L'ATP synthase ou ATPase de type F, ancrée aux membranes internes des mitochondries, est un complexe macromoléculaire qui utilise le gradient électrochimique généré par l'oxydation de petites molécules (NADH2, FADH2) dans les différents complexes de la chaîne respiratoire pour former l'ATP, vecteur énergétique universel. Le gradient électrochimique ou pmf est transformé en une énergie mécanique qui se traduit par le mouvement du rotor de l'ATP synthase dans un sens horaire vu depuis la membrane. La rotation de la sous-unité déforme successivement les trois sites catalytiques et permet ainsi la synthèse d'ATP. Dans certains cas, comme ceux de l'anoxie ou de l'hypoxie, le gradient électrochimique peut s'effondrer et l'ATP synthase hydrolyse alors l'ATP. Pour éviter cette hydrolyse futile, un petit peptide nommé IF1, régulateur spécifique des ATP synthases mitochondriales, vient s'insérer entre les sous-unités d'une interface catalytique et bloque instantanément le fonctionnement de l'ATPase. Cette inhibition est réversible puisque le peptide se décroche lorsque la membrane interne mitochondriale se réénergise. Dans ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés à caractériser le mécanisme d'inhibition de l'ATPase de S.cerevisiae par son peptide endogène IF1 en s'appuyant essentiellement sur les quelques données structurales qui ont été publiées sur le peptide et sur le complexe inhibé IF1-F1-ATPase de B.taurus. Constitué de 63 acides aminés chez S.cerevisiae et 84 acides aminés chez B.taurus, IF1 est majoritairement structuré en hélice α. Les études menées par Elena Cabezón ont montré qu'IF1 possédait différentes formes dont la prédominance et l'activité dépendait essentiellement du pH. Chez B.taurus, il existe une forme inhibitrice dimérique prédominante à pH inférieurs à 6,5 et une forme tétramérique dont nous connaissons la structure 3D qui est non inhibitrice et prépondérante à pH supérieurs à 6,5. Chez S.cerevisiae, il existe une forme monomérique inhibitrice prépondérante à pH supérieur à 6,5 et une forme dimérique prédominante à pH inférieurs à 6,5 et dont le caractère inhibiteur ou non n'a pas encore été déterminé. Sur la base de la structure 3D de l'IF1 bovin, nous avons voulu identifier les régions de dimérisation du peptide de levure en utilisant la technique de marquage de spin couplée à de la spectroscopie RPE. En plaçant des marqueurs de spin (MTSL) en partie médiane (E33C) ou en C-terminale (L54C), nous avons pu favoriser l'interface de dimérisation plutôt en partie médiane du peptide. Ce travail est encore au stade embryonnaire et ne nous permet pas, à ce jour, d'identifier la zone exacte de dimérisation. Dans un deuxième volet, nous avons voulu caractériser le mécanisme d'inhibition d'un point de vue dynamique et nous avons pu en préciser les différentes étapes : reconnaissance, verrouillage et stabilisation. Pour cela, nous avons associé la mutagenèse sur le peptide et sur l'enzyme aux cinétiques d'inhibition. Nous avons tout d'abord évalué le rôle de plusieurs résidus situés en Cterminal de la sous-unité β, dans la région de l'interface α/ β qui se referme sur le peptide IF1, dans la reconnaissance moléculaire spécifique d'IF1 par l'ATPase mitochondriale. Nous avons ensuite montré que la partie N-terminale d'IF1 joue un rôle mineur dans la reconnaissance moléculaire mais son enroulement autour de la sous-unité constitue un loquet important dans la stabilisation du complexe inhibé. Enfin, la fermeture de l'interface catalytique sur IF1 crée une zone de contact entre la "bosse" de la sous-unité γ et la partie C-terminale de la sous-unité α qui constitue la dernière clef de blocage du peptide au sein de la F1-ATPase. Ce dernier point de fermeture est le seul qui n'implique aucun résidu du peptide IF1.

