Introduction: Bone defects and non-unions caused by trauma, tumor resection, pathological degeneration, or congenital deformity pose a great challenge in the field of orthopedics. Traditionally, these defects have been repaired by using autografts and allografts. Autografts have set the gold standard for clinical bone repair because of their osteoconductivity, osteoinductivity and osteogenicity. Nevertheless, the application of autografts is limited because of donor availability and donor site morbidity. Allografts have the advantage that the tissues are readily available and can be easily applied, especially when large segments of bone are to be reconstructed. However, their use is also limited by the risk of disease transfer and immune rejection. To circumvent these limitations tissue engineering has evolved as a means to develop viable bone grafts. An ideal bone graft should be both osteoconductive and osteoinductive, biomechanically strong, minimally antigenic, and eliminates donor site morbidity and quantity issues. The biodegradable polymer, Poly lactic-co-glycolic acid (PLAGA) was chosen because of its commercial availability, biocompatibility, non-immunogenicity, controlled degradation rate, and its ability to promote optimal cell growth. To improve the mechanical properties of PLAGA, Single Walled Carbon Nanotubes (SWCNT) were used as a reinforcing material to fabricate composite scaffolds. The overall goal of this project is to develop a Single Walled Carbon Nanotube composite (SWCNT/PLAGA) for bone regeneration and to examine the interaction of MC3T3-E1 cells (mouse fibroblasts) and hBMSCs (human bone marrow derived stem cells) with the SWCNT/PLAGA composite via focusing on extracellular matrix production and mineralization; and to evaluate its toxicity and bio-compatibility in-vivo in a rat subcutaneous implant model. We hypothesize that reinforcement of PLAGA with SWCNT to fabricate SWCNT/PLAGA composites increases both the mechanical strength of the composites as well as the cell proliferation rate on the surface of the composites while expressing osteoblasts phenotypic, differentiation and mineralization markers; and SWCNT/PLAGA composites are biocompatible and non-toxic, and are ideal candidates for bone tissue engineering. Methods: PLAGA and SWCNT/PLAGA composites were fabricated with various amounts of SWCNT (5, 10, 20, 40 and 100mg), characterized and degradation studies were performed. PLAGA (poly lactic-co-glycolic acid) and SWCNT/PLAGA microspheres and composites were fabricated; characterized and mechanical testing was performed. Cells were seeded and cell adhesion/morphology, growth/survival, proliferation and gene expression analysis were performed to evaluate biocompatibility. Sprague-Dawley rats were implanted subcutaneously with Sham, poly lactic-co-glycolic acid (PLAGA) and SWCNT/PLAGA composites, and sacrificed at 2, 4, 8 and 12 week post-implantation. The animals were observed for signs of morbidity, overt toxicity, weight gain, food consumption, hematological and urinalysis parameters, and histopathology. Results: Imaging studies demonstrated uniform incorporation of SWCNT into the PLAGA matrix and addition of SWCNT did not affect the degradation rate. Composites with 10mg SWCNT resulted in highest rate of cell proliferation (p<0.05) among all composites. Imaging studies demonstrated microspheres with uniform shape and smooth surfaces, and uniform incorporation of SWCNT into PLAGA matrix. The microspheres bonded in a random packing manner while maintaining spacing, thus resembling trabeculae of cancellous bone. Addition of 10mg SWCNT led to greater compressive modulus and ultimate compressive strength. Imaging studies revealed that MC3T3-E1 cells adhered, grew/survived, and exhibited normal, non-stressed morphology on the composites. SWCNT/PLAGA composites exhibited higher cell proliferation rate and gene expression compared to PLAGA. No mortality and clinical signs were observed. All the groups showed consistent weight gain and rate-of-gain for each group was similar. All the groups exhibited similar pattern for food consumption. No difference in urinalysis parameters, hematological parameters; and absolute and relative organ weight was observed. A mild to moderate summary toxicity (sumtox) score was observed for animals treated with the PLAGA and SWCNT/PLAGA whereas the sham animals did not show any response. At all the time intervals both PLAGA and SWCNT/PLAGA showed a significantly higher sumtox score compared to the Sham group. However, there was no significant difference between PLAGA and SWCNT/PLAGA groups. Conclusion: Our SWCNT/PLAGA composites, which possess high mechanical strength and mimic the microstructure of human trabecular bone, displayed tissue compatibility similar to PLAGA, a well known biocompatible polymer over the 12 week study. Thus, the results obtained demonstrate the potential of SWCNT/PLAGA composites for application in BTE and musculoskeletal regeneration. Future studies will be designed to evaluate the efficacy of SWCNT/PLAGA composites in bone regeneration in a non-union ulnar bone defect rabbit model. As interest in carbon nanotube technology increases, studies must be performed to fully evaluate these novel materials at a nonclinical level to assess their safety. The ability to produce composites capable of promoting bone growth will have a significant impact on tissue regeneration and will allow greater functional recovery in injured patients.

