Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est un gamma herpesvirus humain largement répandu dans le monde. Il est responsable de la mononucléose infectieuse et associé à diverses pathologies lymphoprolifératives. L'une des protéines lytiques précoces d'EBV est la dUTPase, enzyme hydrolysant le dUTP en dUMP prévenant ainsi sa mésincorporation dans l'ADN. Les structures cristallographiques et les études enzymatiques de plusieurs mutants de cette protéine ont permis d'étudier le mécanisme catalytique en détail. Le motif C terminal et notamment le résidu phénylalanine conservé sont essentiels à l'activité de l'enzyme contrairement au pont disulfure reliant les deux extrémités de la dUTPase. Le magnésium, cofacteur de la réaction est impliqué dans l'affinité pour le substrat. Ces éléments permettent d'avoir une vision précise du fonctionnement de cette enzyme. Nous avons étudié une autre protéine précoce du cycle lytique, EB2, facteur d'export des ARNm viraux. Les complexes décrits dans la littérature n'ont pas pu être clairement reproduits dans nos conditions expérimentales. Toutefois nos travaux ont permis d'optimiser les conditions de purification de deux constructions C terminales de la protéine et les analyses biophysiques soulèvent des questions sur l'état d'oligomérisation de cette protéine, ces hypothèses étant intéressantes à développer par la suite.

La peau est la première barrière de protection de l'organisme face aux agressions de l'environnement incluant notamment les radiations UV solaires, responsables de nombreux dommages sur l'ADN. Afin de prévenir l'apparition de lésions et de maintenir l'intégrité du génome, la cellule a mis en place des systèmes de protection avec la réponse pigmentaire, et de réparation avec le mécanisme du NER (nucleotide excision repair). Le NER est un mécanisme complexe et versatile, conservé au cours de l'évolution, qui repose sur l'action coordonnée d'acteurs protéiques dont les mutations conduisent à l'apparition de syndromes d'hyper-sensibilité aux UV. Ainsi, parallèlement à la régulation transcriptionnelle UV induite dépendante du facteur USF-1 (Upstream Stimulating Factor 1) des gènes clés de la pigmentation, nous avons étudié l'induction transcriptionnelle potentielle de gènes codant pour les acteurs du NER. Par une approche combinant expériences in-vivo (RT-QPCR et ChIP) et in-vitro (EMSA, luciférase essais), nous impliquons le facteur USF-1 dans l'induction transcriptionnelle de gènes codant deux acteurs des étapes de reconnaissance des lésions UV-induites par le NER. L'utilisation de souris invalidées pour le gène USF-1 confirme le modèle observé. L'ensemble de ces données obtenues au cours de ma thèse vient compléter la liste des gènes cibles du facteur de transcription USF-1 et élargit son réseau d'implication en réponse aux UV. Ces résultats suggèrent un rôle potentiel du facteur USF-1 dans le processus tumoral des cancers cutanés UV-induits.

La superoxyde réductase (SOR) est une enzyme de détoxification présente uniquement chez certain types de microorganismes. Elle élimine le radical superoxyde en le réduisant pour donner H2O2 sans formation d'O2 moléculaire. Le site actif de la SOR est constitué d'un centre mononucléaire de fer ferreux chélaté par 4 histidines en positions équatoriales et une cystéine en position axiale. La présence et le positionnement de cette cystéine au sein du site actif est tout à fait atypique et pourrait être à l'origine de cette réactivité particulière avec le superoxyde. Différentes structures de SOR ont montré l'existence de liaisons hydrogènes entre le soufre de cette cystéine et des NH de liaisons peptidiques de certains acides aminés dont l'isoleucine 118 sur laquelle nous avons centré notre travail. Quatre mutants de l'isoleucine 118 ont été construits et purifiés. Les caractérisations par spectroscopies UV-visible, FTIR, Résonance Raman, par la détermination du pKa et du potentiel redox du fer du site actif ont montré que les mutations sur cette position induisent un renforcement de la liaison S-Fe. Ceci a pu être associé à un affaiblissement de la liaison hydrogène entre le NH peptidique des mutants de l'isoleucine 118 et le soufre de la cystéine. Les études de cinétique rapide par radiolyse pulsée ont permis de montrer que les mutations facilitent la protonation des intermédiaires réactionnels de type Fe3+-peroxo et Fe3+-hydroxo. Ces résultats sont en accord avec l'augmentation de densité électronique autour du fer du site actif, qui induit une basicité plus importante de ces intermédiaires réactionnels. Ainsi, nous avons pu montrer que le renforcement de la liaison S-Fe a pour conséquence l'accélération de la réaction de la SOR avec le superoxyde. Le ligand axial cystéine a donc pour rôle de contrôler la densité électronique autour du fer du site actif et ainsi d'influer sur la réduction du superoxyde.

