Stuttgart, Univ., Diss., 2003.

Techn. Hochsch., Diss., 2005--Aachen.

In der heutigen chemisch-pharmazeutischen Industrie sind Biokatalysen nicht mehr wegzudenken. Abhängig von der zu realisierenden Biotransformation, wurden signifikante Limitationen vor allem bei der Umwandlung von hydrophoben Substraten identifiziert. Wässrige und organische Einphasenreaktionssysteme treffen hier sehr schnell an ihre Grenzen, sodass nur geringe Ausbeuten realisierbar sind. Eine Alternative stellen mehrphasige Reaktionssysteme dar, wobei hier grundlegend klassische 2-Phasensysteme und Emulsionen unterschieden werden können. Mit Hilfe dieser alternativen Systeme können die bereits genannten Limitationen überwunden werden. Pickering Emulsionen stellen einen Spezialfall der klassischen Tensid stabilisierten Emulsion dar, wobei hier Nano- und Mikropartikel als Stabilisatoren die Tenside an der Tröpfchengrenzfläche ersetzen. Pickering Emulsionen stellen hoch dynamische Systeme dar und trotz kontinuierlicher Forschung auf diesem Gebiet bleiben bisher grundlegende Frage ungeklärt: Welche Parameter für bioaktive w/o Pickering Emulsionen wie Lösungsmittelkomposition, deren Phasenverhältnis, Partikelcharakteristika und -menge, Dispergierverfahren, als auch die Biokatalysatorkonzentration haben auf die Dispersität und Stabilität der Pickering Emulsionen den größten Effekt? Lässt sich eine Vielzahl von Biokatalysatoren in diesem Reaktionssystem einsetzen? Kurzum, eignen sich Wasser in Öl (w/o) Pickering Emulsionen als universelle Reaktionssysteme für effiziente Biokatalysen und stellen somit eine Plattformtechnologie dar? In dieser Studie konnte gezeigt werden, nahezu alle organischen Lösungsmittel, insbesondere leicht wassermischbare Vertreter, können w/o Pickering Emulsionen ausbilden. Ebenso ist eine Stabilisierung sowohl durch Naturstoffpartikel als auch durch hydrophobe und hydrophile Silicon-Compositpartikel realisierbar. In einer umfassenden Charakterisierung der typischen Stellräder für Emulsionen wurden kommerziell erhältliche Lipasen als bioaktive Komponenten zugesetzt, da diese die meistgenutzten Biokatalysatoren in diesem System darstellen. Die Veränderungen der Emulsionsstabilität und Tröpfchengrößen, als Maß der Dispersität, wurden über 24 Stunden erfasst. Hierbei wurde ein maßgebender Einfluss der Proteinkomponente gegenüber allen anderen Parametern wie Partikelmenge, Phasenverhältnis und Dispersionsgeschwindigkeit festgestellt. Proteine mit ihrer amphiphilen Oberflächenbeschaffenheit sind somit nicht nur als Biokatalysatoren, sondern auch als zusätzliche Nanopartikel zu betrachten, die gemeinsam mit hydrophoben Partikeln einen synergetischen und normalisierenden Effekt auf Tröpfchengrößen und Emulsionsstabilität ausüben. Jedoch waren durch Proteinzugabe auch negative Effekte wie Nicht-Etablierung der Emulsion oder eine Phasenumkehr im zeitlichen Verlauf auslösbar, wenn eine Grenzkonzentration überschritten wurde. Hinsichtlich der (bio)chemischen Charakterisierung von enzymbeladenen w/o Pickering Emulsionen konnte deutlich gezeigt werden, kleinere Tröpfchendurchmesser führen zu erhöhten Enzymaktivitäten und besseren Ausbeuten. Im moderat gerührten Batchreaktor wurde die volumetrische Raum-Zeit-Ausbeute um 500% bis 1100% gegenüber dem konventionellen 2 Phasen- und mikroaquatischen Reaktionssystem verbessert. Beim Einsatz von ganzen Zellen im Vergleich zum freien Enzym