Introdução: Materiais com modificações na formulação original do MTA, incluindo o NeoMTA Plus, têm sido desenvolvidos buscando melhorar suas propriedades físicoquímicas. O objetivo do presente estudo foi analisar a resposta do tecido ósseo de ratos Wistar frente ao implante de NeoMTA Plus em comparação com o MTA Angelus. Metodologia: 24 ratos foram anestesiados e uma broca de baixa rotação foi empregada para confeccionar três cavidades cirúrgicas no fêmur direito. As cavidades cirúrgicas foram preenchidas aleatoriamente com os materiais teste NeoMTA Plus e MTA Angelus ou deixada vazia (controle negativo). Após 7, 30 e 90 dias as características do reparo ósseo foram classificadas em escores com o auxilio de microscópio óptico. As comparações entre os grupos foram realizadas pelo teste de Friedman e as comparações entre os três períodos experimentais em cada grupo foram realizadas pelo teste de Kruskal-wallis, seguido pelo teste de Dunn. O nível de significância foi estabelecido em P<.05. Resultados: Não foram observadas diferenças estatísticas entre os materiais e o grupo controle nos 3 tempos experimentais. Em todos os grupos houve diferença estatisticamente significante entre os tempos de 7 e 30 dias e nenhuma diferença foi observada entre os tempos de 30 e 90 dias. Além disso, o reparo em 90 dias foi significativamente melhor do que em 7 dias nos grupos NeoMTA Plus e controle. Conclusões: O NeoMTA Plus demonstrou comportamento biológico satisfatório em contato direto com o tecido ósseo de ratos Wistar, apresentando resultados semelhantes aos grupos MTA Angelus e controle. / Introduction: Materials that alter the original formulation of MTA have been developed to improve physical-chemical properties, including NeoMTA Plus (NMTAP). The aim of the present study was to analyze bone tissue reactions to NMTAP compared to MTA Angelus (MTA-A). Methods: 24 animals were anesthetized and a slow-rotation bur was used to create three surgical cavities in their right femur. Surgical cavities were randomly designated to NMTAP, MTA-A and negative control (empty cavity) groups. After 7, 30, and 90 days histological analysis of the characteristics of bone repair were classified in scores. Friedman’s test performed intergroup comparisons and Kruskal-Wallis test, followed by the Dunn’s post hoc test, compared the three experimental periods in each group. The significance level was set at P<.05. Results: No differences were found between the materials and control group in each experimental period. In all groups, the bone tissue repair improved from 7 to 30 days and there was no difference from 30 to 90 days. Moreover, the repair at 90 days was significantly better than at 7 in NMTAP and control groups. Conclusions: NeoMTA Plus showed satisfactory biological behavior when in direct contact with rat bone tissue, presenting repair characteristics similar to those produced by MTA Angelus and by the control group.

Este trabalho teve como objetivo avaliar as propriedades biológicas de cimentos experimentais a base de resina metacrilato contendo α-tricálcio fosfato (α-TCP) ou hidroxiapatita nanoparticulada (HAp) in vitro e in vivo. Para isto, os cimentos experimentais foram avaliados e comparados com AH Plus (AHP). Na etapa in vitro, os materiais foram mantidos em contato com meio de cultura por 24 horas, coletados e avaliados na concentração de 10%. Células-tronco da papila apical humana (SCAPs) foram submetidas aos ensaios de viabilidade brometo de 3-(4,5-dimetiltiazólio)-2,5-difenil tetrazólio (MTT) e sulfurodamina B (SRB) no período de 24 horas; e a bioatividade foi avaliada pela atividade da enzima fosfatase alcalina (ALP) e deposição de nódulos mineralizados pelo corante vermelho de Alizarina (AR), nos períodos de 1, 5, 10 e 15 dias. Na etapa in vivo, os materiais foram inseridos em tubos de polietileno e colocados no tecido subcutâneo de ratos para avaliação da reação inflamatória, sendo utilizado um tubo vazio como controle e avaliados os períodos de 7, 30 e 90 dias; para avaliação da deposição óssea, os cimentos α-TCP e AHP foram inseridos em cavidades confeccionadas no fêmur de ratos, sendo utilizada uma cavidade vazia como controle e avaliados os períodos de 30 e 90 dias. Para o ensaio de viabilidade e ensaios in vivo, foram utilizados os testes de Kruskal-Wallis e post hoc de Dunn; para avaliação da bioatividade in vitro foram utilizados os testes ANOVA e post hoc de Tukey (P < 0.05). HAp e AHP não apresentaram diferenças estatísticas entre si em ambos os ensaios de citotoxicidade (P> 0,05) e o α-TCP apresentou menor resultado de viabilidade no teste MTT, sendo estatisticamente diferente dos outros (P <0,05). Os ensaios de bioatividade demonstraram aumento na atividade da ALP em todos os grupos (P < 0.05). Observou-se semelhança entre os grupos no primeiro período (P > 0.05), AHP apresentou menores valores em 5 dias (P < 0.05), α-TCP apresentou os maiores valores em 10 dias (P < 0.05), e em 15 dias este cimento foi superior ao AHP (P < 0.05). AR mostrou aumento na quantidade de depósitos mineralizados após 5 dias (P < 0.05). Não houve diferença entre os grupos em 1 dia (P > 0.05), α-TCP, HAp e controle foram semelhantes aos 5 dias (P > 0.05), e em 10 e 15 dias, α-TCP apresentou os maiores valores, sendo diferente dos outros cimentos (P > 0.05). Na avaliação da resposta inflamatória in vivo, observou-se diminuição da inflamação e aumento de fibras colágenas em todos os grupos. Em 7 dias, α-TCP e HAp mostraram resultados semelhantes ao controle