Le passage sélectif d'ions et de métabolites à travers les membranes biologiques est essentiel à de nombreux processus cellulaires fondamentaux. Au niveau de la membrane interne de la mitochondrie, la communication cellulaire et les processus d'échanges sont principalement assurés par les transporteurs mitochondriaux. Ces protéines membranaires jouent un rôle clef dans les fonctions métaboliques des cellules eucaryotes et leur dysfonctionnement est à l'origine d'un certain nombre de maladies graves chez l'homme Parmi les transporteurs mitochondriaux, deux familles ont été étudiées au cours de ce travail : les AACs (ADP/ATP Carriers) et les UCPs (UnCoupling Proteins). Deux systèmes de production hétérologue de ces transporteurs ont été mis en place : la synthèse in vitro et l'expression chez E. coli de protéines de fusion. Le premier a permis la production et la purification d'environ 0,6 mg de protéine par mL de réaction et le deuxième a été exploité afin de réaliser des caractérisations fonctionnelles des transporteurs ADP/ATP. Un test fonctionnel pour la protéine découplante a également été mis au point. Ce test, basé sur la mesure directe des courants électriques associés à l'activité de transport de l'UCP, à permis la caractérisation fonctionnelle de la protéine UCP1 native.

Résumé à venir

Le trafic rétrograde permet le transport des protéines de la membrane plasmique vers le réticulum endoplasmique, via l'appareil de Golgi, évité la dégradation des lysosomes. Des études antérieures ont montré que le transport rétrograde est crucial pour les fonctions cellulaires telles que la signalisation, l'homéostasie ionique, et l'établissement de gradients du morphogène Wnt. Par ailleurs, le transport rétrograde joue un rôle essentiel dans l'internalisation cellulaire des facteurs pathogènes comme les toxines protéiques et les protéines de virus. Toutefois, la liste actuelle des protéines cargos est limitée, et il est probable que de nombreuses fonctions cellulaires du transport rétrograde restent encore à découvrir. De toute évidence, un fort besoin existe pour une caractérisation plus poussée de cette voie de transport. Dans cette étude, quatre différentes approches protéomiques ont été développées visant à identifier les protéines membranaires prenant la route du transport rétrograde: SNAP-tag, sulfatation, la FKBP, et la streptavidine. Parmi ceux-ci, l'approche SNAP-tag s'est avéré être la stratégie la plus efficace pour identifier les candidats du fret de la voie rétrograde. Cette stratégie est basée sur la modification covalente du protéome de la membrane plasmique avec un benzylguanine (BG) dérivés. Seules les protéines membranaires BG-taggées qui sont ensuite transportés par voie rétrograde peuvent coupler covalentement à une protéine de fusion de SNAP-tag localisée dans la TGN. L'approche a été validée, étape par étape, en utilisant une protéine cargo rétrograde bien étudiée, toxine Shiga sous-unité B (STxB). Nous avons pu montrer que les STxB peuvent être capturés et identifiées par l'approche SNAP-tag. Par ailleurs, couplé à la LC-MS, les candidats des nouvelle protéines de la voie rétrograde ont été identifiés. Les trois autres approches ont guidé notre choix vers la stratégie la plus efficace en protéomique, en apportant des possibilités d'expérimentation et de défauts dans les domaines de la chimie organique et en biologie cellulaire. Généralement, ce travail de thèse a permis de développer une nouvelle stratégie protéomique qui pourraient être appliquée pour identifier les nouvelles candidats de la route rétrograde. Nous avons mis au point une approche dynamique en protéomique qui complète la protéomique traditionnelle. Par ailleurs, le concept d'utiliser des outils chimiques pour étudier le transport rétrograde peut également être appliqué à d'autres voies d'endocytose.

