 3420-11 stood out showing mortality greater than 88%.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a viabilidade do uso das espécies Chironomus xanthus e Chironomus riparius na avaliação da qualidade de sedimentos e da contaminação por metais por meio de diferentes ensaios ecotoxicológicos. As amostras de sedimento foram coletados no rio Monjolinho e tributários (14 estações de amostragem). Foi realizada a análise da qualidade da água e do sedimento do sistema utilizando diversas variáveis, tais como nutrientes e metais, sendo possível observar um gradiente crescente de contaminação da nascente em direção à foz do rio Monjolinho. As concentrações dos agrotóxicos organoclorados foram superiores àquelas estabelecidas pela resolução CONAMA 357/05 em apenas algumas estações. Os resultados dos bioensaios laboratoriais com sedimentos indicaram toxicidade aguda em duas estações (Federal e Usina) e nos ensaios in situ observaram-se maiores porcentagens de mortalidade em relação aos ensaios laboratoriais. Os metais Cd e Cu estiveram acima do limite estabelecido pela resolução CONAMA 357/05 em algumas estações de amostragem e, portanto, foram utilizados nos testes de toxicidade aguda e crônica com C. xanthus. Observou-se para o IV instar a \'CL IND.50\' 96h de 0,30 mg/L de Cu e de 0,70 mg/L de Cd. Os testes crônicos com o I instar foram realizados utilizando as concentrações de 1,0 e 70,0 \'mü\'g/L de Cd e 20,0 \'mü\'g/L de Cu e tiveram duração de 16 dias. Na concentração de 1,0 \'mü\'g/L de Cd os resultados foram similares aos apresentados para o controle, exceto para a deformidade do mento. Na concentração de 70,0 \'mü\'g/L de Cd os efeitos foram a redução na sobrevivência, no tamanho do corpo, cápsula cefálica e atraso no tempo de emergência (3 dias). Na exposição ao Cu, não foi observada diferença significativa em nenhum parâmetro analisado quando comparado ao controle. Nos testes de evitamento com C. riparius, verificou-se que as larvas de I instar não evitaram o sedimento contaminado com 2,0 mg/L de Cu e as larvas de II ínstar não evitaram compartimentos com as maiores concentrações de Cu (3,4 mg/L) promovido no experimento de fluxo contínuo. As fêmeas adultas depositaram seus ovos tanto no meio contaminado (1,3 mg/L de Cu) quanto no meio não contaminado, indicando a não preferência. Porém, observaram-se efeitos adversos nas taxas de eclosão e viabilidade dos ovos e das larvas. Com esses resultados conclui-se que as espécies C. xanthus e C. riparius podem ser utilizadas em estudos de toxicidade de sedimentos e de avaliação de risco ecológico, como na contaminação por metais, porém, diferentes parâmetros de avaliação do teste devem ser estudados e cuidadosamente utilizados dependendo da finalidade do estudo. / The purpose of this study was to evaluate the use of Chironomus xanthus and Chironomus riparius to assess sediment quality and metal contamination using different ecotoxicological bioassays. Sediment was collected from Monjolinho river and tributaries (14 sampling stations). Water and sediment analyses were performed by different variables including nutrients and metals. There was an increase of the contamination levels from the fountainhead to the mouth of the river. Organochloride pesticide showed high concentrations (above CONAMA 357/05) in a few number of sampling stations. Laboratory bioassays with sediment demonstrated acute toxicity in two sampling stations (Federal and Usina), and in situ bioassays showed higher percentages of mortality than laboratory bioassay. Acute and chronic toxicity tests were performed with C. xanthus exposed to Cd and Cu. These metals were selected because they presented concentration values above limit established by the CONAMA resolution 357/05. The \'LC IND.50\' 96h for 4th instar larvae was 0.30 mg/L of Cu and 0.70 mg/L of Cd. Chronic tests were carried out in 16 days using 1st instar larvae; the test concentrations were 1.0 and 70.0 \'mü\'g/L of Cd and 20.0 \'mü\'g/L of Cu. No differences were observed between control and 1.0 \'mü\'g/L of Cd, except to mentum deformities. Adverse effects were observed at 70.0 \'mü\'g/L for Cd. These effects were reduction in survival, body length and cephalic capsule width, as well as, emergence time delay (3 days). No differences were observed between control and treatment in relation to Cu. Avoidance tests using C. riparius showed that 1st instar larvae did not avoid sediment contaminated with 2.0 mg/L of Cu. Similarly, 2nd instar larvae of C. riparius submitted to the flow-through system did not avoid the compartments with the higher concentration of copper (3.4 mg/L). Egg-laying females deposited egg-masses in both contaminated (1.3 mg/L of Cu) and uncontaminated media. Therefore, there was no preference in relation to oviposition. On the other hand, adverse effects were observed for eclosion and eggs hatchability. The conclusion is that C. xanthus and C. riparius can be used in toxicity bioassays to asses sediment quality and ecological risk, like metal contamination, but different end points have to be selected and applied carefully used depending on the study purpose.