CT (P>0.05) e diferentes do AHP (P < 0.05), que foi o único grupo a apresentar células-gigantes neste período. Na avaliação da deposição óssea, houve aumento na deposição de 30 para 90 dias nos grupos α-TCP e controle (P < 0.05), e estes grupos apresentaram resultados semelhantes em 90 dias (P > 0.05), diferindo do AHP (P < 0.05). Conclui-se que a associação de fosfatos de cálcio à resina metacrilato apresentou bons resultados de biocompatibilidade e bioatividade in vitro e in vivo, apresentando potencial para serem utilizados como cimentos obturadores na prática clínica. / This study aimed to evaluate the biological properties of experimental sealers containing α-tricalcium phosphate (α-TCP) or nanoparticulate hydroxyapatite (HAp) in a methacrylate resin-base in vitro and in vivo. For this, the experimental sealers were evaluated and compared with AH Plus (AHP). At the in vitro assays, the materials were kept in contact with culture medium for 24 hours, collected and evaluated at concentrations of 100% and 10%. Stem cells from human apical papilla (SCAPs) were submitted to 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and sulfurodamine B (SRB) viability assays for 24 hour; and bioactivity was evaluated by alkaline phosphatase enzyme activity (ALP) and deposition of mineralized nodules by Alizarin Red staining (AR), for 1, 5, 10 and 15 days. At in vivo assays, the materials were inserted in polyethylene tubes and placed in subcutaneous tissue of rats to evaluate the inflammatory reaction, using an empty tube as control and evaluating the periods of 7, 30 and 90 days; to evaluate bone deposition, α-TCP and AHP cements were inserted into cavities made in the femur of rats, using an empty cavity as control and evaluating the periods of 30 and 90 days. For viability and in vivo assays, Kruskal-Wallis and Dunn’s post hoc tests were used; for bioactivity, ANOVA and Tukey's post hoc tests were used (P < 0.05). HAp and AHP did not presented statistical differences from each other in both citotoxicity assays (P > 0.05), and α-TCP presented a lower viability result in MTT assay, being statistically different from the other sealers (P < 0.05). The bioactivity assays showed an increase in ALP activity for all groups (P < 0.05). Similar results were found between the groups at the first period (P > 0.05), AHP had the lowest values at 5 days (P < 0.05), α-TCP presented the highest values at 10 days (P < 0.05), and at 15 days, this sealer’s values were higher than AHP (P < 0.05). AR showed an increase in the amount of mineralized deposits after 5 days for all sealers (P < 0.05). No difference between groups were found at 1 day (P > 0.05), α-TCP, HAp and control were similar at 5 days (P > 0.05), and at 10 and 15 days, α-TCP presented the highest values, being different of the other sealers (P > 0.05). Regarding the evaluation of the inflammatory response in vivo, there was a decrease in inflammation and increase of collagen fibers in all groups. At 7 days, α-TCP and HAp showed similar results to the control (P > 0.05) and different from AHP (P < 0.05), which was the only group to present giant cells in this period. In the evaluation of bone deposition, there was an increase in deposition from 30 to 90 days for α-TCP and control groups (P < 0.05), and these groups presented similar results in 90 days (P > 0.05), differing from the AHP (P < 0.05). It was concluded that the association of calcium phosphates and methacrylate resin showed good biocompatibility and bioactivity results in vitro and in vivo, presenting potential to be used as endodontic sealers in clinical practice.

O objetivo do presente estudo foi sintetizar e caracterizar um material reparador para uso endodôntico com propriedades anti-inflamatória, antimicrobiana e remineralizante. A pasta experimental tem como propósito ser um sistema carreador de fármacos para regiões de difícil acesso em Odontologia. A apresentação do material é em forma de pó:líquido. No pó se encontra α-fosfato tricálcico, tungstato de cálcio e microesferas de amoxicilina (AMX-MS), já no líquido estão contidas nanocápsulas de indometacina (IndOHNC). A pasta experimental foi testada em relação a suas características físicoquímicas e biológicas. As AMX-MS obtiveram tamanho de 1,604 μm ± 0,08, forma esférica confirmada por MEV e teor da droga foi 1,63 mg g-1. As IndOHNC obtiveram tamanho de 162 ± 7,5 nm e forma esférica confirmada por MET. O teor do fármaco foi de 1 mg mL-1 ± 0,02. O escoamento da pasta foi de 18.56 ± 0.29, a espessura de película obtida foi 33 μm e radiopacidade de 1,81 mmAl. A pasta experimental demonstrou atividade antibacteriana contra o Enterococcus faecalis. A maior concentração de pasta experimental apresentou o maior valor em relação à viabilidade celular, com 187,03% no teste SRB. A atividade da enzima fosfatase alcalina e a formação de nódulos mineralizados obtiveram um gradual aumento em função do tempo. A migração celular demonstrou fechamento da ferida, e a pasta experimental foi capaz de acelerar o processo (p<0.05). Em conclusão, a pasta experimental demonstrou propriedades físico químicas e biológicas confiáveis, podendo ser um material promissor para o reparo da região periapical. / The aim of this study was to synthesize and characterize a new reparative material with anti-inflammatory, antimicrobial and remineralizing properties. The reparative material was developed to be a drug delivery system for regions with difficult access in Dentistry. The formulation is presented