Dans cette thèse, nous avons abordé l'étude du fonctionnement de Ccc2, l'ATPase à cuivre de S. Cerevisiae sous deux aspects. Le premier, cellulaire, concerne une étude de sa localisation et de sa fonction; le second, biochimique, est une étude du mécanisme du transport du cuivre par l'ATPase. L'étude de la distribution intra-cellulaire de Ccc2 montre que l'ATPase n'est pas confinée dans l'appareil de Golgi, mais qu'elle est distribuée dans tous les compartiments de la voie sécrétoire, ainsi qu'à la membrane de la vacuole. Cette dernière localisation, qui n'avait jamais été décrite, nous a permis de montrer la participation de Ccc2 à l'accumulation de cuivre dans la vacuole. Il s'agit du premier transporteur actif découvert pour cette fonction. D'autre part, l'étude biochimique nous a permis de mettre en évidence la fixation de deux cuivres dans le domaine nucléotidique isolé. Deux acides aminés importants pour cette liaison du cuivre ont été identifiés, les cystéines 708 et 718. Reste à découvrir le rôle de ces sites dans le transport du cuivre par Ccc2.

Le virus Epstein-Barr (EBV) est un γ-Herpesvirus infectant plus de 95 % de la population mondiale. Le facteur de transcription viral ZEBRA est responsable de la transition entre phases latentes et lytiques du virus. ZEBRA est une protéine de la famille des protéines bZIP. Elle active les promoteurs des gènes lytiques de l'EBV en se fixant sur des sites ADN spécifiques appelés sites ZREs. ZEBRA fixe préférentiellement certains sites ZREs lorsqu'ils sont méthylés sur leurs motifs CpG et notamment le site cible ZRE2 du promoteur viral du gène précoce BRLF1. Cette capacité particulière est unique à ZEBRA parmi les autres membres de la famille bZIP et s'avère critique pour l'activation du cycle lytique étant donné que le génome de l'EBV est intensivement methylé durant la phase de latence. Nous avons résolu la structure cristallographique du domaine bZIP de ZEBRA en complexe avec le site ZRE2 méthylé. L'analyse structurale corrélée à une étude de mutagenèse et à la détermination des affinités de ZEBRA pour ses sites ADN cibles, nous permet de proposer une hypothèse quant au mécanisme de fixation préférentielle de l'ADN méthylé par le facteur de transcription ZEBRA. En parallèle, nous avons débuté un criblage à haut débit de composés chimiques pouvant inhiber la fixation à l'ADN de ZEBRA et par conséquent, l'induction du cycle lytique. Ce travail améliore considérablement notre compréhension du mécanisme d'induction du cycle lytique par ZEBRA et aidera potentiellement au développement de nouveaux agents thérapeutiques contre les pathologies associées à l'EBV.

