Cette thèse décrit la synthèse de l'asparagine et de la glutamine utilisés pour la biosynthèse des protéines chez Helicobacter pylori. La plupart des acides aminés (aa) sont liés à leur ARNt correspondant par les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS). Ces enzymes sont très spécifiques, et leur fonction est importante pour le décodage correct du code génétique. L'asparaginyl-ARNt synthétase et la glutaminyl-ARNt synthétases (AsnRS et GlnRS) sont l'une ou l'autre, ou les deux absentes de la plupart des bactéries, des archaea, et des organelles. Chez les bactéries et les organelles, des aaRS à double fonction nommées aaRS non-discriminantes (ND) participent avec une aminoacyl-ARNt amidotransférase, la GatCAB, à la formation du glutaminyl-ARNtGln et de l'asparaginyl-ARNtAsn. Les aaRS-ND, soit la glutamyl-ARNt synthétase-ND (ND-GluRS) et l'aspartyl-ARNt synthétase (ND-AspRS), forment l'aminoacyl-ARNt synonyme (Glu avec ARNtGlu) mais lient aussi l'acide aminé à l'ARNt de sa forme amidée (Glu avec ARNtGln). La GatCAB agit ensuite en transamidant le Glu-ARNtGln et l'Asp-ARNtAsn en Gln-ARNtGln et en Asn-ARNtAsn, respectivement. Chez H. pylori, la synthèse du Glu-ARNtGln est faite par une aaRS discriminante spéciale formant seulement le produit mésapparié. Cette GluGlnRS est aussi nommée GluRS2, puisque l'organisme possède une autre GluRS (GluRS1) discriminante formant seulement le Glu-ARNtGlu. La voie indirecte de la formation de l'Asn-ARNtAsn et du Gln-ARNtGln chez H. pylori et ses mécanismes de contrôle contre la mauvaise utilisation des aminoacyl-ARNt mésappariés est décrite. Tout d'abord, les premières évidences d'un channeling de l'Asp-ARNtAsn de l'AspRS-ND vers la GatCAB (Chapitre 3) mettent en scène la coopération entre ces deux enzymes permettant le contrôle de la molécule mésappariée. Une seconde publication montre la formation d'un complexe ternaire formé par la GluRS2, la GatCAB et l'ARNtGln et démontre comment ce complexe en coopération avec un rééchantillonage du substrat par la GluRS2 permettent un décodage plus fiable et plus efficace des codons Gln (Chapitre 5). Une troisième publication confirme la formation d'un complexe par l'AspRS-ND, la GatCAB et l'ARNtAsn (Chapitre 6). Ce complexe, ainsi que l'existence d'un second mode de liaison de l'ARNtAsn à l'AspRS-ND allant à l'encontre des caractéristiques connues de cette famille d'aaRS, augmentent la fidélité du décodage des codons Asn chez H. pylori. Au cours de ces travaux, en collaboration avec le groupe du Prof. Robert Chênevert (co-directeur de la thèse), des composés synthétiques ont été testés pour leur activité inhibitrice contre la GatCAB. Les premiers inhibiteurs de cette enzyme qui sont analogues à l'aa-ARNt, et le développement des méthodes de cette analyse, sont aussi présentés (Chapitres 3 et 4). / This work was focused on the formation of glutamine and asparagine used for protein biosynthesis in Helicobacter pylori. Most amino acids (aa) are linked to their cognate tRNAs by aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS). These enzymes have a high specificity, and their function is key to the proper decoding of mRNA. One or both of the enzymes responsible for the formation of glutaminyl-tRNAGln and asparaginyl-tRNAAsn are absent from most bacteria, archaea, as well as organelles. In bacteria and organelles, dual-function aaRSs dubbed non-discriminating (ND), are used in conjunction with an aminoacyl-tRNA amidotransferase called GatCAB, to form these amidated aminoacyl-tRNAs. ND-AspRS forms the canonical Asp-tRNAAsp, but also Asp-tRNAAsn. Meanwhile, in H. pylori, the task of forming Glu-tRNAGln which is filled by an ND-GluRS in most organisms, is filled by a special, discriminating enzyme forming only the mismatched product. This GluGlnRS has been called GluRS2, the other, Glu-tRNAGlu forming enzyme being called GluRS1. Work is presented describing these two pathways in H. pylori. One publication was the first to provide data suggesting that ND-AspRS could provide Asp-tRNAAsn to GatCAB through substrate channeling (Chapter 3). The second showed formation of a ternary complex formed by GluRS2, GatCAB and tRNAGln, allowing efficient and correct decoding of Gln codons, including resampling of the substrate by GluRS2 (Chapter 5). A third manuscript confirms earlier results by describing the formation of a ternary complex formed by ND-AspRS, GatCAB and tRNAAsn (Chapter 6). This work also furthers our understanding of the kinetics of aminoacylation, by showing that ND-AspRS has two different behaviours, each one consistent with one of the two, evolutionarily unrelated families of aaRSs. Throughout my thesis, collaboration with the group of Prof. Robert Chênevert (co-director of this thesis) sought to design, synthesize and test compounds for inhibitory activity against GatCAB. The first inhibitors which are analogues of the aminoacyl-tRNA substrate for this enzyme, and the development process of the methods used to test them are described in Chapters 3 and 4).