in powder/liquid. The powder is composed of α-tricalcium phosphate, calcium tungstate and amoxicillin microspheres (AMX-MS). The liquid is composed of nanocapsules containing indomethacin (IndOH-NC). The physicochemical and biological properties of the experimental endodontic paste were evaluated. The AMX-MS obtained a mean size of 1.604 μm ± 0.08, spherical shape and the encapsulation capacity was 1.63 mg g-1. IndOH-NCs obtained a mean size of 162 ± 7.5 nm and spherical shape confirm by MET. The content of the encapsulated drug was 1 mg mL-1 ± 0.02. The experimental paste flow was 18.56 ± 0.29 mm, mean film thickness was 33 μm and radiopacity equivalent to 1.81 mmAl. The experimental paste showed antibacterial activity against Enterococcus faecalis. The highest concentration of experimental paste presented the highest value in cell viability (187.03% in SRB test). The activity of the phosphatase alkaline enzyme and the formation of mineralized nodules showed a gradual increase as a function of time. Cell proliferation showed continuous wound closure, and the experimental paste was able to accelerate the process (p<0.05). In conclusion, the experimental paste demonstrated reliable physicochemical and biological properties, and it could be a promising material for periapical region repair.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:37:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_5256_.pdf: 375211 bytes, checksum: 832eb7716f5f86a3d232c597e8e95ae1 (MD5) Previous issue date: 2011-09-06 / O uso de materiais produzidos a partir de osso bovino tem sido proposto na confecção de implantes como pinos, placas e parafusos, por promoverem as mesmas funções de um enxerto ósseo, ou seja, serem osteoindutores e osteocondutores. Entretanto, aspectos estruturais e mecânicos devem ser estudados previamente ao uso in vivo de implantes de osso. Portanto, o objetivo desse estudo foi avaliar o comportamento mecânico, por meio do ensaio mecânico de flexão, de placas produzidas a partir osso cortical bovino, no reparo de fratura de tíbia de coelhos ex vivo. Para tal, 26 placas foram confeccionadas a partir de osso cortical bovino e conservadas em solução de sal a 150%. Foram utilizados três grupos para estudo: grupo GP (n=10), composto pelas placas ósseas; grupo GTP (n=16), tíbias de coelhos osteotomizadas e estabilizadas com placas ósseas e quatro parafusos; grupo GT (n=10), tíbias intactas. No ensaio biomecânico de flexão em três pontos, verificou-se a tensão máxima, deflexão máxima e rigidez. Os resultados foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis (p<0,05) e ao teste de Dunn. Comparando GT com o GTP, observou-se redução de 80% na tensão máxima. Também se notou redução de 87% na tensão máxima ao comparar GP com o GTP. Verificou-se que a placa de osso bovino possuiu maior tensão máxima que a tíbia do coelho. Houve redução a 52% na rigidez do GTP em relação ao GT. Não observou-se diferença significativa nesta propriedade entre GPT e GP. Observou-se diferença significativa entre os três grupos com relação à deflexão máxima, onde notou-se aumento de 100% e 30% nos grupos GTP e GP, respectivamente, em relação ao GT. Pode-se concluir que placas ósseas, no reparo de fratura de tíbia de coelhos ex vivo obtiveram propriedades mecânicas inferiores, quando comparada à tíbia intacta.

Objetivo: avaliar os efeitos do peróxido de carbamida a 16% aplicado na mucosa oral de ratos diabéticos e não diabéticos. Métodos:foram utilizados trinta ratos albinos sendo 15 diabéticos induzidos por estreptozotocina e 15 normais, machos, adultos jovens, variedade Wistar. Os animais foram dividos em 6 grupos: NDC(não diabético controle), NDIP(não diabético imediato peróxido), ND7DP(não diabético 7 dias peróxido), DC(diabético controle), DIP(diabético imediato peróxido), D7DP(diabético 7 dias peróxido). Os grupos NDC e DC não receberam qualquer tratamento. Nos grupos NDIP e DIP foi aplicado o gel de peróxido de carbamida a 16% por 7dias (2 horas/dia) e os animais foram sacrificados no sétimo dia do experimento. Nos grupos ND7DP e D7DP foi aplicado o gel de peróxido de carbamida a 16% por 7 dias (2 horas dia) e os animais foram sacrificados 7 dias após (reparo). Após o sacrifício dos animais, a região mentual foi retirada cirurgicamente e preparada para estudo ao microscópio de luz com estereologia e imunohistoquímica para &#945;-actina de músculo liso (ACML, detecção de vasos). Resultados: todos os animais tratados com estreptozotocina tornaram-se diabéticos. A determinação da densidade de volume de tecido conjuntivo (Vv[tc]), da densidade de volume de vasos (Vv[vasos]) e da densidade de mastócitos na área-teste (QA[mast]) foram realizadas através do programa Image Pro Plus Version 5.0.5 2004 Media Cybernetics Inc. O Vv[tc] se apresentou 23% maior no grupo DC, em relação ao grupo NDC. A Vv[vasos] foi 125% maior no grupo DC em relação ao grupo NDC, e 108% maior no grupo DP7D em relação ao grupo NDP7D, todos com diferença estatística significante. A (QA[mast]) se apresentou maior nos grupos diabéticos, porém sem diferença estatística significante. Conclusão: O peróxido de carbamida a 16% induz a formação de fibrose, migração de mastócitos e proliferação de vasos, como reação tecidual no tecido celular subcutâneo, na região vestíbulo-mentual inferior de ratos diabéticos e não diabéticos. / Purpose: to evaluate the effects of the application of 16% carbamide peroxide in the oral mucosa of diabetic and non diabetic rats. Methods: we studied 30 young, male