L'enveloppe bactérienne est une cible majeure d'un grand nombre d'antibiotiques naturels. Certains provoquent d'importantes perturbations de la membrane cytoplasmique, d'autres ciblent spécifiquement les différentes étapes enzymatiques de la voie de biosynthèse du peptidoglycane, constituant majeur de la paroi. Pour contrer l'action de ces antibiotiques, les bactéries ont développé divers systèmes de résistance leur conférant un avantage sélectif dans leur niche écologique. Le rejet de l'antibiotique est un des principaux mécanismes de résistance rencontré chez les bactéries. Il implique parfois des transporteurs membranaires de type ABC (pour ATP Binding Cassette) pouvant hydrolyser l'ATP pour exporter ou importer un allocrite. Les bactéries possèdent également divers systèmes leur permettant, d'une part, de détecter un signal environnemental (antibiotique ou stress de la paroi qu'il engendre), et, d'autre part, d'assurer la transduction du signal qui aboutit à une réponse adaptée. Deux types de systèmes sont impliqués dans les réponses aux stress de la paroi : les phosphorelais et les facteurs sigma à fonction extracytoplasmique.<br /><br />Le groupe des Firmicutes, dont la bactérie modèle est Bacillus subtilis, est un groupe ubiquitaire producteur d'antibiotiques et contenant de nombreux organismes pathogènes. Les analyses effectuées au laboratoire ont permis d'identifier chez les Firmicutes des systèmes associant un phosphorelais et un transporteur ABC. Dans chacun des cas, les gènes codant les différents partenaires du système sont à proximité sur le chromosome et le phosphorelais régule l'expression des gènes codant le transporteur ABC. On trouve trois de ces systèmes chez B. subtilis nommés BceRSAB (anciennement YtsABCD), YvcPQRS et YxdJKLM. L'objectif de notre étude était de tester l'hypothèse selon laquelle ces systèmes pouvaient être impliqués dans la résistance aux antibiotiques ciblant l'enveloppe bactérienne.<br /><br />La bacitracine est un antibiotique qui se complexe à l'undécaprényl pyrophosphate (UPP) et inhibe la dernière étape de la biosynthèse du peptidoglycane : la régénération de l'undécaprényl phosphate (UP). Nos résultats indiquent que le système BceRSAB est le composant majeur de la résistance à la bacitracine chez B. subtilis. L'expression de l'opéron bceAB est activée, en présence de bacitracine, par le phosphorelais BceRS. Nous avons également identifié une protéine, nommée BcrC, qui participe à la résistance à la bacitracine chez B. subtilis. Nous avons démontré que cette dernière est une UPP phosphatase impliquée dans la régénération de l'UP et s'oppose ainsi à l'action de la bacitracine. L'expression du gène bcrC ne dépend pas du phosphorelais BceRS mais de trois facteurs sigma à fonction extracytoplasmique. En conclusion, B. subtilis possède deux types de systèmes de résistance à la bacitracine indépendants et complémentaires.<br />Nous avons par la suite analysé le mécanisme de régulation de l'induction du système BceRSAB par la bacitracine. Nos résultats sont surprenants et montrent clairement que le transporteur ABC BceAB participe à l'activation de l'expression de ses propres gènes de structure avec le phosphorelais BceRS. De plus, lorsque le pool cellulaire d'UPP diminue (lorsque la phosphatase BcrC est surproduite), et en présence de bacitracine, l'expression du gène bceA diminue également. Ceci montre que l'UPP participe, avec la bacitracine, au stimulus du système BceRSAB. Notre hypothèse de travail est que le transporteur ABC, prédit comme étant un exporteur, prend en charge le complexe UPP/bacitracine et agit comme une flippase pour créer une dissymétrie membranaire ressentie par le senseur BceS. Il n'est pas exclu, qu'en présence de bacitracine, le transporteur BceAB puisse interagir avec le senseur BceS pour permettre l'activation du système.<br /><br />La majeure partie des bactéries du groupe des Firmicutes possède, d'une part, des protéines similaires à BcrC, et, d'autre part, des systèmes similaires au système BceRSAB. Toutes les protéines « BcrC-like » ont un motif caractéristique permettant de les classer dans la famille des phosphatases de type PAP2. Il est tentant de penser qu'elles sont toutes des UPP phosphatases assurant une des étapes clés de la synthèse du peptidoglycane. <br />Par ailleurs, les deux autres systèmes « Bce-like » de B. subtilis, YvcPQRS et YxdJKLM, sont également activés en présence d'antibiotiques ciblant l'enveloppe bactérienne et nous savons que le transporteur ABC YvcRS est aussi impliqué dans le mécanisme de régulation. Nous proposons donc que les systèmes « Bce-like » des Firmicutes sont tous des systèmes de détoxification dirigés contre des antibiotiques ciblant l'enveloppe bactérienne.

