Functional properties of biological molecules and cells are affected by environmental parameters such as temperature and pressure. While Raman spectroscopy provides an intrinsic probe of molecular structural changes, the incorporation of a microscope enables studies of minuscule amounts of biological compounds with spatial resolution on a micron scale. We have developed a novel setup which combines a Raman microscope and a high pressure cell. A micro-capillary made out of fused silica simultaneously serves as the supporting body and the optical window of the pressure cell. The cell has been tested over the pressure range from 0.1 to 4 kbar. Raman spectra of less than 100 nanoliter amount of amino acid and protein solutions have been measured in the micro-capillary high pressure cell. It is also demonstrated that the setup is well suited for spectrally resolved fluorescence measurements at variable pressure.

The macrocyclic square planar nickel complex, [Ni II CR] 2+ , has been shown to be a useful DNA or RNA structure probe due to its highly site- and conformation specific ability to induce cleavage on exposed guanine residues via the formation of a direct guanine N7-Ni III bond. Since the postulated intermediate [Ni III CR] 3+ is unstable, the detailed mechanism is unknown. In this study, the nature of the interaction of NiCR 2+ and its oxidized products with biomolecules was investigated. A study of the conversion of [Ni II CR] 2+ between a diamagnetic square planar structure and a paramagnetic tetragonal structure in aqueous solution has shown that the conversion is affected by the identity and the concentration of the counter anion. Of the anions studied, it is clear that Br − , ClO 4 − , and CF 3 SO 3 − have a higher ability to promote the conversion to the square planar form for [NiCR] 2+ than Cl − or CF 3 COO − . The oxidation reaction of [NiCR] 2+ with either KHSO 5 or Na 2 S 2 O 8 in a molar ratio of 1/1 resulted in the same stable complex [Ni(CR-2H)] 2+ . A single crystal x-ray diffraction study gave the structure of Ni(CR-2H)(ClO 4 ) 2 . In addition, kinetic studies revealed the oxidation reaction to be first order. The six protons on the two methyl groups of the macrocyclic ligand were also found to be sufficiently labile to exhibit hydrogen/deuterium exchange. The [Ni(CR-2H)] 2+ displays a higher acidity than [NiCR] 2+ by H/D exchange. This observation supports the conjecture that there is an enhanced dπ-pπ* back-bonding effect associated with the presence of the additional imine formed in [Ni(CR-2H)] 2+ . The [NI(CR-2H)] 2+ species with KHSO 5 also displays an oxidation ability similar to [NiCR] 2+ with KHSO 5 in the reaction with a 17 base pair synthetic oligonucleotide. This implies that [Ni(CR-2H)] 2+ is not just an oxidation product of [NiCR] 2+ , but may also play an important role in the reaction with guanine residues in oligonucleotides. The reactions of [NiCR] 2+ or [Ni(CR-2H)] 2+ with linoleic acid under a high concentration of Ni complexes (3.21 × 10 −3 M, 200 fold over linoleic acid) resulted in the unexpected reduced nickel complexes, (Ni 0 (CR-4H)-H + ) − - m/z 311.1 and (Ni 0 (CR-2H)-H + ) − - m/z 313.1, instead of the hydroperoxide product (HpODE-H + ) − - m/z 311.2.

<p> Research in the field of sol-gel derived materials has evolved dramatically over the past forty years. The developments in the past decade, in the field of bioanalytical chemistry, have revolutionized this field. Early research, as well as that done by our group, has confirmed that the commonly used alkoxysilane precursors (tetraethylorthosilicate - TEOS or tetramethylorthosilicate - TMOS) are not ideal for entrapment of biomolecules. They produce materials that are brittle, often undergo cracking due to hydration stresses and in some cases, can block the accessibility of the analyte to the entrapped biomolecules. My research project therefore focuses on the development of new sol-gel processing methods through the use of an additive-glycerol, which will produce new "second generation" glasses. I have focused on obtaining a basic understanding of glycerol-doped sol-gel derived materials and the effect they have on the entrapped biomolecules. Glycerol-doped sol-gel materials display larger pore size, decreased shrinkage and cracking as compared to the TEOS-based materials. Biocatalysts entrapped in glycerol-doped materials showed significantly smaller decreases in activity over a period of one month relative to enzyme entrapped in TEOS. Also, to gain further insight into the effects of glycerol doping on the properties of entrapped proteins, both steady-state and time-resolved fluorescence of Trp 214 was used to examine the conformation, dynamics, accessibility, thermal/chemical stability and the degree of ligand binding of human serum albumin (HSA) in solution and after entrapment of the protein in glycerol-doped TEOS-based materials.</p> / Thesis / Master of Science (MSc)