and adult Wistar albino rats, 15 diabetics induced by streptozotocin, and 15 non diabetics. The animals were divided in 6 groups: NDC(non diabetic control), NDIP(non diabetic immediately peroxide), ND7DP(non diabetic 7 days peroxide), DC(diabetic control), DIP(diabetic immediately peroxide), D7DP(diabetic 7 days peroxide). Groups NDC and DC had no treatment. In groups NDIP e DIP were applied the 16% carbamide peroxide gel (for 2 hours a day) and the animals were sacrificed in the seventh day of the experimentation. In groups ND7DP e D7DP were applied the 16% carbamide peroxide gel (for 2 hours a day) and the animals were sacrificed 7 days after (repair). After the sacrifice, the material from the jugal mucosa of the animals was removed for study with light microscope, stereology and immunohistochemistry for smooth muscle alfa-actin (SMAA, vessel detection). Results: all the specimens treated with streptozotocin became diabetics. For determination of the density of connective tissue (Vv[tc]), of the density of vessel volume (Vv[vasos]) and the density of mast cells (QA[mast]) was used the program Image Pro Plus Version 5.0.5 2004 Media Cybernetics Inc. The Vv[tc] were 23% higher in group DC than the group NDC . The Vv[vasos] was 125% higher in group DC than the group NDC, and 108% higher in group DP7D than the group NDP7D, all data with statistically significant difference. The (QA[mast]) was higher in diabetic groups but without statistically significant difference. Conclusion: The 16% of carbamide peroxide induces the formation of fibrosis, migration of mast cells and vessel proliferation as a tissue reaction in the cellular subcutaneous tissue of the oral mucosa of diabetics and non diabetics rats.

Orientadora: Profa. Dra. Christiane Bertachini Lombello / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, 2014. / A engenharia de tecidos envolve o desenvolvimento de novos materiais ou dispositivos capazes de interações específicas com os tecidos biológicos, buscando a utilização de materiais biocompatíveis que devem servir como arcabouço para o crescimento de células in vitro, organizando e desenvolvendo o tecido que posteriormente será implantado no paciente. Uma variedade de arcabouços como hidrogéis e polímeros, sintéticos e naturais, têm sido investigados para a expansão de condrócitos in vitro, visando o reparo da cartilagem lesionada. Uma molécula de interesse particular na regeneração de cartilagem é o ácido hialurónico (AH). Trata-se de um biopolímero atraente para a fabricação de arcabouços artificiais para engenharia de tecidos por ser biocompatível e biodegradável. A biocompatibilidade do AH deve-se ao fato de estar presente na matriz extracelular nativa, deste modo, cria-se um ambiente propício que facilita a adesão, proliferação e diferenciação celular, para além da existência de sinalização celular específica, o que contribui para a regeneração do tecido. O uso de hidrogel composto de ácido hialurónico e quitosana (QUI) também tem sido investigado em aplicações de engenharia de tecidos de cartilagem, com resultados promissores. A utilização da QUI visa a aprimorar as propriedades mecânicas do AH, para uma proposição futura de aplicação clínica na regeneração da cartilagem articular. Baseando-se nestas informações, este trabalho visa avaliar inicialmente os aspectos da interação celular com biomaterial polimérico a base de AH em blendas com QUI. A abordagem da hipótese levantada envolve a síntese e análises de intumescimento e degradação da blenda polimérica; a inoculação de células no biomaterial; análises de citotoxicidade, adesão, proliferação e morfologia celular sobre a blenda. O ensaio de intumescimento demonstrou a capacidade hidrofílica da blenda, o que resultou em um aumento de 300 % de sua massa inicial após 24 horas de imersão em solução aquosa. Os dados de degradação permitiram a previsão do comportamento das amostras de blenda em PBS em até 30 dias, mostrando que tais amostras apresentam boa estabilidade em PBS, apresentando praticamente nenhuma perda de massa (3 %) no período analisado. A avaliação da citotoxicidade mostrou que os biomateriais, incluindo o AH, a QUI e a blenda, não foram citotóxicos para células Vero. Com a análise quantitativa realizada com o MTT pode-se verificar uma viabilidade celular de 98 % para a blenda, confirmando assim a sua não citotoxicidade. Os ensaios de microscopia de luz e eletrônica das células cultivadas sobre a blenda demonstraram adesão, espalhamento e proliferação celular sobre este biomaterial, diferenciados do padrão controle das células. Com isto, pode-se inferir que a blenda produzida a partir de AH e QUI é um hidrogel promissor para aplicações em Engenharia de Tecido, objetivando futuramente o tecido cartilaginoso. / Tissue engineering involves the development of new materials or devices capable of specific interactions with biological tissues, searching the use of biocompatible materials as scaffolds for cell growth in vitro, organizing and developing tissue that is subsequently implanted into patient. A variety of scaffolds such as polymeric hydrogels, natural and synthetic, have been investigated for the expansion of chondrocytes in vitro in order to repair the damaged cartilage. An hydrogel of particular interest in cartilage regeneration is hyaluronic acid (HA). HA are attractive biopolymers for manufacturing artificial scaffolds for tissue engineering it is biocompatible and biodegradable. The biocompatibility of HA is due to the fact that it is present