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Les β-lactamases sont le principal mécanisme bactérien de défense contre les β-lactamines. Elles catalysent l’inactivation de ces antibiotique par le clivage de leur noyau β-lactame. Les β-lactamases les plus communes sont celles de la classe A, qui rassemble une grande variété d’enzymes aux spécificités de substrat variées. Ces protéines ont été l’objet de nombreuses recherches expérimentales et théoriques. Plusieurs études de dynamique par spectroscopie RMN ont été réalisées dans notre laboratoire sur les enzymes modèles TEM-1 et PSE-4. Le présent projet continue l’investigation de ces deux β-lactamases par des méthodes théoriques. Un protocole de simulation de DM a été établi et validé par comparaison avec des données de relaxation RMN. Une nouvelle technique d’analyse conjointe DM/RMN a également été développée, permettant de limiter les problèmes de sous et sur-ajustement présents dans l’analyse « model-free ». Pour comparer la dynamique des β-lactamases de classe A en présence et en absence de leur substrat, un potentiel pour les β-lactamines a été développé, en tenant compte de la géométrie et du potentiel chimique particuliers du noyau β-lactame. Ce champ de forces est transférable, permettant la construction d’une variété d’antibiotiques. Nos simulations, couplées aux précédentes études par RMN, démontrent qu’il existe une dualité dynamique dans les β-lactamases de classe A : elles sont hautement structurées à l’échelle ps-ns, mais aussi le siège de mouvements lents (µs-ms) aux abords du site actif et particulièrement dans la boucle qui borde le site catalytique. La rigidité ps-ns favorise un positionnement optimal des résidus du site actif pour une catalyse efficace, et permet la tolérance de mutations potentiellement déstabilisantes. Les mouvements à l’échelle µs-ms les plus intéressants sont localisés dans la boucle Ω et confirment son rôle régulatoire : elle permet l’ouverture du site actif pour l’entrée du substrat et le largage du produit. La liaison du substrat a des effets à longue portée rigidifiant TEM-1. On observe également un mouvement accru de la boucle Ω dans TEM-1 et PSE-4. Les interactions spécifiques menant à cette plus grande flexibilité varient toutefois d’une enzyme à l’autre : il y conservation des propriétés dynamiques. / β-Lactamases are the main bacterial mechanism of resistance against β-lactams. They inactivate these antibiotics by cleaving their β-lactam ring. Class A enzymes are the most prevalent, with a broad variety of substrate specificities. These proteins were studied by numerous experimental and theoretical studies. NMR spectroscopy measurements were performed in our laboratory on model enzymes TEM-1 and PSE-4. This project continues the investigation of the dynamic properties of these two β- lactamases using theoretical methods. An MD simulation protocol was established and validated using NMR relaxation data. A new joint MD/NMR analysis technique was developped, allowing a reduction of under- and over-fitting problems in model-free analysis. To compare class A β-lactamase dynamics in presence and absence of substrate, a potential was developped to describe β-lactams, taking into account the particular geometry and chemical potential of the β-lactam cycle. This force field is transferable, allowing the construction of a variety of antibiotics. Our simulations, along with past NMR studies, prove the existence of a dynamical duality in class A β-lactamases : they are highly structured on the ps-ns timescale, but also subjected to slow motions (µs-ms) in the vicinity of the active site, particularly in the Ω loop that borders the catalytic site. Ps-ns rigidity favors an optimal positioning of active site residues for an efficient catalysis, and allows the protein to tolerate potentially destabilizing mutations. The most interesting µs-ms motions are located in the Ω loop, confirming its regulatory role : it opens the active site for substrate entry and product release. Substrate binding has structuring long-range effects on TEM-1. Increased loop motions are also observed in both TEM-1 and PSE-4. However, specific interactions responsible for this higher flexibility vary between the two enzymes : protein dynamics properties are conserved. / Tableau d'honneur de la FÉSP

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Le Phytophthora ramorum Werres est responsable de la mort de dizaines de milliers de chênes sur la côte ouest-californienne depuis 1995. On nomme cette maladie l’encre des chênes rouges ou la mort subite du chêne. Cet organisme appartient au même genre que le Phytophthora infestans, agent causal de la famine irlandaise de la pomme de terre du 19e siècle. Il fut découvert en 1993, infectant des rhododendrons et des viornes en Europe. Depuis, il a été démontré qu’il pouvait infecter plus d’une centaine d’espèces de plantes, non seulement sur la côte ouest américaine, mais également au Canada et dans plusieurs pays d’Europe. Des mesures de quarantaine ont été mises en place, essentiellement en pépinières où sa prolifération est la plus