Depuis 2000, l'implantation d'un groupe nutrition dans l'équipe d'Yves Malthièry a mis l'accent sur les anomalies du métabolisme énergétique mitochondrial dans les situations hypercataboliques. Cela se positionne dans un contexte de santé où l'hypercatabolisme affecte 20 à 40 % des patients hospitalisés, et 30 à 80 ù des patients atteints de cancer. Le développement d'une alimentation fonctionnelle et susceptible de moduler certaines de ces anomalies, tout particulièrement par la qualité des lipides (acides gras de la série n-3, produit de la mer et de la filière lin-colza-soja) est la finalité de ces recherches.<br />Les principaux résultats obtenus au sein de notre laboratoire montrent que dans un modèle de rat hypercatabolique ( rat traité par dexamethasone), une partie de la perte d'énergie est induite par un dysfonctionnement mitochondrial ( Dumas 2003 ; Roussel 2003, 2004). L'origine de ce dysfonctionnement n'est pas clairement établie et nous envisageons dans ce contexte qu'il puisse être soit à l'origine de perturbation de grandes fonctions cellulaires (protéolyse, protéosynthèse, glycolyse, négolucogenèse, production et épuration des radicaux libres), soit être la conséquence d'une demande d'énergie accrue pour ces grandes fonctions.<br />La situation de perte de poids, qu'elle soit volontaire ou involontaire, est une parfaite illustration de stress énergétique. Dans ce contexte, l'organisme doit s'adapter de manière à répondre à des besoins importants en énergie sans pour autant disposer de plus de ressources, ou au contraire, l'organisme doit adapter ses besoin et optimiser son utilisation des ressources disponibles car celles-ci sont diminuées. Il est donc intéressant dans ce contexte de positionner la mitochondrie comme un élément centrale de cette régulation et d'étudier son fonctionnement ainsi que le contexte métabolique qui l'entoure pour comprendre comment l'organisme prganise sa réponse face au stress énergétique.<br />La Mitoligo a donc été développée dans le but de permettre l'étude du transcriptome de l'homme et du rat en se focalisant sur les grandes fonctions énergétiques. Cet outil nous permet d'étudier le métabolisme mitochondrial dans sa globalité. Il est ainsi possible d'établir un profil transcriptomique de la chaine respiratoire mais également de toutes les fonctions du métabolisme périphérique et notamment des voies métaboliques impliqués dans la production de substrats pour la chaine respiratoire.

La schistosomiase constitue un problème majeur de santé publique dans de nombreux pays émergents d'Afrique, d'Amérique Latine et d'Asie du Sud Est, causant près de 300 000 décès par an. Cette maladie est due au schistosome qui est un ver parasite possédant un cycle de vie complexe. A ce jour une seule drogue est utilisée en monothérapie, le praziquantel ou PZQ, pour lutter contre cette maladie. En raison d'apparitions de résistances au PZQ, il devient nécessaire de rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques contre le ver. Au cours de ma thèse je me suis penché sur l'utilisation potentielle des Récepteurs Tyrosine Kinase (RTK) de schistosomes comme cibles thérapeutiques contre le parasite. En effet, les kinases du schistosome semblent présenter un fort degré de spécificité, ce qui les rend attractives pour le l'élaboration d'inhibiteurs potentiels. Dans ce cadre, nous avons poursuivi l'étude de SmIR-1, un récepteur de l'insuline de Schistosoma mansoni découvert au laboratoire, et montré qu'il pouvait être impliqué dans la prise de glucose chez le parasite. Dans un second temps, à partir d'un RTK totalement atypique décrit au laboratoire chez S. mansoni, nous avons découvert une nouvelle famille de RTK nommés les VKR pour Venus Kinase Recepteur, qui semblerait étendue à l'ensemble des invertébrés et dont nous avons entrepris l'étude fonctionnelle

Les kinésines constituent une famille protéique convertissant l'énergie d'hydrolyse de l'ATP en un travail mécanique permettant un déplacement de l'enzyme le long des microtubules. Chez l'homme, une quarantaine de kinésines sont actuellement recensées et 13 d'entre elles sont nommées kinésines mitotiques en raison de leurs implications essentielles au bon déroulement de la Mitose. La protéine MKLP-1, kinésine de la sous-famille 6, est l'une de ces kinésines mitotiques. In vivo, elle s'associe à la protéine MgcRacGAP (protéine activatrice de petites protéines G) pour former un complexe hétérotétramérique : le « centralspindlin complex ». Ce complexe est un élément important de la régulation de la cytokinèse et participe notamment à la formation du « corps intermédiaire » durant la division cellulaire. MKLP-1 possède à la différence des autres kinésines, une large insertion de 80 acides aminés dans la boucle L6 de son domaine moteur ; cette insertion est une caractéristique unique des kinésines de la sous-famille 6 (MKLP-2, MPP1...). Afin de sonder le rôle de la boucle L6 au cours des processus catalytiques, j'ai effectué la caractérisation enzymatique du domaine moteur sauvage de MKLP1 et d'un mutant où la boucle native L6 est remplacée par la boucle L6 de la kinésine conventionnelle KHC (5 acides aminés). J'ai aussi réalisé un criblage de chimiothéques sur l'activité ATPasique du domaine moteur. J'ai ainsi pu mettre en évidence un nouvel inhibiteur de la reconnaissance kinésine/tubuline. De plus, pour éclaircir les mécanismes mis en jeu par le « centralspindlin complex » dans l'agrégation des microtubules, j'ai entrepris pour différentes constructions de MKLP-1 et de MgcRacGAP, l'étude de leurs profils d'interactions avec la tubuline. J'ai ainsi pu établir un modèle de fixation du « centralspindlin complex » avec les microtubules.