in native extracellular matrix, thus creates an environment, which facilitates the adhesion, proliferation and differentiation, in addition to the existence of specific cell signaling, which contribute to tissue regeneration. The use of hydrogel composed of hyaluronic acid and chitosan has also been investigated for applications in tissue engineering of soft tissues, like cartilage, with promising results. The use of chitosan aims to improve the mechanical properties of HA. Based on this information, this study aims to evaluate initial aspects of cell interaction with the polymeric biomaterials based on hyaluronic acid in blends with chitosan. The approach to hypothesis involves synthesis and analysis of swelling and degradation of the polymer blend; inoculation of cells on the biomaterial; analysis of cytotoxicity, adhesion and cell morphology on the blend. The swelling assay demonstrated hydrophilicity of the blend, resulting in an increase of 300 % of its initial weight after 24 hours of immersion in aqueous solution. The degradation data allowed the prediction of the behavior of the samples blend in PBS for up to 30 days, showing that these samples had good stability in PBS, with practically no weigth loss (3 %) in the period analyzed. The evaluation of cytotoxicity showed that the biomaterials, including hyaluronic acid, chitosan and the blends, were non cytotoxic for Vero cells. The quantitative analysis performed with the MTT can verify a cell viability of 98 % for the blend, thus confirming its not cytotoxicity. The experiments of light and electron microscopy of .cultured cells on the blend showed adhesion, spreading and proliferation on this biomaterial, distinguished from the pattern of the control cells. These results showed that the blends produced from CHI and HA hydrogels are promising for applications in tissue engineering, aiming at future cartilaginous tissue.

Orientador(a): Profª Dra. Christiane Bertachini Lombello / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, 2016. / A realização de ensaios de citotoxicidade in vitro e essencial na caracterizacao inicial da biocompatibilidade de biomateriais que visam aplicacao clinica. Pela exposicao de uma cultura celular ao contato direto, indireto ou ao extrato de determinado material de interesse e possivel caracterizar a presenca e severidade de efeito citotoxico resultante. Porem, a sensibilidade dos diferentes ensaios e variavel e influenciada por inumeros fatores, relacionados as proprias condicoes de ensaio utilizadas e parametros celulares avaliados, bem como a natureza do biomaterial em analise. Assim, o estudo comparativo desses ensaios in vitro e de suas variacoes metodologicas contribui para o melhor entendimento dos protocolos empregados atualmente, e de maior relevancia devido as questoes eticas relativas ao uso de animais em ensaios biologicos. Esse estudo buscou, portanto, analisar comparativamente a influencia de diferentes condicoes de ensaio na sensibilidade dos testes de citotoxicidade - contato direto, indireto (difusao em agar) e por extrato - segundo norma ISO 10993:5 (2009), alem de avaliar a correlacao entre os resultados desses ensaios e dos parametros de citotoxicidade utilizados. Para tal, utilizou-se linhagem celular Vero e materiais conhecidamente nao citotoxicos (papel filtro) e citotoxicos (latex) como referenciais. Os parametros celulares de morfologia, proliferacao e viabilidade foram avaliados, qualitativa e/ou quantitativamente, apos 24 h, 48 h, 72 h e 120 h de ensaio. Todos os ensaios foram eficazes na avaliacao de citotoxicidade, quando analisados os parametros celulares resultantes da interacao. Porem, para a referencia citotoxica, o efeito sobre as celulas foi distinto entre os ensaios apos 24 h de exposicao, sendo mais pronunciado no ensaio por extrato. Alem disso, o ensaio de contato direto apresentou maior variabilidade quanto a viabilidade e proliferacao celular. Verificou-se ainda, que para maiores tempos de exposicao ha reducao na viabilidade celular, inclusive para amostras nao citotoxicas, independente do ensaio. A avaliacao de citotoxicidade de representantes das tres principais classes de biomateriais - ¿À-TCP (ceramica), aco AISI 316L (metal), e gelatina reticulada (polimero), segundo mesmos ensaios, porem restritos aos tempos de 24 h e 48 h, evidenciaram a nao citotoxicidade dos dois primeiros. Porem, o ensaio por contato direto nao foi o mais adequado na avaliacao do biomaterial ceramico, devido a movimentacao da amostra, dando preferencia nesse caso aos demais ensaios. Ja para a amostra metalica, apesar da influencia de seu peso no contato direto os resultados foram representativos da ausencia de citotoxicidade. Assim, podendo ser avaliado por qualquer dos ensaios. O ensaio por extrato foi o de maior sensibilidade na deteccao do potencial citotoxico da gelatina, esse podendo ser indicado como metodo de escolha no estudo de polimeros reticulados. Como a sensibilidade entre os ensaios pode variar para um mesmo tempo de exposicao e ser influenciada pelo tipo de material em analise, principalmente quando este apresenta algum potencial citotoxico, e necessario cautela na escolha do tipo de ensaio utilizado para avaliacoes de citotoxicidade. Dessa maneira, a integracao entre resultados provenientes da avaliacao de diferentes condicoes de ensaio e parametros celulares, qualitativos e quantitativos, bem como relacionados ao comprometimento fisico/morfologico e funcional, permite maior confiabilidade na caracterizacao