efficace, afin d’éviter sa propagation dans d’autres États américains ou d’autres pays. Il est donc nécessaire de développer des outils de détection, et d’identification. La détection moléculaire et le génotypage peuvent être des outils importants pour découvrir et mieux comprendre la biologie de ces populations et les mouvements de cet agent pathogène. La disponibilité des séquences complètes du génome du P. ramorum, depuis 2004, apporte une nouvelle ressource pour l’identification de gènes portant du polymorphisme et la conception d’outils pour les études de populations. Les objectifs de ce projet de recherche proposés sont : de développer des outils moléculaires pour identifier le P. ramorum et le différencier des autres Phytophthora; de découvrir des loci différenciant le polymorphisme intra-spécifique du P. ramorum; de réaliser des études de populations entre les populations européennes et nord-américaines connues avec les différents marqueurs développés. Par le biais d’analyses bioinformatiques et de séquençage d’ADN, la méthodologie employée consiste au développement d’outils de diagnostic tels que la PCR en temps réel utilisant des sondes et amorces spécifiques au P. ramorum sur trois loci et de les distinguer des autres espèces de Phytophthora connues. D’ailleurs, ces analyses ont permis d’identifier plusieurs polymorphismes de nucléotides simples (SNPs) (Single Nucleotide Polymorphisms), dans treize gènes totalisant 6.3 kb utilisant la notion de volatilité des codons. Dans une collection d’isolats provenant d’Europe et d’Amérique du nord, des profils de SNPs distincts et fortement corrélés avec l’origine géographique ont été identifiés. Les populations du P. ramorum en Californie et Oregon, présentent généralement trois profils uniques de SNPs et semblent plus être dérivés d’un ou quelques clones, quelques individus nouvellement trouvés présentant des insertions et délétions. En Europe plusieurs génotypes ont été retrouvés et les gènes sélectionnés semblent avoir des homologies avec des protéines de la paroi cellulaire et donc pourraient jouer un rôle dans l’adaptation. Cette thèse présente donc l’utilisation et la découverte de nouveaux gènes présentant du polymorphisme permettant de détecter et différencier le P. ramorum des autres espèces de Phytophthora mais également de connaître les origines et une identification des individus par leurs polymorphismes. / Phytophthora ramorum Werres is responsible of mortality of ten thousand of oak trees on the California coast since 1995. This disease is called sudden oak death, Ramorum blight, canker. This organism is on the same genus than Phytophthora infestans, the causal agent of Irish potato famine on the 19th century. P. ramorum was discovered in 1993 infecting Rhododendron and Viburnum in Europe. Since, it was demonstrated that it could infect more than one hundred plant species, not only on the American west coast but also in Canada and many European countries. Quarantine measures were placed in effect, principally in plant nurseries where the spread is more efficient to prevent propagation in other American States or other countries. That is necessary to develop detection and identification tools. The molecular detection and genotyping could be important tools to discover and understand le biology of the population and movement of this pathogen. The availability of complete sequences from the P. ramorum genome since 2004 permitted to use new resources for identification of gene sharing potential polymorphism and conception of tools for population studies. The objectives of this research project were: to develop molecular tools for identification of P. ramorum and differentiate it from other Phytophthora species; to discover loci differentiating intra-specific polymorphism of P. ramorum; and finally to realize population studies between European and North American population known with the different markers developed. With utilisation of bioinformatics and DNA sequencing, the method used was to develop diagnosis tool with real-time PCR using specific probes and primers for P. ramorum on three different loci and distinguish it from the other Phytophthora species known. Moreover, these analyses allowed identification of multiple single nucleotide polymorphisms (SNPs), in thirteen genes for a total of 6.3 kb based on codon volatility. In a collection of isolates from Europe and North America, distinct SNPs profiles and correlated with the geographic origin were identified. P. ramorum populations in California and Oregon present generally three unique SNPs profiles and seem to drift from one or few clones, new individual newly discovered with insertion-deletion mutation. In Europe, many genotypes were found and the selected genes had homologies with proteins implicated in cell wall. This could have an implication on adaptation and evolution. This thesis presents utilisation and discovery of new genes sharing polymorphisms allowing to detect and differentiate P. ramorum form other Phytophthora species and moreover to known the origin and identification of individuals by their polymorphisms.