Les grands programmes de séquençage des génomes ont révélé l'existence de nombreux gènes de fonction inconnue. L'invalidation systématique de ces gènes chez les bactéries a permis de révéler le caractère essentiel de certains d'entre eux. L'étude des protéines issues de ces gènes s'est amplifiée ces dernières années car elles sont des cibles potentiellement intéressantes pour le développement de nouvelles molécules antibactériennes. YphC est une GTPase de Bacillus subtilis qui répond à ces critères. Elle est très conservée au sein des bactéries mais n'est pas retrouvée chez les organismes eucaryotes ou les archaebactéries, ce qui fait d'elle une cible de choix pour le développement de nouvelles molécules antibactériennes. YphC a la particularité de posséder deux domaines GTPases en tandem. Unique en son genre, nous avons voulu étudier cette protéine sous son aspect biochimique afin de mieux comprendre son mécanisme de fonctionnement. Nous avons donc mis au point la production et la purification de YphC et généré des mutations ponctuelles ou des délétions. Nous avons ainsi pu mesurer les constantes enzymatiques de cette protéine et caractériser l'effet d'activation du potassium sur son activité d'hydrolyse du GTP. Nous avons ainsi montré la forte activité GTPase de la protéine portée par le premier domaine GTPase et le rôle régulateur du deuxième domaine GTPase. Nous avons également étudié le rôle de YphC par une approche in vitro. Nous avons pu ainsi montrer que YphC est capable d'interagir avec les ribosomes de façon nucléotide dépendante suggérant un rôle de la protéine dans les processus de biogenèse du ribosome.

Les integrons sont des systèmes de recombinaison génétique bactériens qui jouent un rôle majeur dans la dissémination des gènes de résistances aux antibiotiques. Ces plateformes génétiques sont capables de capturer des cassettes de gène et de les réorganiser afin de trouver des solutions adaptatives à un environnement changeant. Le mécanisme de recombinaison des intégrons est original. Contrairement aux autres systèmes de recombinaison spécifique de site de la même famille (catalysés par les recombinases à tyrosine), le site de recombinaison associé aux cassettes est reconnu sous forme d'ADN simple brin replié. Une large part de mon travail de thèse a été dédiée à la compréhension des mécanismes qui permettent à ces sites de recombinaison de passer de la forme stable qu'est la double hélice d'ADN à la conformation leur permettant d'être reconnu par la recombinase des intégrons. L'autre partie de ma thèse a consisté au développement d'un outil génétique utilisant les remarquables propriétés de recombinaison des intégrons. Ce nouvel outil, nommé « intégron synthétique » permet de générer un grand nombre de combinaisons de séquences hétérologues in vivo. Il pourrait être d'une grande utilité aux ingénieurs tentant d'assembler des réseaux et voies génétiques d'intérêt, par évolution dirigée.

Streptococcus pneumoniae est un pathogène majeur chez l'homme, responsable d'otites, de pneumonies, de septicémies et de méningites. Récemment des structures de type pilus ont été identifiées à la surface de S. pneumoniae et jouent un rôle important dans les étapes initiales de colonisation des tissus hôtes. Six gènes sont impliqués dans la formation de cette structure. Trois d'entre eux codent pour les protéines structurales ou pilines (RrgA, RrgB et RrgC) et trois autres gènes codent pour les enzymes, appelées sortases, qui catalysent l'association covalente des pilines (SrtC-1, SrtC-2 et SrtC-3). Des modèles de formation du pilus ont été proposés suite à des études de délétion génétique, mais aucune donnée biochimique permettant d'expliquer précisément la formation du pilus au niveau biomoléculaire n'est encore disponible. L'étude individuelle des protéines impliquées dans la formation du pilus a permis la mise en évidence de ponts intramoléculaires Lys-Asn stabilisateurs présents dans chacune des pilines. De plus, la résolution cristallographique de RrgA et RrgB permet de mieux comprendre les propriétés adhésives de cette structure mais également son mécanisme d'assemblage. Comme le rôle de chacune des sortases reste imprécis, nous avons développé un système de co-expression permettant de tester toutes les combinaisons de pilines et de sortases. Celui-ci nous a permis d'identifier les spécificités de chacune des sortases, de générer des complexes covalents piline/piline mais également piline/sortase et ainsi d'obtenir des éléments clés dans la compréhension de la biogenèse de cette structure.