previa da presenca e severidade de citotoxicidade in vitro de biomateriais. / The fulfilment of in vitro cytotoxicity assays is essential for initial characterization of biocompatibility of biomaterials that are intended for clinical application. By exposure of a cell culture to direct or indirect contact with certain material of interest, or of its extract it is possible to characterize the resulting cytotoxicity effects. However, the sensitivity of the tests is variable and influenced by many factors, related to the different test conditions used and cellular parameters evaluated, as well as the nature of the biomaterial under assessment. Thus, the comparative study of these assays and its methodological variations contribute to a better understanding of the protocols currently employed. And even more relevant, in face of the ethical issues related to animal use in biological assays. Therefore, this study seeks to comparatively analyze the influence of different test conditions on the sensitivity of the cytotoxicity tests, by direct, indirect contact (agar diffusion) and for extract, according to ISO 10993: 5 (2009) and to evaluate the correlation between the results of those assays and the parameters used to detect the cytotoxicity. To this end, the study employed the Vero cell line and known non-cytotoxic (filter paper) and cytotoxic (latex) materials as reference. The parameters evaluated were cell morphology, proliferation and viability, thru qualitative and quantitative means, after 24h, 48h, 72h and 120 hours of assay duration. All assays were effective in the evaluation of cytotoxicity, resulting from the interaction. However, for the cytotoxic reference, the effect on the cells was different between assays after 24 hours of exposure and, also more pronounced for the extract assay. Besides that, the direct contact assay showed greater variability for both the cell viability and proliferation data. It was also found that for longer exposure times there is a decrease in cell viability, for all samples, including the non-cytotoxic one, and it is not influenced by the type of assay. Cytotoxicity evaluation of representatives of the three main biomaterials classes - â-TCP (ceramic), steel AISI 316L (metal), and crosslinked-gelatin (polymer) ¿ under the same conditions, yet restricted to 24h and 48h of exposure time, showed that the first two samples mentioned are non-cytotoxic. However, the direct contact assay was not the most adequate to evaluate the ceramic biomaterial, due to sample movement, preference being given in this case to the use of the other assays. For the metal, despite the influence of their weight, while in direct contact, the results where representative of the absence of cytotoxicity. Thus, all assays can be used in its evaluation. The extract assay was the most sensitive in detecting the potential cytotoxic effect of the crosslinked-gelatin, and could possibly be indicated as the method of choice when studying crosslinked polymers. Since the sensitivity between assays may vary for the same exposure time and be influenced by the type of material under analysis, especially when it presents a potential cytotoxicity; caution is required when selecting the assay for cytotoxic evaluation. Therefore, combining the results from different assay conditions and cellular parameters, qualitative and quantitative, as well as related to the physical / morphological and functional impairments, allows for greater reliability in the initial biomaterial characterization of in vitro cytotoxicity regarding their presence and severity.

Orientadora: Profa. Dra. Juliana Kelmy Macário de Faria Daguano / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, 2016. / Alterações associadas ao envelhecimento e algumas doenças podem afetar o controle postural influenciando de maneira negativa a qualidade de vida das pessoas. Há muitos testes que podem ser utilizados para descrever o controle postural do ser humano, entretanto, ainda não há um consenso de quais são os melhores testes a serem empregados durante a avaliação para extrair informações relevantes da condição de equilíbrio do Vitrocerâmicas do sistema Li2O.SiO2, contendo como fase majoritária o dissilicato de lítio, têm sido utilizadas clinicamente como biomateriais quase inertes na área de reparação óssea, devido à boa resistência mecânica, apesar de, por vezes, não apresentarem biocompatibilidade e biofuncionalidade completamente satisfatórias. Assim, vitrocerâmicas bioativas à base de Li2O.SiO2 surgem como uma alternativa promissora. O objetivo deste trabalho é avaliar a biocompatibilidade in vitro de um vidro base e duas vitrocerâmicas ¿ contendo metassilicato de lítio e dissilicato de lítio, visando à aplicação como reparador ósseo. Amostras dos três grupos foram caracterizadas por difração de raios X (DRX). Após análise das fases, os materiais foram submetidos aos testes in vitro de bioatividade e biodegradação, bem como ao de citotoxicidade e de adesão e proliferação em meio celular. O teste de bioatividade avaliou a formação de hidroxiapatita carbonatada (HCA) na superfície dos materiais após imersão em solução simuladora de fluído corpóreo (SBF) por períodos de até 14 dias, com o auxílio da técnica de espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), e o teste de biodegradação foi utilizado para quantificar a liberação de lítio (pela técnica de espectrometria de absorção atômica com chama - FAAS) e a perda de massa do material em solução tampão TRIS-HCl, por