wurde mit normierter Biokatalysatoraktivität eine Verbesserung auf 130% bis 220% erzielt. Als beste Herstellungsmethodiken konnten das Dispergieren über Schütteln und Zahnkranzdispergierer ermittelt werden. Grenzflächentoxizität, als oft diskutierter Vorgang in Mehrphasensystemen, spielte auch in bioaktiven w/o Pickering Emulsionen eine wichtige Rolle. Es konnte gezeigt werden, hydrophilere Lösungsmittel, wie 2 Methyltetrahydrofuran, sorgten für eine minimierte Grenzflächendenaturierung der Proteine. Hingegen denaturierten hydrophobere Vertreter wie Cyclopentylmethylether und Cyclooctadien einen erheblichen Anteil des gelösten Proteins an der Grenzfläche. Eine eventuelle Kontamination der organischen Produktphase mit gentechnisch veränderten Enzymen durch assimiliertes Protein wurde ebenfalls untersucht. Es konnten geringe gelöste Proteinmengen festgestellt werden, wobei die Spannweite der gelösten Mengen 1 – 4% der Proteingesamtmenge betrug. Hydrophobere Lösungsmittel nahmen generell weniger Protein auf. Für die Evaluation der Verteilung von Substraten und Produkten zwischen beiden flüssigen und der festen Phase der Pickering Emulsion wurden exemplarisch das hydrophilste Substrat und das hydrophobste Produkt getestet. Es wurde keine signifikante Diffusion der gelösten Stoffe in die wässrige bzw. feste Phase ermittelt, insofern konnte eine dauerhaft hohe Bioverfügbarkeit der Substrate in der organischen Phase angenommen werden. Im gerührten Batch konnte eine Übertragung von Ionen zwischen den Dispersionströpfchen nur mit Hilfe von gelstabilisierten Dispersionströpfchen Einhalt geboten werden. Über derartige Modifikationen kann nun auch der Einsatz von mehreren Biokatalysatoren mit verschiedenen pH-Optima und Puffer-Präferenzen verwirklicht werden. Weiterhin konnte die disperse Phase auch gegen stark eutektische Lösungsmittel ausgetauscht werden, sodass Pickering Emulsionen auch als annähernd wasserfreie Reaktionssysteme nutzbar erschienen. In der Risiko- und Anwendungsanalyse über drei Enzymklassen mit drei als „grüner“ klassifizierten Lösungsmitteln in abgestuften Hydrophobizitäten, erwies sich Cyclopentylmethylether als das Lösungsmittel der Wahl für die Etablierung bioaktiver w/o Pickering Emulsionen. Bei der Anwendung verschiedener Biokatalysator-Phänotypen in verschiedenen Reaktionssystemen und Lösungsmitteln, kristallisierten sich bioaktive w/o Pickering Emulsion in Cyclopentylmethylether als produktivstes System heraus. Jedoch wurden bei allen Versuchen inaktivierende Vorgänge auf die verschiedenen Biokatalysatoren beobachtet, wobei Enzyme mit einer augenscheinlichen Gleichverteilung von hydrophoben und hydrophilen Aminosäureresten auf ihrer Oberfläche deutlich bessere Ergebnisse zeigten. In der Anwendung von freiem Enzym und Ganzzell-Biokatalysator, bei normierter Gesamtaktivität, resultierten für den Einsatz in bioaktiven Pickering Emulsionen die ganzen Zellen als beste Biokatalysator-Formulierung. Es wurde signifikant höhere Produktivität sowie auch 300% kleinere Tröpfchen der dispergierten Phase erreicht. Die Modularisierung von Biokatalysen gegenüber One-Pot-Synthesen zeigte ebenfalls deutliche Vorteile in den Kennzahlen der durchgeführten Biotransformation, wobei der jeweilige Prozessschritt an den Biokatalysator angepasst und so ein Optimum an Effizienz erreicht werden kann. Auf diese Weise können biokatalytische Umwandlungen kombiniert werden, die