La connaissance des structures tridimensionnelles des macromolécules biologiques est indispensable pour mieux comprendre leur rôle et pour la conception de nouvelles molécules thérapeutiques. Les techniques utilisées actuellement offrent une grande variété d'approches qui utilisent à la fois des informations spécifiques à la protéine étudiée et des informations génériques communes { l'ensemble des protéines. Il est possible de classer ces méthodes en fonction de la quantité d'information utilisée dans chacune de ces deux catégories avec d'un côté des méthodes utilisant le plus possible de données spécifiques { la protéine étudiée et de l'autre les méthodes utilisant le plus possibles de données génériques présentes dans les bases de données. Le travail présenté dans cette thèse aborde deux utilisations de techniques mixtes, présentant une autre combinaison entre données spécifiques et données génériques. En particulier nous avons cherché à obtenir la structure de protéines composée d'un ou deux domaines en ne disposant que d'un nombre restreint de données spécifiques. Pour déterminer la structure d'une protéine de grande taille composée de deux domaines { l'aide de données de diffusion des rayons X et de modèles obtenus par de la modélisation par homologie, nous avons adapté puis optimisé un programme récemment développé au laboratoire. Nous avons ensuite modélisé la structure d'un domaine d'une protéine de virus en incorporant un faible nombre de contraintes issues des données obtenues par RMN dans une méthode de prédiction de structure " ab initio ". Enfin, nous avons étudié l'intérêt d'intégrer les courants de cycle, une composante du déplacement chimique, dans un programme d'arrimage moléculaire pour la résolution de complexes protéine-ADN.

Les métaux sont omniprésents sur la planète et sont devenus nécessaires à tous les organismes vivants au cours de l'évolution. Cependant, la quantité de métal présent dans les cellules doit être très finement régulée car une quantité trop importante de métaux peut générer une toxicité. Pour assurer cette homéostasie, les cellules doivent être capables de réguler l'import et l'efflux des métaux par l'expression dynamique de protéines spécifi ques impliquées dans ces flux ioniques. Chez la bactérie modèle Escherichia coli, la toxicité du nickel et du cobalt est neutralisée par l'action de la pompe RcnA, protéine membranaire capable d'exporter les ions Ni2+ et Co2+ hors de la cellule. La production de RcnA est contrôlée par le métallorégulateur RcnR capable de détecter ces ions en cas d'excès et d'induire, en réponse à ce signal, l'expression du gène rcnA. Récemment, notre équipe a identi fié un nouveau gène que nous avons rebaptisé rcnB (précédemment yohN ). Ce gène fait partie de l'opéron rcnAB et est, comme rcnA, impliqué dans l'homéostasie des ions Ni2+ et Co2+. A l'inverse de rcnA, une souche mutante délétée de rcnB est plus résistante au nickel et au cobalt et cela est directement corrélée à une plus faible accumulation de métal dans les cellules. Le gène rcnB code pour une petite protéine monomérique de 10 kDa localisée dans le périplasme et ne possédant pas d'homologues décrits à l'heure actuelle. Aucune fixation des ions Ni2+ et Co2+ n'a été mise en évidence pour la protéine RcnB. Elle peut en revanche interagir avec les ions Cu+ et Cu2+ aussi bien in vitro que in vivo et un lien avec les systèmes de résistance au cuivre de E. coli a été mis en évidence. Or, le cuivre confère des propriétés d'oxydo-réduction particulières aux protéines qui pourraient être directement liées à la fonction de RcnB. Des investigations complémentaires sont nécessaires pour préciser la fonction exacte de RcnB, mais ce travail a mis en évidence le premier membre d'une nouvelle famille de protéines accessoires associées aux pompes d'efflux des ions métalliques.