períodos de imersão de até 28 dias. Após os diversos períodos de imersão, as amostras foram analisadas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Surpreendentemente, apenas a vitrocerâmica contendo majoritariamente a fase dissilicato de lítio (índice de cristalinidade ~ 79%) se mostrou bioativa após 14 dias de imersão em SBF. Em relação à avaliação da biodegradação, houve maior perda de massa para o vidro após 28 dias, e somente este grupo apresentou a concentração de íons Li+ na solução dentro da faixa considerada tóxica, após 14 dias de imersão em TRIS-HCl. Acerca da citotoxicidade, nenhum dos grupos se mostrou citotóxico. Em relação à adesão e à proliferação celular, o dissilicato de lítio apresentou os melhores resultados, podendo se verificar a formação de matriz mineralizada após 21 dias. Os resultados mostram que dentre os materiais analisados, a vitrocerâmica à base de dissilicato de lítio apresenta grande potencial para uso como biomaterial na área de regeneração óssea. / Glass-ceramics based on Li2O.SiO2 system, containing lithium disilicate as major phase, have already been used clinically as almost inert biomaterials due to good mechanical strength, although sometimes they do not have completely satisfactory biocompatibility and biofunctionality. Therefore, bioactive Li2O.SiO2 glass-ceramics appear as a promising alternative. The aim of this study is to evaluate the in vitro biocompatibility of three experimental groups: a base glass and glass-ceramics - containing lithium metasilicate and lithium disilicate, looking for bone repair. Samples of the three experimental groups were characterized by X-Ray Diffraction (XRD). After analyze the phases, these materials were subjected to in vitro bioactivity and biodegradation tests as well as cytotoxicity and adhesion and proliferation in cellular medium tests. The bioactivity test evaluated the formation of hydroxycarbonate apatite (HCA) on the surface of the material after immersion in Simulated Body Fluid (SBF) for periods up to 14 days with the aid of Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), and the biodegradation test was used to quantify the release of lithium (for Flame Atomic Absorption Spectrometry - FAAS) and the weight loss of the material in TRIS-HCl buffer solution, for periods up to 28 days. After several periods of immersion, the samples were analyzed by Scanning Electron Microscopy (SEM). Surprisingly, only the glass ceramic containing lithium disilicate as majoritary phase (Crystallinity Index ~ 79%) proved to be bioactive after 14 days of immersion in SBF. Regarding the evaluation of biodegradation, there was a greater weight loss for glass after 28 days and only this group showed the concentration of Li+ ions in the solution within the range considered toxic, after 14 days of immersion in TRIS ¿HCl. About the cytotoxicity, none of the groups showed to be cytotoxic. Regarding cellular adhesion and proliferation, the lithium disilicate showed the best results, being able to verify the formation of mineralized matrix after 21 days. The results showed that between the 3 experimantal groups analyzed, the lithium disilicate glass-ceramic have great potencial to be used as biomaterial for bone repair.

TiO2 nanotubes grown on titanium alloy are known to increase the biocompatibility of the alloy when used in dental/orthopaedic implants. Furthermore, their nanotubular structures can act as antibacterial agent carrier and as a scaffold for tissue engineering with the aim of adding antibacterial properties to the implant. This study aims at fabricating an antibacterial and biocompatible nanocomposite coating on Ti-6Al-4V involving nano-ZnO and nano-Ag. Initially, TiO2 nanotubes were self-assembled on the polished surface of medical grade Ti-6Al-4V alloy discs using anodisation. First silver nanoparticles were chemically reduced from silver ammonia using delta-δ-gluconolactone for different duration on the nanotubes to form TiO2-Ag composite coating. Nano HA was added to the latter coating with the aim of reducing toxicity from silver, hence forming TiO2-Ag-HA coating. Secondly, nano-ZnO was thermo-chemically grown on the TiO2 nanotubes using zinc nitrate and hexamethylenetetramine. They were then annealed at 350-550 oC hence forming TiO2-ZnO. HA was grown on the latter coating by a biomimetic method whereby the coated discs were placed in a concentrated simulated body fluid at 37 oC forming TiO2-ZnO-HA. The stability of the 4 coatings, TiO2-Ag, TiO2-Ag-HA, TiO2-ZnO and TiO2-ZnO-HA were assessed using the dialysis method (n=3 each) and then exposed to S.aureus for 24 hours in BHI broth. Their antibacterial properties were assessed using different assays and microscopic imaging with respect to different controls (n=6 each for assays and n=3 for imaging). Their biocompatibility properties were assessed in the presence of primary human osteoblast cells in DMEM media with the help of biochemical assays, molecular gene expression and microscopic imaging (n=3). Both silver and zinc coated nanotubes showed significant level of antibacterial properties with silver coating being more bactericidal than the coating containing zinc. Nonetheless, the zinc oxide coatings were more biocompatible than the silver coating. Nano silver and zinc oxide containing composite coatings were successfully synthesised and tested in the presence of bacteria and human cells. The final conclusion was that nano-silver was still toxic and nano-ZnO coatings were more biocompatible.