Le virus de l’hépatite C (VHC) représente un problème majeur de santé publique avec au dessus de 120 millions de personnes infectées et à ce jour aucun traitement capable de contrer de manière efficace ce virus. Le VHC a été découvert en 1989, classé dans la famille des flaviviridae et est le seul représentant du genre hepacivirus. Il s’agit d’un virus enveloppé, formé donc d’une bicouche lipidique, d’une capside, et d’un acide nucléique (ARN). La capside virale est formée d’une seule et unique protéine appelée « Core ». Il s’agit d’une protéine de 177 acides aminés sous sa forme mature. Il a été démontré au sein du laboratoire du Professeur Denis Leclerc que la première moitié de la protéine (C82) était suffisante pour générer à la fois in vivo et in vitro la formation de la capside virale. Ayant comme objectif de comprendre les mécanismes régissant l’assemblage viral, nous avons étudié cette protéine d’un point de vue structural. Suite à la mise au point d’un protocole robuste d’expression, de marquage isotopique et de purification, nous avons étudié la Core C82 par dichroïsme circulaire et résonance magnétique nucléaire. Les données expérimentales obtenues suggèrent que la Core C82 est non structurée et flexible, confirmant ainsi l’analyse de la séquence primaire et les prédictions de structure secondaire de la Core. Nous avons ainsi mis en évidence que la moitié N-terminale de la Core du VHC appartenait à la famille des protéines intrinsèquement non structurées (IUP). Les IUPs sont des protéines peu ou très peu structurées et parfois capables de se structurer en liaison à un partenaire (protéine, acide nucléique, petite molécule). Nous avons donc, dans le but de structurer la Core C82, testé de multiples conditions de sel, détergent, agent lipomimétique et un partenaire protéique (protéine p53). Seul l’ajout d’un agent lipomimétique (2,2,2-trifluoroéthanol, TFE) à la Core C82 est venu modifier sa structure et sa dynamique. Nous avons ainsi pu démontrer que la Core C82 pouvait adopter une structure en hélice α. Nous avons, de plus, confirmé que ce repliement était également présent dans des versions tronquées plus longues de la Core (formes C124 et C170). Enfin, nous avons, parallèlement à son étude structurale, mis au point un test in vitro d’inhibition de l’assemblage. Cet outil nous a permis de découvrir plusieurs peptides dérivés de la séquence protéique de la Core et de la protéine NS5A du VHC, ayant un effet inhibiteur sur l’assemblage viral in vitro de la Core mature (C170). Ces travaux innovateurs représentent une avenue encourageante vers la découverte d’un moyen efficace de soigner l’infection au VHC. Au final, même si la structure 3D de la Core mature reste non déterminée, notre étude structurale de la Core C82 est la plus complète réalisée à ce jour à l’échelle atomique. Par ailleurs, nos travaux préliminaires sur la forme mature de la Core (C170) semblent être très prometteurs et permettraient de déterminer la structure 3D de la protéine Core mature. / The hepatitis C virus (HCV) is a major public health problem with more than 120 million infected people, and to date no efficient treatment is available. HCV was discovered in 1989, classified in the flaviviridae family, and is the only member of the hepacivirus genus. It is an enveloped virus, consisting in a lipid bilayer, a capsid, and a ribonucleic acid (RNA). The viral capsid is composed by only one protein called “Core” protein. It is a 177 amino acid long protein in its mature form. It was demonstrated in our laboratory that the first half of this protein (C82) was sufficient to generate, both in vivo and in vitro, the assembly of the viral capsid. In order to understand the mechanism controlling the capsid assembly, we have studied the structural aspect of this protein. After developing robust protocols of overexpression, isotope labelling and purification of the protein C82, we studied this truncated form using circular dichroism and nuclear magnetic resonance. The experimental data obtained suggest that Core C82 is an unstructured and very flexible protein, thus confirming primary sequence analysis and secondary structure predictions. We established that the N-terminal half of the Core protein is a member of the intrinsically unstructured protein family (IUP). IUPs are proteins which are totally or partially unstructured, but can sometimes undergo a structural change induced by the binding of a partner (protein, nucleic acid, small molecule). In order to induce a structured form of the C82 protein, we have tested a large range of conditions of salt, detergent, lipomimetic solvent, as well as interaction with a proteic partner (p53). Only the addition of a lipomimetic agent (2,2,2-trifluoroethanol, TFE) to the Core C82 protein resulted in a structural and a dynamical change. In this special condition, we were able to demonstrate that the Core C82 can adopt an α-helix conformation. We have, moreover, confirmed that this conformation was also present in longer truncated form of the Core protein (C124 and C170). We also, along its structural analysis, developed an in vitro test to inhibit the assembly of the Core protein. This tool allowed us to discover several small peptides derived from the HCV Core and NS5A proteins amino acid sequences, with an inhibitory effect on the viral assembly of the mature Core protein (C170). This innovative work is potentially an interesting step towards the development of an efficient treatment against HCV. Ultimately, even if the 3D structure of the mature Core protein remains unsolved, our structural study of the C82 truncated form is the most comprehensive study to date at an atomic resolution. Moreover, our preliminary works on the mature form of the Core protein (C170) are very promising and should eventually lead to the three dimensional structure.