sich im One-Pot-System durch Inhibierungen der angewandten Biokatalysatoren ausschließen würden.:Vorwort/ Danksagung I Zusammenfassung III Abstract VII Liste der Publikationen XIV Abkürzungsverzeichnis und Symbole XIV 1 Einleitung 1 1.1 Biokatalysatoren – Generelle Aspekte und spezielle Vertreter 1 1.2 Angewandte Biokatalyse in Ein-und Mehrphasen-Reaktionssystemen 6 1.3 Pickering Emulsionen - Stand der Technik 14 1.4 Zielstellung der Arbeit: Optimierte bioaktive w/o Pickering Emulsionen 16 2 Material & Methoden 17 2.1 Material 17 2.1.1 Geräte & Zubehör 17 2.1.2 Chemikalien & Kits 19 2.1.3 Puffer 21 2.1.4 Enzyme 22 2.2 Proteinchemische Methoden 22 2.2.1 Bestimmung der Proteinkonzentration - BCA-Test 22 2.2.2 Bestimmung der Proteingröße und -reinheit - SDS-Polyacrylamidgelelektro- phorese (SDS – PAGE) 23 2.2.3 Photometrische Aktivitätsbestimmungen in wässrigem Milieu 24 2.2.4 Zusammenfassung Enzym-Charakteristika 27 2.3 w/o Pickering Emulsion – Essentielle Komponenten und Modifikationen 29 2.3.1 Definition des w/o PE-Standardsystems 29 2.3.2 Partikel zur Stabilisierung von w/o Pickering Emulsionen 29 2.3.3 Siliconbeschichtung von hydrophilen Partikeln und Bakterien 31 2.3.4 Bestimmung der Morphologie und Tröpfchengrößenverteilung 32 2.3.5 Lösungsmittelscreening 33 2.3.6 Phasen-Migration von Proteinen 34 2.3.7 Verteilungskoeffizienten von Substraten und Produkten im triphasischen Reaktionssystem Pickering Emulsion 34 2.4 Biokatalyse in Pickering Emulsionen 35 2.4.1 Bioaktive w/o PE - Definition des Standard-Reaktionssystems 35 2.4.2 Biokompatibilität „grüner“ Lösungsmittel 36 2.4.3 GC – Analytik 38 2.5 Statistische Auswertung der Experimente 40 2.5.1 Gewichteter Mittelwert, interne und externe Konsistenz 40 2.5.2 Lösungsmittelscreening: statistische Auswertung 41 3 Ergebnisse und Diskussion 42 3.1 Modifizierung von Nano-, Mikro- und Naturstoffpartikeln durch Siliconbeschichtung und Anwendungsscreening in w/o PE 42 3.1.1 Hydrophobizität der Silicon-Polymere 42 3.1.2 Morphologie von anorganischen Partikel-Materialien mit und ohne Silicon- Beschichtung 43 3.1.3 Morphologie von Naturstoff-Partikeln mit und ohne Silicon-Beschichtung 47 3.1.4 Partikel-Aggregation und Gegenmaßnahmen 51 3.1.5 Partikel-Screening 53 3.2 Charakterisierung von w/o Pickering Emulsionen im gerührten Batch 59 3.2.1 Pickering Emulsionen in biokatalytisch relevanten organischen Lösungs- mitteln 59 3.2.2 Bioaktive w/o PE - Auswirkung von Enzym – und Proteinmengen 66 3.2.3 Bioaktive w/o PE - Effekte der eingesetzten Partikelkonzentrationen 68 3.2.4 Bioaktive w/o PE - Einfluss der Phasenverhältnisse 70 3.2.5 Bioaktive w/o PE - Einfluss der angewandten Dispergiergeschwindigkeit 71 3.2.6 Bioaktive w/o PE - Herstellungsverfahren und Einfluss auf das Enzym 73 3.2.7 Vergleich 2-Phasensystem und bioaktive w/o Pickering Emulsion im gerührten Batch 75 3.2.8 Tröpfchengröße und Einfluss auf Produktbildung des PE-Systems 77 3.2.9 Phasen-Migration von Proteinen - Evaluation von Enzymwechselwirkungen mit dem Reaktionssystem 79 3.2.10 Verteilungskoeffizienten von Substraten und Produkten in den Standard– Reaktionssystemen 81 3.2.11 Protonen-Transfer zwischen zwei dispergierten Phasen in w/o Pickering Emulsionen 82 3.2.12 Alternative DES/o Pickering Emulsionen für wasserfreie Systeme 83 3.3 Bioaktive w/o Pickering Emulsion: Einschritt-Synthesen 84 3.3.1 Lipasenkatalysierte Umesterung in wässrigem Milieu 84 