Submitted by Geyciane Santos (geyciane_thamires@hotmail.com) on 2015-06-09T14:25:49Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Nivea Maria Simões Falcão.pdf: 1851149 bytes, checksum: 9f64cfee0db539642d59a412a4bf9eea (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-09T19:30:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Nivea Maria Simões Falcão.pdf: 1851149 bytes, checksum: 9f64cfee0db539642d59a412a4bf9eea (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-09T19:32:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Nivea Maria Simões Falcão.pdf: 1851149 bytes, checksum: 9f64cfee0db539642d59a412a4bf9eea (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-09T19:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Nivea Maria Simões Falcão.pdf: 1851149 bytes, checksum: 9f64cfee0db539642d59a412a4bf9eea (MD5) Previous issue date: 2010-03-30 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leishmaniasis is a world public health problem wide considered by the World Health Organization as one of five infectious endemic diseases of major relevancy. The search for leishmanicids agents with fewer side effects is one of the greatest challenges in modern research, and is increasingly related to the uses of medicinal plants and other natural products. The species Caesalpinia ferrea Martius widely distributed in Brazil it is popularly used for many therapeutic purposes, including the treatment of various infections like those caused by leishmaniasis, making it a promising tests of biological activity against leishmania. The objective of this study was to evaluate by bioassays the activity of hexane and methanol extracts against protozoa, analyzing semi-purified fractions obtained from the most active. The fruits of C. ferrea were collected at the National Institute of Amazon Research, V8’s Campus in the City of Manaus - AM and processed in the departments of Natural Products and leishmaniasis and Chagas Diseases at INPA. The studies were performed with the whole fruit and its separate parts, coconut shell and seed. Hexane e methanol crude extracts were prepared from the fruits, coconut shell and seeds, which were tested to evaluate the biological activity in vitro against promastigotes of the stationary phase of the protozoan Leishmania (Viannia) guyanensis. The extracts were analyzed by thin layer chromatography Comparison (CCDC) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to determine the chromatographic profile. All biological assays were carried out experimentally in vitro in microplates containing 106/mL promastigotes to axenic cultures of L. (V.) guyanensis evaluating the inhibitory activity and stimulating parasite growth. The most active crude extract was submitted to CCDC and fractionation by partition líquid-líquid resulting in semi-purified fractions that were evaluated for their chemical composition. The results showed that the epicarp methanolic extract of C. ferrea, showed anti-leishmanial activity for L. (V.) guyanensis in the concentration of 20 mg/mL/24h. However, contrary to expectations, there was a stimulatory effect on L. (V.) guyanensis by the hexanic extract obtained from the fruit seed of C. ferrea. Chemically analyzing the coconut shell and fruits methanolics extracts of, which showed anti-leishmanial activity, we verified the presence of substances such as chlorophyll, flavonoids, xanthones, tannins, triterpenes and saponins as major constituents, and shows antioxidant activity. The results showed that the methanolics extracts of coconut shell and fruitsof C. ferrea can be considered as an promising alternative in the treatment of cutaneous leishmaniasis and should be undertaken pharmacological and toxicological tests in vivo of extract, making other fractioning in order to isolate the substances responsible for the anti-leishmanial activity. / A leishmaniose é um problema de saúde pública mundial considerada pela Organização Mundial da Saúde como uma das cinco doenças infecto-parasitárias endêmicas de maior relevância. A busca por agentes leishmanicidas com poucos efeitos colaterais é um dos maiores desafios na pesquisa moderna, e cada vez mais está relacionada aos usos de plantas medicinais e outros produtos naturais. A espécie Caesalpinia ferrea Martius largamente distribuída no Brasil, é usada popularmente para muitos fins terapêuticos, inclusive no tratamento de diversas infecções como as causadas pela Leishmaniose, tornando-a promissora para a realização de ensaios de atividade biológica contra a leishmania. O objetivo deste trabalho foi o de avaliar, através de bioensaios, a atividade de extratos hexânicos e metanólicos contra protozoários, analisando também frações semi-purificadas obtidas do extrato de melhor atividade leishmanicida. Os frutos de C. ferrea foram coletados no Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Campus do V8 na Cidade de Manaus-AM, e processados nos departamentos de Produtos Naturais e de Leishmaniose e Doença de Chagas no INPA. Os estudos foram realizados com os frutos inteiros e suas partes separadas, epicarpos e sementes. Foram preparados extratos brutos hexânicos, e metanólicos a partir dos frutos inteiros e também das partes separadas, epicarpos e sementes, os quais foram submetidos aos ensaios para avaliação da atividade biológica in vitro contra formas promastigotas da fase estacionária de protozoários da espécie Leishmania (Viannia) guyanensis. Os extratos brutos foram analisados através de Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) e Ressonância Magnética Nuclear (RMN) para determinação do perfil cromatográfico. Todos os ensaios biológicos foram realizados experimentalmente in vitro, em microplacas contendo 106/mL formas promastigotas de culturas axênicas de L. (V.) guyanensis (MHOM/BR/75/IM 4147) avaliando-se a atividade inibitória ou ativadora de crescimento parasitário. O extrato bruto de melhor atividade biológica foi submetido à CCDC e fracionamento por partição líquido-líquido obtendo-se frações semi-purificadas que foram avaliadas quanto a sua composição química. Os resultados mostraram que o extrato metanólico do epicarpo de C. ferrea, apresentou atividade leishmanicida para L. (V.) guyanensis na concentração de 20 mg/mL/24h. No entanto, ao contrário das expectativas, houve um efeito estimulante em L. (V.) guyanensis pelo extrato hexânico obtido das sementes de frutos de C. ferrea. Analisando quimicamente o extrato metanólico de frutos e epicarpos, os quais demonstraram atividade leishmanicida, verificou-se a presença de substâncias como a clorofila, flavonóides, xantonas, taninos, triterpenos e saponinas como constituintes majoritários, além de apresentar atividade antioxidante. Os resultados obtidos demonstraram que os extratos metanólicos de frutos e epicarpos de C. ferrea podem ser considerados como importantes alternativas no tratamento das leishmanioses, devendo ser realizado testes farmacológicos e toxicológicos in vivo desses extratos, realizando outros fracionamentos a fim de se confirmar alguma substância de melhor atividade leishmanicida.