Les Adénovirus sont des virus non enveloppés à symétrie icosaédrique et constituent la famille des Adenoviridae. Ils existent une grande variété de souches pouvant infecter des hôtes allant de l'homme jusqu'au poisson. L'étude de l'Adénovirus a été stimulée par la découverte en 1962 par Trentin et collaborateurs de leur capacité à induire des tumeurs chez les bébés hamsters. Sur le plan structural, de nombreuses études en Microscopie Electronique ont été menées pour comprendre l'assemblage et la formation de la capside. Depuis les années 90, avec la progression de l'informatique et des techniques liées à l'analyse d'images, la structure de la capside des Adénovirus humains est de mieux en mieux comprise mais la localisation de certaines protéines mineures restaient encore incertaine ou inconnue. Nous avons, à travers l'utilisation de la Microscopie Electronique associée à l'analyse d'images, obtenu des reconstructions 3D pour plusieurs souches d'Adénovirus humains, canins et aviaires. L'obtention d'un modèle 3D à haute résolution pour l'Adénovirus humain de type 5 nous a permis de reconstituer un modèle quasiatomique par la méthode de « fitting » et de déterminer avec plus de précisions la position de certaines protéines mineures comme la protéine IX, IIIa et VIII. L'étude d'une souche mutante d'Adénovirus de type 5 en complexe avec un Fab ainsi que d'une souche canine nous a permis de localiser précisément l'extrémité C terminale de la protéine IX. Enfin l'obtention d'une structure à haute résolution d'un virus immature dérivé de l'Adénovirus humain de type 2 a ouvert la voie sur l'étude et la compréhension de la maturation et de la phase précoce de son cycle cellulaire.

Alix est une protéine adaptatrice impliquée dans plusieurs processus intracellulaires, dont l'apoptose, l'endocytose et le trafic membranaire, le bourgeonnement de certains rétrovirus (ex. HIV-1, EIAV) à travers la membrane plasmique ou encore la cytokinèse. Alix est constituée de trois domaines majeurs: un domaine BRO N-terminal, un domaine spécifique « en V » central (Alix-V) et un domaine C-terminal riche en prolines (PRD). Nous avons montré que la forme tronquée en C-terminal au niveau du domaine PRD (Alix-∃PRD) formait des monomères et des dimères en solution, et que le domaine Alix-V était suffisant pour permettre cette dimérisation. La diffraction de rayons X aux petits angles (SAXS) a montré que Alix-∃PRD se structurait en une forme incurvée et allongée qui rappelle les domaines BAR impliqués dans les phénomènes d'incurvation de membrane. Bien que l'interaction d'Alix avec la membrane ait été mise en évidence in vitro, sa capacité à déformer la membrane doit encore être confirmée. En outre, nous avons déterminé lors d'expériences de microcalorimétrie que les formes monomériques et dimériques de Alix-V interagissent avec un peptide dérivé de la protéine p9 EIAV Gag avec une affinité de l'ordre du micromolaire. Des cristaux de la forme dimérique de Alix-V ont été obtenus. Ces cristaux présentaient un faible pouvoir de diffraction (10Å). En revanche, des cristaux diffractant à 3Å ont été obtenus à partir d'une forme mutante de Alix-V (Mut1) incapable de dimériser et qui se structure en une forme monomérique ouverte et allongée ; la résolution de cette structure est en cours. De plus, nous avons montré que l'absence de relarguage des particules virales (VLP) après surexpression de la forme humaine de Alix-∃Bro (résidus 358-868) pouvait être rétablie à partir de la version Mut1 de cette forme, ce qui suggère donc un rôle de cette dimérisation dans le relarguage des VLP. La protéine Alix-V dimérique a également été utilisée pour produire un antisérum Alix, qui a montré que la protéine endogène Alix pouvait être co-localiser avec les endosomes de recyclage. Enfin, nous avons montré que CHMP4B formant des structures polymériques en anneaux, pouvait interagir avec Alix. L'ensemble de ces résultats donne de nouvelles informations sur la flexibilité conformationnelle d'Alix et, associée avec CHMP4, sur son implication dans les processus de bourgeonnement membranaire. Ce travail définit également le cadre des futures analyses fonctionnelles visant à définir le rôle de la protéine dimérique Alix dans les cellules infectées par le virus HIV-1.