3.3.2 Carboligation mittels Benzaldehydlyase 86 3.3.3 Reduktionen via Alkoholdehydrogenasen 95 3.3.4 Transaminase 106 3.4 Bioaktive w/o Pickering Emulsionen: Mehrschritt-Synthesen 112 3.4.1 One-Pot-Biokatalyse gegen modularisierte Mehrschritt-Chemo-Biokatalyse 112 4 Bioaktive w/o Pickering Emulsionen als Reaktionssystem für Biokatalysen: Zusammenfassung & Bewertung 117 5 Plattform w/o Pickering Emulsion: Schlussfolgerung und Ausblick 130 6 Literatur 131 Anhang 150 Versicherung 150 Abbildungsverzeichnis 151 Tabellenverzeichnis 158 Download Datensammlung 164 A3.1.5 TMODS-Silicat-NP-Benchmark 165 A3.2.1-1 Lösungsmittel-Screening: physiko-chemische Eigenschaften 167 A3.2.1-2 Regressionsanalyse: Qualität PE gegen alle physiko-chemischen Eigenschaften 171 A3.2.1-3 Optimierte Regressionsanalyse: Qualität PE gegen Molekulargewicht, Dichte und Dampfdruck 173 A3.2.3 Auswirkungen von Protein- und Enzymmengen 175 A3.2.4 Effekte der eingesetzten Partikelmengen 175 A3.2.5 Einfluss der Phasenverhältnisse 176 A3.2.6 Einfluss der angewandten Dispersionsgeschwindigkeit/ -energie 176 A3.3.1 Lipasenkatalysierte Umesterung 177

Zugl.: Stuttgart, Univ., Diss., 2006

Zugl.: Stuttgart, Univ., Diss., 2006

Stuttgart, Univ., Diss., 2008.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Synthese von enantiomerenreinen α-substituierten β-Hydroxyestern zu neuartigen 4,5-disubstituieren Oxazolidin-2-onen, die auch als EVANS-Auxilare bekannt sind.

Die Arbeit beschreibt die Auffindung und Charakterisierung einer FDH aus Rhodococcus jostii. Das Enzym konnte erfolgreich als Cofaktor-Regenerierungssystem eingesetzt werden. Darüber hinaus sind verschiedene Mutagenese-Experimente beschrieben, welche eine Optimierung des Enzyms für die industrielle Anwendung ermöglichten.:1. Einleitung 1 1.1. Allgemeine Einführung 1 1.1.1. Eigenschaften von Enzymen 1 1.1.2. Veränderungen von Enzymeigenschaften durch Mutagenese 3 1.1.3. Einsatz von Enzymen 4 1.2. Cofaktor-Regenerierung 5 1.2.1. Cofaktoren 5 1.2.2. Prinzip und Bedeutung der Cofaktor-Regenerierung 7 1.2.3. Enzymatische Cofaktor-Regenerierung 8 1.3. Formiatdehydrogenasen 11 1.3.1. Metallabhängige Formiatdehydrogenasen 12 1.3.2. NAD-abhängige Formiatdehydrogenasen 15 1.4. Anwendung von NAD-abhängigen FDH 27 1.5. Motivation und Zielsetzung 30 2. Material und Methoden 32 2.1. Materialien und Geräte 32 2.1.1. Geräte 32 2.1.2. Spezialchemikalien 33 2.1.3. Enzyme 33 2.1.4. Kitsysteme 33 2.1.5. Chromatographiesäulen 34 2.1.6. Weitere Verbrauchsmaterialien 34 2.2. Nukleinsäuren und Bakterienstämme 34 2.2.1. Bakterienstämme 34 2.2.2. Spenderorganismen 34 2.2.3. Plasmide 35 2.2.4. Oligonukleotide 35 2.3. Kultivierung von Mikroorganismen 36 2.3.1. Medien 36 2.3.2. Kultivierung von E. coli-Stämmen 37 2.3.3. Kultivierung von E. coli-Stämmen in Mikrotestplatten 37 2.3.4. Rekombinante Genexpression im 250 mL-Maßstab 37 2.3.5. Rekombinante Genexpression in Mikrotestplatten 38 2.3.6. Stammhaltung 38 2.4. Molekularbiologische Methoden 38 2.4.1. Isolation genomischer DNA aus Bakterien 38 2.4.2. Plasmidisolation 38 2.4.3. Agarose-Gelelektrophorese 38 2.4.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 39 2.4.5. Gibson-Assembly 41 2.4.6. Restriktionsansätze 42 2.4.7. Isolation und Reinigung von DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel 42 2.4.8. Transformationstechniken 43 2.4.9. Mutagenesetechniken 44 2.4.10. Sequenzierung von DNA-Fragmenten 44 2.4.11. Herstellung kompetenter E. coli-Zellen 45 2.5. Biochemische Methoden 46 2.5.1. Einstellung der pH-Werte von Puffersubstanzen 46 2.5.2. Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 46 2.5.3. Proteinquantifizierung 47 2.5.4. Zellaufschluss 48 2.5.5. Proteinreinigung 49 2.5.6. Größenausschlusschromatographie (SEC) 50 2.6. Enzymatische Testverfahren 51 2.6.1. Berechnung der Enzymaktivität 51 2.6.2. Bestimmung der Enzymaktivität im 1 mL-Maßstab 51 2.6.3. Bestimmung der Enzymaktivität in Mikrotestplatten 52 2.6.4. Bestimmung der Enzymstabilität bei unterschiedlichen Temperaturen 52 2.6.5. Bestimmung der Enzymstabilität in Anwesenheit von org. Lösungsmitteln 53 2.6.6. Enzymstabilitätseffekte von Schwermetallen 53 2.6.7. Cofaktor-Regenerierungssysteme 53 2.6.8. Enzymatische Reduktion von Kohlenstoffdioxid 55 2.7. Analysemethoden 55 2.7.1. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) 55 2.7.2. Gaschromatographie (GC) 56 2.8. Bioinformatische Methoden 57 2.8.1. In silico-Arbeiten mit DNA-Sequenzen 57 2.8.2. In silico-Arbeiten mit Proteinen 57 2.8.3. In silico-Analyse von Proteineigenschaften 57 2.8.4. Erstellung von Homologiemodellen 58 3. Ergebnisse und Diskussion 59 3.1. Identifizierung hochaktiver NAD-abhängiger Formiatdehydrogenasen 59 3.1.1. Bioinformatische Auswahl von FDH-Sequenzen 59 3.1.2. Vorauswahl potentiell hochaktiver FDH-Varianten 64 3.1.3. Bereitstellung potentiell hochaktiver FDH-Varianten und Bestimmung der kinetischen Parameter 71 3.1.4. Fazit 75 3.2. Proteinbiochemische Charakterisierung der RjFDH 77 3.2.1. Allgemeine Charakteristika 77 3.2.2. Substratspektrum und Inhibition der RJFDH 83 3.2.3. Beeinflussung der Enzymaktivität der RjFDH durch Metallionen 84 3.2.4. Cofaktor-Nutzung der RjFDH 86 3.2.5. Reduktion von CO2 91 3.2.6. Temperaturabhängigkeit und Thermostabilität der RjFDH 97 3.2.7. Einfluss des pH-Werts auf die RjFDH 101 3.2.8. Einfluss von Lösungsmitteln auf die Enzymaktivität 104 3.2.9. Fazit 108 3.3. Leistung der RjFDH als Cofaktor-Regenerierungssystem 111 3.3.1. Cofaktor-Regenerierung in Kombination mit der Alkoholdehydrogenase A 111 3.3.1. Cofaktor-Regenerierung in Kombination mit der Leucin-Dehydrogenase aus Lysinibacillus sphaericus 113 3.3.2. Fazit 115 3.4. Veränderung der Enzymeigenschaften der RjFDH 116 3.4.1. Einfluss von Einzelmutationen auf die thermostabilität der RjFDH 116 3.4.2. Einfluss von Cystein-Resten auf die Enzymstabilität 127 3.4.3. Einfluss des C-terminalen Bereichs der RjFDH auf die Enzymaktivität 141 3.4.4. Veränderung der Cofaktorspezifität der RjFDH 150 Anhang 167 Literaturverzeichnis 174 Eidesstattliche Erklärung 191

Die Kohlenmonoxid-Dehydrogenase (CODH) ist ein Schlüsselenzym des reduktiven Acetyl-CoA Wegs, und katalysiert in diesem die Reduktion von CO2 zu CO mit Raten von bis zu 12 s 1. Die Rückreaktion, die Oxidation von CO, katalysiert die CODH mit Raten von bis zu 31000 s-1. Beide Reaktionen finden am aktiven Zentrum des Enzyms, einem [NiFe4S4OHx]-Cluster (C Cluster), statt. Das Genom des hydrogenogenen Bakteriums C. hydrogenoformans beinhaltet fünf putative CODHs, welche vermutlich unterschiedliche Funktionen im Organismus ausüben. Diese Arbeit charakterisiert CODH-II und CODH-IV strukturell und biochemisch. In CODH-II wurden dafür Seitenketten der 1. und 2. Koordinationssphäre des C-Clusters ausgetauscht und einer strukturellen und kinetischen Analyse unterzogen. Der zweite Teil