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Mycobacterium tuberculosis atteint le tiers de la population mondiale et cause plus de 1.5 millions de décès chaque année. L’augmentation des infections chez les patients immuno-compromis et l’émergence d’infections à de nouvelles souches multirésistantes aux antibiotiques somme la communauté scientifique à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi qu’au développement de nouveaux antibiotiques, vaccins et thérapies. Parmi les ~ 4000 gènes du génome de Mycobacterium tuberculosis, un d’entre eux, glbN, code pour l’hémoglobine tronquée N. Les hémoglobines sont de petites métalloprotéines qui fixent réversiblement l’oxygène et qui effectuent plusieurs activités catalytiques importantes. Ainsi, nos recherches s’inscrivent dans le cadre d’une approche biochimique qui vise à définir une fonction pour l’hémoglobine tronquée N de Mycobacterium tuberculosis à l’aide de techniques biochimiques modernes et de la spectroscopie à flux-arrêté. Nos recherches nous amènent également à résoudre la structure tridimensionnelle du complexe oxygéné de trHbN, à caractériser les interactions protéines-ligands au site actif de l’hémoglobine et à définir leurs rôles dans l’établissement du potentiel fonctionnel de l’enzyme en utilisant les spectroscopies d’absorption, de résonance Raman et de diffraction des rayons X. Nous avons découvert que l’activité rapide et efficace de détoxication aérobie du •NO de l’hémoglobine tronquée N mesurée chez Mycobacterium bovis BCG pourrait remplir un rôle similaire chez Mycobacterium tuberculosis et permettre la persistance de l’infection tuberculeuse dans l’hôte par la prévention des effets cytotoxiques associés au •NO et à ses dérivés réactifs azotés. De plus, l’architecture et la polarité du site actif de l’hémoglobine tronquée N définissent le potentiel fonctionnel de la protéine et contrôlent la diffusion, la fixation, la stabilisation, l’activation des ligands coordonnées au fer de l’hème et assurent le maintien d’une activité catalytique rapide et efficace. Finalement, nos découvertes suggèrent que l’hémoglobine tronquée N pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique pour le développement éventuel de drogues inhibitrices qui inactiveraient la première ligne de défense du parasite et perturberaient son adaptation métabolique face aux stress oxydatifs. / Mycobacterium tuberculosis infects over one-third of the human population, causing 1.5 millions deaths each year. The increase incidence of infections among immunocompromised patients and the emergence of strains with resistance to multiple antibiotics urge the scientific community to discover new therapeutic targets as well as develop new antibiotics, vaccines and therapies. Among the ~ 4000 genes that compose the genome of Mycobacterium tuberculosis, one of them, glbN, encodes the truncated hemoglobin N. Hemoglobins are small metalloproteins that reversibly bind oxygen and perform a wide array of important catalytic activities. Thus, our research aims at defining a function for Mycobacterium tuberculosis truncated hemoglobin N using modern biochemical techniques and stopped-flow spectroscopy. Our research also leads us to solve the three-dimensional structure of the oxygenated complex of trHbN, characterize the proteins-ligands interactions within the active site of the hemoglobin and define their roles in establishing the functional potential of the enzyme using absorption, resonance Raman and x-rays diffraction spectroscopies. We discovered that the fast and efficient •NO detoxification activity of truncated hemoglobin N measured in Mycobacterium bovis BCG could fulfill a similar role in Mycobacterium tuberculosis and allow the persistence of the tuberculous infection in the host by preventing the cytotoxic effects associated with •NO and its reactive nitrogen derivatives. Moreover, the architecture and polarity of truncated hemoglobin N active site define the functional potential of the protein and control the diffusion, binding, stabilization, and activation of the heme-iron coordinated ligands and ensure the maintenance of a fast and efficient catalytic activity. Finally, our discoveries suggest that truncated hemoglobin N could constitute a new therapeutic target for the development of inhibitors that would inactivate the first line of defence of the parasite and disturb its metabolic adaptation to nitrosative stresses.