A alelopatia, na qual uma espécie causa efeitos negativos sobre outra através da liberação de substâncias químicas, é um fenômeno que pode afetar comunidades vegetais. Em alguns casos, o estabelecimento de arbustos aromáticos em formações densas, com apenas poucas espécies ocorrendo em suas proximidades, é um padrão que tem sido relacionado aos efeitos fitotóxicos dos voláteis que os mesmos liberam. Em campos dos sul do Brasil, esse padrão de estabelecimento frequentemente ocorre para as espécies arbustivas aromáticas Heterothalamus psiadioides Less e Baccharis patens Baker, indicando a possibilidade de alelopatia. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo determinar se H. psiadioides e B. patens são fitotóxicas e se isso implica em efeitos negativos sobre a comunidade vegetal na qual os arbustos ocorrem. Em ensaios em laboratório, os efeitos dos voláteis liberados diretamente das folhas frescas e secas de H. psiadioides e B. patens foram testados sobre a germinação e o crescimento das plantas-alvo alface e cebola nas quatro estações do ano. Em um estudo em campo, foram avaliadas cobertura e biomassa vegetal, número de mudas, diversidade, riqueza, e variáveis de estrutura da vegetação no entorno de ambas as espécies arbustivas e onde não havia arbustos. Nos bioensaios, os voláteis de H. psiadioides e B. patens causaram inibição na porcentagem e velocidade de germinação e redução no tamanho da raiz e da parte aérea das plantas-alvo, sendo que folhas frescas apresentaram maior fitotoxidez. Esses parâmetros foram mais afetados por H. psiadioides que por B. patens em todas as estações, e os efeitos de ambas foram menores no verão. Em relação à investigação em campo, que objetivou avaliar os efeitos da espécie muito fitotóxica H. psiadioides sobre a comunidade vegetal, não foram observadas evidências de alelopatia. Houve maior riqueza e diversidade próximo a H. psiadioides, devido à menor cobertura de gramíneas dominantes. Variáveis de estrutura da vegetação e intensidade de luz explicaram os padrões observados de forma mais conclusiva que alelopatia. Esse estudo sugere que o potencial alelopático de plantas pode ser superestimado em bioensaios e que estudos em campo são necessários para demonstrar se efeitos alelopáticos são realmente relevantes em comunidades vegetais. Ainda, o trabalho ressalta a importância de conduzir estudos mais realistas em laboratório e de utilizar controles em estudos em campo. / Allelopathy, in which a species causes negative effects on another through the release of chemical substances, is a phenomenon that may affect plant communities. In some cases, the establishment of aromatic shrubs in dense stands, with few other species occurring in their surroundings, has been related to the phytotoxic effects of volatiles released by these shrubs. In South Brazilian grasslands, this pattern of establishment often occurs for the aromatic shrub species Heterothalamus psiadioides Less and Baccharis patens Baker, indicating the possibility of allelopathy. Thus, this study aimed to determine if H. psiadioides and B. patens are phytotoxic and if this implicates in negative effects on the plant community in which the shrubs occur. In laboratory assays, the effects of the volatiles released directly from fresh and dry leaves of H. psiadioides and B. patens on germination and growth of the target plants lettuce and onion were evaluated in four seasons. A field study was carried out, in which vegetation cover and biomass, number of seedlings, diversity, richness, and variables of vegetation structure were evaluated in the surroundings of both species and where there were not shrubs. In the bioassays, H. psiadioides and B. patens volatiles inhibited the germination rate and speed of germination and reduced the root and shoot length of the target plants, with fresh leaves showing higher phytotoxicity. These parameters were more strongly affected by H. psiadioides than by B. patens in all seasons, and effects of the both shrubs were lower in summer. In relation to the field investigation that aimed to quantify the effects of the highly phytotoxic H. psiadioides on the plant community, no evidences of allelopathy were found. Richness and diversity were higher near H. psiadioides, due to lower cover of dominant grasses. Variables of vegetation structure and light intensity explained vegetation patterns more conclusively than allelopathy. This study emphasizes that the allelopathic potential of plants can be overestimated in bioassays, and that field studies are necessary to elucidate if allelopathic effects are in fact significant in plant communities. Still, the relevance of conducting more realistic laboratory studies and of using controls in field studies is highlighted.