der Arbeit analysiert den Einfluss von O2 auf CODH-II und CODH-IV. In Lösung zeigte CODH-II bei Inkubation mit O2 einen Verlust der CO-Oxidationsaktivität. Analog dazu konnte in CODH-II Kristallen die Zerstörung des C Clusters durch O2 verfolgt werden. Elektrochemisch wurde das Verhalten der CODH-II in der Gegenwart von O2 mit der CODH-IV, für welche eine Rolle in der oxidativen Stressantwort von C. hydrogenoformans diskutiert wird, verglichen. CODH-IV ist sauerstofftoleranter als CODH-II und katalysiert die Oxidation von CO hocheffizient nahe des CO-Diffussionslimits. Die Aufklärung der Struktur von CODH-IV erlaubte die Identifikation einer möglichen Ursache der höheren O2-Toleranz. Die Strukturen beider CODHs ähneln sich stark. Allerdings weist CODH IV an der Rückseite des C-Clusters eine dichtere Packung der Seitenketten auf, wodurch der Cluster von einem Angriff durch O2 abgeschirmt werden könnte. / CO-Dehydrogenase (CODH) is a key enzyme of the reductive acetyl-CoA pathway, in which it catalyses the reduction of CO2 to CO with rates up to 12 s-1. CODH catalyses the reverse reaction, the oxidation of CO with rates up to 31000 s-1. Both reactions take place at the active site of the enzyme, a [NiFe4S4OHx] cluster (cluster C). The genome of the hydrogenogenic bacterium C. hydrogenoformans contains five putative CODHs which might serve distinctive functions within the organism. This study characterises CODH-II and CODH-IV structurally and biochemically. Residues of the first and second coordination sphere of cluster C from CODH-II were exchanged and analysed concerning their structural and biochemical properties. The second part of this study analyses the influence of O2 on CODH-II and CODH-IV. CODH-II showed in solution a loss in CO-oxidation activity upon incubation with O2. In an analogous experiment, the destruction of cluster C by O2 was followed crystallographically. A role for CODH-IV in the oxidative stress response of C. hydrogenoformans has been discussed previously. Therefore, the behaviour of CODH-II and CODH-IV was analysed electrochemically in the presence of O2. CODH IV is more O2-tolerant than CODH-II and catalyses the oxidation of CO with high efficiency close to the diffusion limit of CO. Reasons for the enhanced O2-tolerance of CODH-IV could be deduced by elucidating its structure. Generally, both CODHs show high structural similarity. However, at the backside of cluster C CODH-IV shows a tighter packing of residues by which the cluster C might be shielded from O2.

Elevated reaction temperatures are crucial for the efficient enzymatic degradation of polyethylene terephthalate (PET). A disulfide bridge was introduced to the polyester hydrolase TfCut2 to substitute its calcium binding site. The melting point of the resulting variant increased to 94.7°C (wild-type TfCut2: 69.8 °C) and its half-inactivation temperature to 84.6 °C (TfCut2: 67.3 °C). The variant D204C-E253C-D174R obtained by introducing further mutations at vicinal residues showed a temperature optimum between 75 and 80 °C compared to 65 and 70 °C of the wild-type enzyme. The variant caused a weight loss of PET films of 25.0 +/- 0.8% (TfCut2: 0.3 +/-0.1%) at 70 °C after a reaction time of 48 h. The results demonstrate that a highly efficient and calcium-independent thermostable polyester hydrolase can be obtained by replacing its calcium binding site with a disulfide bridge.