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Partie I L’analyse de données de relaxation des spins à l’aide de l’approche model-free est très répandue pour obtenir des informations sur la dynamique des protéines aux échelles de temps ps-ns et μs-ms. Afin d’extraire des informations de qualité, les données sont enregistrées à plusieurs champs magnétiques. Combiner de telles données est cependant sujet aux erreurs expérimentales. Ainsi, la consistence des données de relaxation à plusieurs champs doit être vérifiée. Malheureusement, cela s’effectue rarement, i.e. on assume simplement que les données sont correctes. Nous proposons donc une approche simple pour la vérification de la consistence de données de relaxation enregistrées à plusieurs champs. L’utilisation des test proposés améliore l’analyse et réduit la présence artéfactuelle d’échange conformationnel. Ainsi, comme les données d’échange conformationnel sont souvent discutées en terme de liaison de substrat ou de catalyse, s’assurer de leur validité améliore la compréhension biologique du système étudié. Partie II Les b-lactamases de classe A sont impliquées dans la résistance aux antibiotiques. Elles y participent en hydrolysant les b-lactamines. Ces enzymes ont été étudiées par différentes approches : études mutationnelles, simulations de dynamique moléculaire, cristallographie des rayons X et RMN. L’enzyme modèle de cette classe, TEM-1, a précédemment été étudiée par RMN dans notre laboratoire. TEM-1 est très rigide sur l’échelle de temps des ps-ns, mais subit des mouvements lents μs-ms au niveau du site actif. Afin de mieux caractériser la dynamique des b-lactamases de classe A, l’homologue PSE-4 a aussi été étudié par RMN avec des données de relaxation des spins, de dispersion de relaxation par CPMG et d’échange d’amides. Les mêmes conclusions que pour TEM-1 ont été obtenues : rigidité générale élevée et présence de mouvements lents près du site actif. Ces mouvements pourraient être conservés chez les b-lactamases de classe A et ainsi avoir un lien avec la catalyse enzymatique. Cette hypothèse est renforcée par les données RMN pour cTEM-17m, une chimère TEM-1/PSE-4, pour laquelle plusieurs résonances près du site actif sont non observées dû à un élargissement causé par ces mouvements lents. / Part I The analysis of spin relaxation data using the model-free formalism is a widely used approach to get insights into protein dynamics on the ps-ns and μs-ms timescales. In order to extract high quality data, multiple magnetic field datasets are required. Combining datasets recorded using different NMR magnets is prone to experimental errors. Hence, the consistency of multiple field spin relaxation data must be carefully verified. Analysis of multiple field spin relaxation data generally proceeds without verification of consistency, i.e. with only the assumption that data is fine. We propose a simple approach to verify the consistency of multiple field relaxation data. Using the proposed tests improves the analytical approach by reducing the presence of artifactual conformational exchange terms. Since these terms are often rationalised in relation with ligand binding or catalysis, improving their confidence yields a better understanding in terms of biology. Part II Class A b-lactamases are involved in antibiotics resistance. They do so by hydrolysing the b-lactam antibiotics. These enzymes have been widely studied by different approaches including mutational studies, MD simulations, X-ray crystallography and NMR. The model enzyme for this class of proteins, TEM-1, has previously been studied by NMR in the laboratory. It was observed that TEM-1 is a highly ordered protein on the ps-ns timescale, with slower μs-ms motions clustered around the active site. In order to characterize further the backbone dynamics of class A b-lactamases, the homologous enzyme PSE-4 was studied by NMR using different approaches such as spin relaxation, CPMG relaxation dispersion, and amide exchange experiments. The same conclusions as for TEM-1 were obtained with a high rigidity along the sequence balanced by slower motions in the vicinity of the active site. These motions might be conserved in class A b-lactamases and potentially be important for catalysis. This hypothesis is further enforced by the backbone resonance assignments for cTEM-17m, a TEM-1/PSE-4 chimera, where many resonances are unobservable around the active site, potentially suffering from line broadening caused by slow motions.

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