La mort cellulaire programmée (PCD) est un processus physiologique ou pathologique permettant l’élimination sélective de cellules devenues inutiles, endommagées ou infectées pour le maintien de l’intégrité ou l’adaptation (fitness) de l’organisme ou de la population cellulaire. Chez les végétaux, les mécanismes moléculaires régulant la PCD ne sont pas encore élucidés, mais la découverte que la protéine humaine anti-PCD Bax Inhibitor-1 (BI-1) est conservée chez les plantes, pourtant dépourvues de la protéine pro-PCD Bax, en a fait un candidat fort prometteur pour l’élucidation de sentiers de mort évolutivement conservés. En ce sens, cette thèse décrit la caractérisation d’orthologues de BI-1 isolés de Brassica napus (BnBI-1) et de Nicotiana tabacum (NtBI-1). Nous avons déterminé par des analyses informatiques et des études d’expression que BI-1 est une protéine membranaire intégrale possédant sept domaines transmembranaires putatifs et localisée au réticulum endoplasmique. Des essais fonctionnels dans des cellules humaines HEK 293 ont révélé que des orthologues végétaux de BI-1 peuvent inhiber la PCD (apoptose) induite par Bax dans ces cellules. Par ailleurs, des lignées cellulaires de tabac présentant des niveaux inférieurs de la protéine NtBI-1 grâce à l’expression d’un ARNm antisens entament un programme précoce de PCD suite à une déficience en carbone, démontrant ainsi le rôle anti-PCD intrinsèque de BI-1 dans des cellules végétales. Nous avons également découvert que la protéine NtBI-1 est surexprimée en présence de cytokinines (CK) dans des cultures cellulaires de tabac, et ce à des concentrations coïncidant avec l’établissement d’une réponse de stress, un phénomène impliquant des mécanismes de régulation post-transcriptionnels. La réponse cellulaire envers les CK comprend également un influx rapide de Ca2+ de l’apoplaste vers le cytosol. Cet influx est partiellement impliqué dans l’induction de la PCD mais non dans la signalisation menant à la surexpression de BI-1. L’ensemble de nos résultats indique que BI-1 est bel et bien un régulateur négatif de la PCD végétale, qui agirait au sein d’un sentier de mort évolutivement conservé. L’augmentation de l’accumulation de la protéine NtBI-1 lors de la réponse de stress envers les CK pourrait contribuer à la survie des cellules et laisse supposer que la protéine est impliquée dans l’activité anti-sénescence des CK. BI-1 s’insère dans un sentier où son niveau d’expression influence la capacité cellulaire à résister aux stress générés entre autres par une disette en carbone, et ce potentiellement via la modulation de l’homéostasie du Ca2+ intracellulaire. / Programmed cell death (PCD) is a physiological or pathological process allowing the selective elimination of useless, damaged or infected cells with the aim of maintaining the integrity or fitness of the remaining organism or cell population. In plants, molecular mechanisms regulating PCD are not yet elucidated, but the identification of functional plant orthologs of the human anti-PCD protein Bax Inhibitor-1 (BI-1), given that the pro-PCD protein Bax is absent in the plant kingdom, revealed the potential of BI-1 as an evolutionary conserved cell death regulator. Accordingly, this thesis describes the characterization of BI-1 orthologs isolated from Brassica napus (BnBI-1) and Nicotiana tabacum (NtBI-1). While combining bioinformatics analysis and localization studies using a fusion between BnBI-1 and the green fluorescent protein, we determined that BI-1 is an integral membrane protein provided with seven putative transmembrane domains localized at the endoplasmic reticulum. We also proceeded to functional assays in human HEK 293 cells, and we demonstrated that plant BI-1 orthologs can inhibit Bax-induced PCD (apoptosis) in these mammalian cells. On the other hand, we demonstrated that tobacco cell lines expressing lower levels of the NtBI-1 protein via an antisens mRNA induced an early PCD program under carbon starvation. We also discovered the up-regulation of NtBI-1 when cultured cells were grown in the presence of cytokinins (CKs), which correlated with the establishment of a stress response. The phenomenon involved post-transcriptional regulatory mechanisms of the BI-1 protein accumulation. Cellular response to CKs also involved a rapid influx of Ca2+ from the apoplast to the cytosol and this influx is partly involved in PCD induction but not in signaling leading to BI-1 modulation. Taken together, our data indicate that BI-1 is a negative regulator of plant PCD that would act in an evolutionary conserved death pathway. NtBI-1 protein over-accumulation in the stress response to CKs could contribute to cell survival and suggests the involvement of the protein in the senescence-delay activities of CKs. BI-1 is part of a pathway where its expression level influence cellular ability to resist to carbon starvation- or senescence-induced stresses, potentially via modulation of intracellular Ca2+ homeostasis. / Inscrite au Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures