L’écosystème buccal est un environnement complexe dans lequel cohabitent plus de 700 espèces de bactéries différentes. Un déséquilibre au sein de ce biofilm est à l’origine des principales maladies de la cavité buccale : les maladies carieuses et parodontales.Pendant plusieurs années, l’étude de l’écosystème buccal s’est faite par une approche réductionniste : les microbiologistes étudiaient les espèces bactériennes individuellement. Cette stratégie a permis d’examiner et de comprendre tous les différents composants de cet écosystème, sans pour autant pouvoir appliquer les conclusions de ces études au biofilm buccal dans son ensemble. En effet, les bactéries ne se comportent pas de la même façon lorsqu’elles sont à l’état planctonique, ou lorsqu’elles sont organisées en biofilm.La flore microbienne buccale est reconnue comme étant l’une des plus complexes dans le corps humain. La multitude d’espèces en présence complique l’étude de ce biofilm. En effet, sa reproduction in vitro est rendue difficile par la complexité des relations entre chacune des espèces. De plus, son recueil, et ses décomptes qualitatif et quantitatif restent très délicats.Dans la littérature sont décrits plusieurs modèles de biofilm.Les modèles pluri-espèces dynamiques in vitro ont l’avantage de se rapprocher des conditions retrouvées in vivo, permettant un certain flux de milieu, le contrôle de paramètres tels que le pH et la température, ainsi que l’élimination des déchets produits.Cependant, ces modèles restent très onéreux et difficiles de mise en place, ce qui complique l’étude du biofilm buccal. Egalement, l’identification des bactéries mises en présence reste un sujet d’étude délicat : en effet, les méthodes traditionnelles de culture montrent des limites, et ne permettent pas une analyse quantitative des résultats, essentielle à la compréhension des phénomènes mis en jeu dans cet écosystème.Le but de notre travail ici est la mise en place de modèle de biofilm pluri-espèces dynamique, fiable et reproductible, facile à mettre en place et moins onéreux que ceux décrits dans la littérature. Ce modèle de biofilm doit permettre l’étude de l’influence de variations de conditions environnementales sur ce dernier, ainsi que celle de candidats probiotiques ayant déjà prouvé leur efficacité sur des supports in vitro statiques. Enfin, toujours dans une optique de simplification, les différentes méthodes d’identification des biofilms formés sont comparées (méthodes de culture traditionnelle, PCR conventionnelle, spectrométrie de masse MALDI-TOF, et qPCR), afin d’établir un protocole d’identification reproductible permettant une analyse qualitative et quantitative des résultats. / The oral ecosystem presents a great complexity since it can harbor more than 700 different bacterial species. Most of them are organized in a biofilm on both the dental and the mucosal surfaces. Studying this complex environment is of utmost importance because a rupture in its stability can lead to the preeminence of pathogenic microorganisms, causing dental decay, gingivitis and periodontitis.For many years, the study of the oral ecosystem was conducted throught a reductionist approach: microbiologists studies bacterial strains individually. This strategy allowed the understanding of all different components of this ecosystem, but lacked the transposition of its conclusions to the study of a whole complex oral biofilm. As a matter of fact, bacteria don’t behave the same way in a planktonic state or when they are organized in a biofilm.The oral microflora is known to be one of the most complex floras hosted by the human body. The multitude of strains hardens its study. Indeed, its in vitro reproduction is made as complex as the different interactions occurring between each strain. Moreover, harvesting and quantitative and qualitative analysis of such biofilms remain very delicate procedures.Several biofilm models have been described in the literature. In vitro dynamic multispecies models share the same asset: to closely mimic in vivo conditions. They allow a medium flow, and parametrical controls such as pH, temperature; and waste removal. However, those models are very expensive and difficult to master. Also, bacterial identification is still a tough matter : traditional culture methods have shown their limits, and don’t allow a quantitative analysis, which is essential to understand the phenomenons occurring in this ecosystem.The aim of our work was to set up a dynamic multispecies oral biofilm, both reliable and reproducible, easy to set up and less expensive than those previously described in the literature. This model shall allow the study of environmental conditions variations and the efficiency of probiotic candidates that already showed their efficacy on static supports.Lastly, we compared different biofilm identification methods, traditional culture, conventional PCR, MALDI-TOF mass spectrometry, and quantitative PCR, in order to establish a reproducible identification protocol allowing both quantitative and qualitative analysis.

Dans cette thèse, nous nous intéressons aux mécanismes précurseurs de la formation d'un biofilm dans le cas de la cyanobactérie Synechocystis sp. PCC 6803, en tant que micro-organisme modèle. Nous avons en premier lieu observé la motilité de cellules qui sédimentent puis diffusent librement sur une surface en verre. De plus, nous avons relevé les détails de la motilité des bactéries, qui est intermittente : des périodes de mouvements directionnels (les ``runs'') alternent avec des périodes de mouvements localisés (les ``tumbles''). Le coefficient de diffusion résultant décroît avec le temps, avant de se stabiliser; en revanche des souches mutantes relarguant moins de substance extracellulaire gardent un coefficient de diffusion constant au cours de l'expérience. Nous proposons un modèle de ralentissement basé sur une marche aléatoire à "temps continu" influencée par le recouvrement progressif de la surface par les exopolysaccharides secrétés par les bactéries. Les bactéries pourraient ainsi "reconnaître" le type de surface sur lequel elles évoluent et adapter leur motilité en conséquence, ce qui constitue une étape préliminaire dans la formation d'un biofilm. Nous avons vérifié ce point avec une étude de la diffusion sur des surfaces de différentes rigidités. L'expérience est cette fois prolongée pour étudier l'effet de la dureté du substrat sur la morphologie du biofilm. La proportion de bactéries non motiles est plus importante sur les surfaces molles. Cet effet à l'échelle de la particule conditionne en grande partie la morphologie des micro-colonies émergentes après plusieurs jours de culture, avec davantage de micro-colonies et une densité cellulaire plus hétérogène sur les surfaces molles. Nous construisons un modèle qui prend en compte la division cellulaire et le ralentissement de la dynamique individuelle, et permettant de conclure sur le lien entre rigidité de surface, dynamique cellulaire, et formation de micro-colonies. Le troisième chapitre expérimental aborde la réponse du système à des changements de conditions lumineuses, d'abord de manière isotrope puis en introduisant une lumière directionnelle. En conditions isotropes, les échelons d'intensité lumineuse perturbent les temps caractéristiques de ``run'' et de ``tumble''. Nous analysons ces variations dans le cadre de la théorie de la réponse linéaire. Nos données suggèrent qu'il est possible de décrire la réponse à une perturbation d'intensité lumineuse de manière similaire à des "stimuli" chimiques, avec la même fonction réponse. Sous un flux lumineux directionnel, nous observons une phototaxie complexe pour laquelle une fraction des cellules a un mouvement aléatoire pendant qu'une autre est sensible à l'anisotropie de l'éclairage. L'orientation des déplacements s'effectue dès l'introduction du flux lumineux, mais les temps de ``run'' et de ``tumble'' continuent d'évoluer pendant la période du flux lumineux suivant une tendance proche de celle observée en conditions isotropes. Ces résultats mettent en évidence le couplage entre l'intensité lumineuse et l'anisotropie de l'éclairage dans les mécanismes responsables de la phototaxie. / In this work, we focus on the early stages of biofilm formation, using the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 as a model micro-organism. First, we observe the motility of cells that have just reached the surface after sedimentation, and are then let free to diffuse on a glass surface. The resulting diffusion coefficient decreases with time, until it reaches a plateau value; whereas mutant strains secreting less extracellular substance do not exhibit such a slowdown. To explore the mechanism at work, we investigate the details of bacterial motility, which is intermittent: periods of directional movements (``runs'') alternate with periods of localized movements (``tumbles''). We propose a slowdown model based on a continuous-time random walk, influenced by the progressive surface coverage with the exopolysaccharides secreted by the bacteria. They could then ``recognize'' the surface onto which they are diffusing and adapt consequently their motility, which establishes a preliminary step for the biofilm formation. We have adressed this issue by studying diffusion onto surfaces with different stiffnesses. The experimentation is extended in order to analyze the effect of surface toughness on the biofilm morphology. The proportion of non-motile bacteria is higher on softer surfaces. This effect on the individual particle affects the shape of emergent microcolonies after several days of growth, with more microcolonies and a more heterogeneous surface density on soft surfaces. We build a model that takes into account cellular division and individual dynamics slowdown that enables us to point out the relation between surface rigidity, cellular dynamics, and microcolonies formation. The third experimental chapter tackles the response of the system to changes in light conditions, first in an isotropic way, then by introducing a directional light. For isotropic conditions, steps of light intensity disrupt the characteristic ``run'' and ``tumble'' times. We analyze these variations in the framework of the linear response theory. Our data suggest that it is possible to describe the response to light disruptions in the same way as what has been done for chemical ``stimuli'', with a similar response function. With a directional luminous flux, we observe complex phototaxis, in which some fraction of the cellular population displays random movements, whereas another one is sensitive to the lighting anisotropy. The displacements are oriented as soon as the luminous flux is switched on, and the ``run'' and ``tumble'' times also respond this change. Our results show that light intensity triggers bacterial motility, whether it is oriented or not.

Les infections ostéo-articulaires requièrent souvent un acte chirurgical couplé à une antibiothérapie prolongée, en lien avec la capacité des bactéries en cause à former des biofilms sur les prothèses. La présence d’antibiotiques à des concentrations sub-inhibitrices (sub-CMI) peut stimuler la capacité des bactéries à former des biofilms, ce qui complexifie la problématique. Notre étude avait pour but de caractériser in vitro le comportement biofilm d’une souche clinique de Staphylococcus aureus issue d’une infection ostéo-articulaire en présence de 12 antibiotiques préconisés dans le traitement des infections à staphylocoques, à différentes concentrations (dont des concentrations sub-CMI).Un dénombrement des bactéries viables a été effectué à partir de biofilms formés en présence de chacun des 12 antibiotiques à différentes concentrations (incluant des concentrations sub-CMI), ainsi que dans les suspensions présentes autour de ces mêmes biofilms. La présence de 7 d'entre eux (ceftaroline, daptomycine, gentamicine, fosfomycine, ofloxacine, rifampicine et vancomycine) entraînait une inhibition de la formation de biofilm à des concentrations inférieures ou égales aux concentrations critiques. L'action de la fosfomycine s'étendait même à des concentrations sub-CMI. Seules la daptomycine et la gentamicine étaient capables d’agir à la fois sur les bactéries sessiles et sur les bactéries non-adhérentes en suspension.Quant aux biofilms mâtures de cette même souche préalablement formés en absence d'antibiotiques, seules des concentrations 800 à 51200 fois supérieures à la CMI -concentrations largement incompatibles avec une utilisation thérapeutique - entraînaient leur éradication.Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons concentré nos efforts sur l'action de la fosfomycine, choisie en fonction de son effet sur la formation de biofilm et de son intérêt thérapeutique. Une analyse transcriptomique des cellules présentes dans les biofilms formés en présence de fosfomycine et de cellules issues de biofilms matures traités ultérieurement à la fosfomycine a montré que la présence de cet antibiotique induisait majoritairement une sous expression de gènes codant des protéines impliquées dans le métabolisme et le transport des nucléotides, des acides aminés et des carbohydrates. Des gènes codant des adhésines et des protéines impliquées dans la synthèse de la capsule (ScdA) étaient également sous-exprimés. De manière moins importante, l'expression de gènes codant des molécules impliquées dans la synthèse du peptidoglycane (MGT et MurA) et des autolysines était également diminuée. Le ralentissement métabolique et les modifications induites au niveau des membranes par la présence de l'antibiotique seraient responsables du changement des capacités d'adhésion de la bactérie.L'impact de la fosfomycine à une concentration sub-CMI sur les caractéristiques des bactéries viables isolées dans la suspension autour des biofilms a également été déterminé. De façon surprenante, ces bactéries montrent une capacité accrue à former du biofilm par rapport à celles issues de l'environnement d'un biofilm non soumis à l'action de l'antibiotique, en lien probablement avec un accroissement d'épaisseur de leur couche de peptidoglycane.En conclusion, ces données obtenues in vitro devront être confirmées dans des modèles d'infections expérimentales in vivo. Malgré tout, elles soulignent la pertinence de l’utilisation de la fosfomycine dans la prévention des infections ostéo-articulaires liées à S. aureus, à condition d'éradiquer en parallèle les formes non adhérentes. / Osteoarticular infections (OAI) often require a surgical procedure with prosthesis removal followed by long-term complex antibiotherapy. The ability of Staphylococcus aureus to adhere and produce biofilm on the surface of implanted material contributes to treatment failures and microbiological relapses. In addition, biofilm formation can be induced by some antibiotics at sub-minimal inhibitory concentrations (sub-MICs). The present study characterizes in vitro the effects of 12 antibiotics on biofilm formed by a strain of methicillin-susceptible Staphylococcus aureus isolated from an osteo-articular infection.The influence of these antibiotics was assessed on biofilm formation at concentrations including the breakpoints, by numbering viable cells in the biofilm biomass and in the suspensions (unattached cells) surrounding the biofilm. Biofilm formation was prevented in presence of ceftarolin, daptomycin, fosfomycin, gentamicin, ofloxacin, rifampicin and vancomycin at the highest concentrations tested. Only fosfomycin showed inhibition properties also at sub-MICs. Unattached and sessile viable bacteria were undetectable to daptomycin and gentamicin at the highest concentrations tested.Determination of the minimum biofilm eradication concentrations (MBECs) indicated that in vitro eradication of 24h-old biofilms required concentrations at least 800 times higher than the planktonic MIC, concentrations obviously not compatibles with classical therapeutic doses.In the second part of this work, we focused our study on the action of fosfomycin, because of its effect on biofilm formation and its therapeutic interest. A transcriptome analysis was performed with sessile cells from both biofilm formed in the presence of sub-MIC of fosfomycin and cells from pre-formed 24h-old biofilm treated by fosfomycin at sub-MBEC. Fosfomycin induced mostly down regulation of genes assigned to nucleotide, amino acid and carbohydrate transport and metabolism. Adhesins and capsular biosynthesis proteins (ScdA) encoding genes were also down regulated. To a lesser extent, peptidoglycan biosynthesis proteins (MGT and MurA) and autolysins encoding genes were found down regulated. Metabolic slowdown and cell membrane modifications induced by fosfomycin are likely to be responsible for the impairment of bacterial adhesion capacity.The action of fosfomycin at sub-MIC on unattached cells surrounding biofilm was also analyzed. Surprisingly, they displayed higher capacity to form new biofilm than their counterparts obtained without fosfomycin, probably associated with their large peptidoglycan layer.In conclusion, these data underline the relevance of the use of fosfomycine in preventing osteo-articular infections due to S. aureus and should be assessed in in vivo experiments. However, simultaneous eradication of unattached cells should also be considered due to the high capacities of these cells to disseminate and establish new biofilm, a real risk of treatment failure.

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Study program: Healthcare Bioanalytics Author: Bc. Adéla Diepoltová Supervisor: RNDr. Klára Konečná, Ph.D. Title of thesis: Optimization of the method for sensitivity evaluation of biofilm- forming staphylococci against candidate antimicrobial compounds Background: The aim of this thesis was to optimize approach for in vitro formation of staphylococcal biofilms on the pegs and on the wells of the 96-well panel as an analogous approach to commercially available Calgary Biofilm Device system. The aim of the Experiment 1 was to evaluate incubation conditions (such as impact of a growth medium, incubation mode, optical density of the starting bacterial inoculum and type of surface) leading to maximal biofilm formation of two biofilm producer strains with unknown biofilm phenotype and one staphylococcal strain known as strong biofilm producer. The most advisable conditions were used in incubation process of Experiment 2. This work should propose the approach leading to in vitro formation of the most voluminous staphylococcal biofilms exploitable for candidate drug antimicrobial activity testing. Methods: Spectrophotometric measurement of the crystal violet colour extracted from wells with fixed and stained Staphylococci to evaluate the ability to...

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