Les Archaea sont des micro-organismes rencontrés dans tous les écosystèmes, mais qui apparaissent comme majoritaires dans les environnements dits extrêmes. Les archaea hyperthermophiles, comme Pyrococcus abyssi sont en permanence exposées à des températures qui peuvent augmenter le taux de dommages de l'ADN, pourtant, le taux de mutations spontanés chez ces micro-organismes est similaire à celui des espèces modèles mésophiles. Il est ainsi probable que les hyperthermophiles possèdent des systèmes particulièrement efficaces pour dupliquer, maintenir et stabiliser leur génome. L'objectif de ce projet était d'explorer le réseau d'interaction impliqué dans les processus de réplication et de réparation de l'ADN. L'approche méthodologique mise en oeuvre a consisté à coupler la capture de partenaires d'interaction par pull-down avec leur identification par spectrométrie de masse. J'ai pu ainsi mettre en évidence, au sein l'extrait cellulaire de P. abyssi, un réseau préliminaire reliant des protéines de la maintenance génomique. Nous avons non seulement mis en évidence de nouvelles protéines impliquées probablement dans des mécanismes de réparation, mais également des nouvelles interactions non suspectées entre des composants déjà caractérisés. Les principaux résultats sont les suivants : (1) La nucléase Pab2263, partenaire du PCNA, est un nouvel acteur du métabolisme de l'ADN. (2) Le PCNA forme un macrocomplexe avec les protéines ubiquitaires Mre11 et Rad50 suggérant un rôle de ce complexe dans la réparation des cassures double brin de l'ADN lors de la réplication. (3) Les protéines Fen1 et l'ADN primase interagissent physiquement et peuvent collaborer in vitro pour résoudre une étape intermédiaire de la voie de réparation par excision de base. Ces résultats enrichissent notre compréhension des processus de réparation de l'ADN chez les archées.

L'identification des réservoirs cellulaires du VIH ainsi que la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le maintien et la réactivation de la latence sont essentiels afin d'élaborer une stratégie efficace pour éliminer le virus de l'organisme. Mon travail de thèse a porté d'une part, sur l'étude de l'infection du tissu adipeux par le VIH et son rôle potentiel comme nouveau tissu cible, et d'autre part, sur la recherche de gènes cellulaires candidats impliqués dans le contrôle de la latence du VIH.<br />Dans un premier temps, nous avons voulu déterminer si la faible production virale obtenue après infection des préadipocytes par le VIH est due à une faible efficacité d'infection ou de réplication. Nous avons montré que l'infection par les virus pseudotypés avec des glycoprotéines d'enveloppe de tropisme X4 et R5 est restreinte en raison d'une co-expression insuffisante des récepteurs viraux à la surface des préadipocytes. Cela suggère que le tissu adipeux n'est pas une cible privilégiée pour le virus in vivo et ne peut donc être considéré comme un nouveau réservoir pour le VIH.<br />Dans un deuxième temps, nous avons analysé le transcriptome différentiel de lignées cellulaires infectées de façon latente par le VIH et stimulées ou non pour la réactivation de la latence par un inhibiteur d'histone déacétylase. Parmi les gènes caractérisés, deux nous ont paru particulièrement intéressants : NCoA3 et IRF8. Après avoir confirmé les modifications de l'expression de ces gènes, nous avons analysé leurs rôles fonctionnels sur la transcription du VIH. Les facteurs NCoA3 et IRF8 pourraient respectivement être impliqués dans la réactivation et le maintien de la latence virale.

Synthèse de la carrière

Rhodopseudomonas palustris est une bactérie pourpre photosynthétique dont le génome, entièrement séquencé, a révélé avec surprise la présence de 6 gènes codant des bactériophytochromes. L'un d'entre eux (RpBphP1) joue un rôle primordial et inhabituel dans la synthèse du photosystème. Chez cette bactérie, trois autres bactériophytochromes (RpBphP2, 3 et 4) sont localisés à proximité d'opérons pucBA codant les polypeptides des antennes collectrices de lumière associées au photosystème. Ce travail de thèse a consisté dans un premier temps à étudier les rôles, les propriétés et les mécanismes d'action de ces 3 bactériophytochromes. Il a pu être ainsi montré que les 2 bactériophytochromes RpBphP2 et 3 agissent de concert dans le contrôle des antennes de types LH4. Cette voie de régulation implique l'action de 3 autres réponses-régulateurs dont la protéine Rpa3018 sensible au potentiel redox. Cette étude a également révélé que, chez certaines souches de Rps. palustris, la protéine RpBphP4 a perdu sa sensibilité à la lumière mais a acquis en contrepartie une sensibilité au potentiel redox tout en conservant sa capacité à réguler l'expression des antennes de type LH2 via un système à 2 composants. Dans un second temps, l'analyse de la séquence du génome de deux Bradyrhizobium photosynthétiques (ORS278 et BTAi1) a révélé que chaque souche possède un bactériophytochrome spécifique sûrement acquis par transfert horizontal. Les études menées sur ces différents bactériophytochromes ont mis en exergue la diversité de cette famille de senseurs de lumière ainsi que la complexité des voies de signalisation qu'ils initient.