L'expression de l'information génétique est régulée par des facteurs de transcription. Parmi ces facteurs, le récepteur de la vitamine D (VDR) appartient à la famille des récepteurs nucléaires, activables par la fixation d'un ligand. La forme active de la vitamine D, le Calcitriol, est le ligand naturel du VDR et est impliqué dans de nombreuses fonctions biologiques telles que l'homéostasie du calcium et du phosphate, l'inflammation, la différenciation et la prolifération cellulaires et l'apoptose. Cependant, ses actions intrinsèques génomiques s'accompagnent d'effets hypercalcémiques non-génomiques qui limitent ses applications thérapeutiques. Dans l'objectif de dissocier les actions anti-tumorales du Calcitriol de ses effets hypercalcémiques pour des applications thérapeutiques, le challenge consiste à différencier précisément les acteurs de la voie non-génomique de ceux de la voie génomique. Précédemment, le résidu Leu337 du VDR de poisson-zèbre a été identifié comme jouant un rôle majeur dans l'adaptabilité du domaine de fixation du ligand. Une étude classique de mutagenèse a mis en évidence un résultat surprenant : le mutant VDR Leu337His abolit l'activité génomique du VDR en présence du Calcitriol mais présente une activité transcriptionnelle identique au récepteur sauvage en présence du ligand synthétique à double chaîne latérale Gemini. Mon travail de thèse a consiste à comprendre les bases structurales de cette sélectivité. Les résultats présentés montrent que tout comme les VDR sauvages humain et du poisson-zèbre, les VDR mutés de ces deux espèces se comportent de manière similaire en présence des ligands Calcitriol et Gemini en termes d'affinités de liaison et de transactivation. L'étude structurale a mis en évidence une interaction cruciale pour la stabilisation du ligand naturel. En revanche, la mutation Leu337His a un effet silencieux en présence du Gemini et de deux analogues du Gemini que nous avons étudiés. De plus, les résultats structuraux révèlent que les ligands à deux chaînes latérales sont moins sensibles aux modifications affectant le réseau de contacts entre les résidus de la poche et le ligand. Mes travaux de thèse ont permis d'établir les bases structurales et moléculaires pour la création d'un modèle animal in vivo original (souris génétiquement modifiée exprimant le VDR muté) qui permettra d'éteindre ou d'allumer le VDR nucléaire selon la présence de Calcitriol ou de Gemini, et ainsi de dissocier la voie génomique de la voie non-génomique induite par le Calcitriol. Ce travail de thèse s'inscrit dans une approche pluridisciplinaire, allant de l'atome à l'organisme et l'intégration de l'ensemble des données in vivo permettra une meilleure compréhension de la signalisation induite par l'hormone Calcitriol et le développement de nouveaux traitements hautement spécifiques.

Les lipoxygénases (LOXs, EC 1.13.11.12) sont des dioxygénases qui catalysent l'hydroperoxidation des acides gras polyinsaturés. Bien que de nombreuse isoformes de LOXs aient été caractérisé chez de nombreux végétaux, leur rôle physiologique reste inconnu. Dans le but d'éclaircir le rôle des LOXs dans l'olive et leur contribution dans l'élaboration de l'arôme, nous avons cloné et caractérisé un ADNc codant pour une isoforme de LOX d'olive exprimé dans les derniers stades de maturation du fruit. Cet ADNc présente un cadre de lecture ouvert qui code pour une protéine de 864 acides aminés. Cette LOX d'olive fait partie des LOXs de type-1 et présente un fort pourcentage d'identité avec la LOX de noisette (77,3%) et la LOX de tabac (76,3%). L'enzyme recombinante présente une double spécificité, elle produit des 9- et des 13-hydroperoxydes dans un rapport 2:1. Bien que l'activité LOX soit détectée à tous les stades de développement des olives, la 9/13-LOX est uniquement exprimé dans les stades noirs. Nos résultats suggèrent qu'il existe au moins deux gènes lox exprimés dans les olives noires, et que la 9/13-LOX est associé aux phénomènes de maturation et de sénescence. Cependant, en considérant sa double spécificité de substrat et son profil d'expression, nous ne pouvons pas exclure que cette enzyme puisse jouer un rôle dans l'élaboration de l'arôme. Nous avons modifié l'accessibilité au site actif de la LOX d'olive en mutant les résidus Phe277 et Tyr280 situés à l'entrée du site actif par des résidus à chaîne latérale courte (Ala et Ile). Nous avons exprimé les mutants F277A, Y280I et F277A/Y280I chez E. coli et nous les avons partiellement purifié. Les mutants F277A et F277A/Y280I présentent un taux de conversion de l'acide linoléique 4 fois supérieur à celui de la LOX d'olive non mutée et ont des paramètres cinétiques similaires à la LOX1 de soja.