L'ARN polymérase II sert à la transcription de petits ARN non codants et à la transcription des ARN messagers. La première étape de l'activation de la transcription est la reconnaissance de régions de l'ADN par les activateurs spécifiques. Ceci permet le recrutement de coactivateurs, des facteurs généraux (GTF) et de Pol II pour former le complexe de préinitiation (PIC). Au cours de ma thèse, nous nous sommes concentré sur le rôle du Médiateur, un complexe multiprotéique qui joue un rôle essentiel dans ce processus. Nous avons découvert une interaction génétique entre MED31 qui code pour la sous-unité la mieux conservée du Médiateur et DST1 qui code le facteur d'élongation TFIIS. De façon surprenante, notre étude a révélé un nouveau rôle pour TFIIS qui intervient au cours de l'initiation de la transcription en conjonction avec le Médiateur pour recruter Pol II sur la région promotrice des gènes. Ensuite, nous avons identifié une interaction directe entre Med11 et Rad3, des sous-unités de la tête du Médiateur et de TFIIH. Nous avons alors poursuivi notre étude sur cette interaction et sur celles entre Med11 et ses partenaires au sein du complexe: Med17 et Med22. Des mutants qui affectent ces interactions présentent des défauts de recrutement de TFIIH, de TFIIE et de Pol II ou déstabilisent l'association des modules de TFIIH. Nous avons également mis à jour le rôle du Médiateur sur la phosphorylation du CTD de Pol II via la stabilisation de TFIIK sur la région promotrice. L'ensemble de nos résultats révèle un rôle essentiel du Médiateur dans les recrutements des facteurs généraux au cours de l'initiation et suggère un assemblage branché pendant la formation du PIC.

Les Métalloprotéases matricielles (MMPs) constituent une famille des métalloprotéases à zinc capables conjointement de dégrader l'ensemble des protéines de la matrice extracellulaire. Aujourd'hui, vingt-trois MMPs humaines ont été identifiées et sont caractérisées par leur séquence en aminoacides et leur structure 3D fortement conservées. Ces enzymes sont exprimées de manière constitutive au cours des processus de remodelage tissulaire. Leur surexpression dans un certain nombre de pathologies étroitement liée au phénomène d'inflammation (arthrite, emphysème, cancer) fait des MMPs des cibles thérapeutiques de choix. Cependant, le remodelage entraînant des modifications des contacts cellulaires, les MMPs apparaissent aujourd'hui comme des protéines des voies de signalisation à part entière. Les récentes découvertes de substrats des MMPs ne faisant pas partie des constituants de la matrice extracellulaire renforcent cette vision. Dans le but d'identifier le rôle particulier et le taux d'expression protéique des MMPs dans un contexte pathologique, nous avons développé une technique de protéomique fonctionnelle dédiée à la détection des formes actives des MMPs dans des échantillons tumoraux. Cette technique repose sur le développement d'une nouvelle sonde de photoaffinité, basée sur la structure d'un puissant inhibiteur des MMPs de type phosphinique, permettant de cibler les MMPs sous forme active et de les isoler par marquage par photoaffinité. Le marquage par photoaffinité nous permet ainsi grâce à un élément radioactif incorporé à la sonde de radiomarquer les protéines ciblées. Cette sonde a montré in vitro sa capacité remarquable à modifier de manière covalente la hMMP-12 avec un rendement de 42 %, affichant une sensibilité extrême de détection (2.5 fmoles de hMMP-12). En présence de protéome complexe, la sensibilité de détection de la sonde pour la hMMP-12 est tout à fait comparable (5 fmoles) ; la hMMP-12 représente une fraction de 0.001 % de la quantité totale des protéines. Cette méthode nous a permis également d'identifier de manière indirecte les formes actives des gélatinases en comparant les extraits tumoraux traités par la sonde et les extraits tumoraux analysés en zymographie. Ces études indiquent que les niveaux d'expression des formes actives de MMPs sont très faibles (fmoles) ne permettant pas une caractérisation de celles-ci par spectrométrie de masse, ce qui constitue un véritable défi pouvant être abordé avec de nouvelles sondes incorporant une biotine. Cet exemple de protéines exprimées sous forme active en très faible abondance, implique une orientation des efforts à consentir vers le développement de nouvelles stratégies de capture.