Streptococcus pneumoniae est un pathogène majeur chez l'homme, responsable d'otites sévères, de pneumonies, de bactériémies et de méningites. C'est une cause majeure de mortalité et de morbidité, essentiellement chez les enfants et les personnes âgées. Il a été récemment découvert que certaines souches virulentes de S. pneumoniae portent à leur surface des pili, considérés comme un important facteur de virulence. Cependant, contrairement aux bactéries à Gram-négatif, peu de choses sont connues sur la structure des pili des bactéries à Gram-positif. Les gènes requis pour la production des pili chez S. pneumoniae sont localisés sur un îlot de pathogénicité et codent pour 3 sortases (SrtC-1, SrtC-2, SrtC-3) et 3 protéines structurales (RrgB, qui forme le corps du pilus, RrgA et RrgC). Celles-ci contiennent un motif LPXTG, motif de reconnaissance des enzymes sortases. Dans ce travail, nous apportons de nouvelles informations structurale, biochimique et microbiologique sur le mécanisme de formation du pilus par (1) une reconstitution du corps de la fibre in vitro après avoir identifié SrtC-1 comme étant la principale pilus-polymérase; (2) une étude de microscopie électronique montrant que les fibres produites in vitro mimaient structuralement les pili ; (3) une étude in vivo confirmant les résultats obtenus in vitro; (4) la résolution de la structure par cristallographie aux rayons X de SrtC-1 et SrtC-3 qui révèle un site actif dont l'accès est contrôlé par un couvercle flexible, contrairement aux sortases non impliquées dans la biogenèse de pili. Ces observations suggèrent que la spécificité de substrat est dictée par une reconnaissance de surface couplée à une ouverture du couvercle. Dans un second temps, nous avons caractérisé la région du site actif de SrtC-1 : la triade catalytique mais aussi les deux résidus du couvercle qui s'ancrent dans le site actif. L'identification de résidus clés dans l'activité sortasique aussi bien que dans la stabilisation structurale a été ainsi mis en évidence.

La spéciation est un mécanisme central de la diversification biologique. Ce travail vise à analyser l'évolution transcriptomique accompagnant la spéciation chez les spartines (Poaceae) qui jouent un rôle important dans la dynamique sédimentaire des marais salés. Ce genre est caractérisé par différents types de spéciation divergente et réticulée au niveau polyploïde. L'évolution du transcriptome par différentes analyses de polymorphisme et par microarrays a été analysée chez deux espèces soeurs hexaploïdes S. maritima (en régression en Europe) et S. alterniflora (envahissante). Malgré une faible divergence nucléotidique, ces deux espèces montrent des différences d'expression importantes. Les conséquences de l'hybridation et de la duplication du génome ont été examinées chez deux hybrides F1 (S. x neyrautii et S. x townsendii) formés récemment et indépendamment à partir des mêmes parents, et chez l'allopolyploïde envahissant S. anglica. Nos résultats ont montré les effets importants, mais différents de l'hybridation et de la duplication du génome sur le transcriptome. Cet effet se manifeste par une dominance d'expression maternelle (chez les hybrides F1) qui s'atténue chez l'allopolyploïde. Ce dernier se distingue par une surexpression de la majorité des gènes. Les régions flanquant les éléments transposables Ins2, Wis-like, Cassandra apparaissent également affectées par cette dynamique. Les deux événements d'hybridation ont engendré des réponses différentes, en accord avec la morphologie très différente des hybrides. Les catégories de gènes différentiellement exprimées entre les espèces sont discutées dans le contexte des différences phénotypiques et écologiques de ces espèces.