Bacillus cereus est un pathogène opportuniste à l'origine de deux types de toxi-infections alimentaires classées en syndrome émétique ou diarrhéique. Le syndrome diarrhéique résulte de la production d'entérotoxines (Hbl, Nhe et CytK) au niveau de l'intestin grêle de l'hôte, caractérisé par une atmosphère anaérobie et un faible potentiel d'oxydo-réduction (POR). La capacité de B. cereus à se développer et à produire des entérotoxines dans ces conditions est sous le contrôle de deux systèmes qui agissent, en partie, indépendamment du régulateur pléiotrope connu, PlcR (Phospholipase C Regulator). Il s'agit du système à deux composants ResDE et de la protéine Fnr (Fumarate Nitrate Reductase). Le but de cette étude a été de caractériser d'un point de vue fonctionnel l'implication du régulateur Fnr et du système ResDE dans la toxinogenèse de B. cereus. Les résultats ont montré que la régulation de la transcription de hbl et nhe était sous le contrôle direct et indirect de Fnr et de ResD. En aérobiose, la fixation de Fnr (forme Apo) sur les régions promotrices des gènes de structure des entérotoxines (pnhe et phbl) et des gènes de régulation (presDE, pfnr et pplcR) dépend des conditions redox. L'affinité de ResD pour pnhe, phbl, presDE, pfnr et pplcR dépend des séquences de ces régions promotrices et son affinité pour les régions promotrices presDE et pfnr dépend de son état de phosphorylation. ResD et ApoFnr sont capables de se fixer simultanément sur les régions promotrices étudiées et sont également capables d'interagir physiquement en l'absence d'ADN. Nous avons proposé un modèle de régulation de la toxinogenèse dans lequel ResDE et Fnr pourraient agir en synergie. Enfin des expériences de double hybride ont permis de mettre en évidence que la protéine PlcR pourrait interagir in vivo avec les régulateurs ResD et Fnr. La régulation de la toxinogenèse impliquerait donc la formation d'un complexe multi-moléculaire

The minimization of blood loss represents a significant clinical need in the arena of surgery, trauma, and emergency response medicine. Fibrinogen is our body's native polymer system activated in response to tissue and vasculature injury, and forms the foundation of the most widely employed surgical sealant and hemostatic agent. Non-covalent knob:hole interactions are central to the assembly of fibrin that leads to network and clot formation. This project exploits these affinity interactions as a strategy to direct fibrin polymerization dynamics and network structure so as to develop a temperature-triggered polymerizing fibrin mixture for surgical applications. Short peptides modeled after fibrin knob sequences have been shown to alter fibrin matrix structure by competing with native fibrin knobs for binding to the available holes on fibrinogen and fibrin. The fusion of such knob peptides to a non-native component should facilitate binding of the fused component to fibrinogen/fibrin, and may permit the concomitant modification of the fibrin matrix. We examined this hypothesis in a three-step approach involving (a) analyzing the ability of tetrapeptide knob sequences to confer fibrin(ogen) affinity on a non-fibrin protein, (b) investigating the effect of knob display architecture on fibrin(ogen) structure, and (c) designing a temperature-responsive knob-displaying construct to modulate fibrin(ogen) affinity at different temperature regimes, thus altering fibrin(ogen) structure.

L'objectif de ma thèse est d'étudier chez l'embryon de poisson zèbre le contrôle spatio-temporel de l'expression génétique induit par l'acide rétinoïque (RA). L'acide rétinoïque est un morphogène dérivé de la vitamine A qui est impliqué dans de nombreux processus lors du développement embryonnaire. Chez les vertébrés, cette molécule joue un rôle crucial dans la mise en place de l'axe antéro-postérieur et dorso-ventral ainsi que dans la segmentation du rhombocéphale (cerveau postérieur ou hindbrain) entre autre par la formation d'un gradient antéro-postérieur qui donne lieu à une expression différenciée des gènes Hox. Les isomères naturels de l'acide rétinoique tel que all-trans retinoic acid (ATRA), 9-cis RA et 13-cis RA font partie de la voie de signalisation de RA. Cette voie est médiée par 2 sous-types de récepteurs nucléaires: RAR et RXR agissent comme des facteurs de transcription. Les isomères de l'acide rétinoique possèdent des affinités différentes pour les 2 types de récepteur. Le 9-cis RA est capable de se lier avec RARs ou RXRs. Le ATRA est la forme pricipale de l'acide rétinoique dans l'organisme vivant, Il est le ligand des RAR. Le 13-cis RA est aussi capable de se lier avec RAR mais son affinité est très faible par rapport au ATRA. Grâce à cette faible affinité aux RAR, le 13-cis RA a été utilisé pour traiter l'acné et la leucémie afin de minimiser les effets tératogènesde ATRA. In vitro, Le 13-cis RA est capable de s' isomériser rapidement en ATRA apres illumination par UV. Cette isomérisation est aussi possible dans le sens inverse c'est-à-dire qu'on peut illuminer l'ATRA pour le transformer en 13-cis RA. Grâce à cette propriété chimique de l'acide rétinoique, J'ai pu développer une méthode qui permet d'activer ou d'inactiver l'acide rétïnoique par illumination aux UV avec une grande résolution spatio-temporelle dans un organisme vivant.

The polyphenol pathway and Maillard reaction (polycondensation of sugars and amino acids) are regarded as important pathways in natural humification. The significance of linking the Maillard reaction and polyphenol pathways into an integrated humification pathway has been addressed. However, the ability of mineral colloids commonly occurring in tropical and temperate environments to promote the Maillard reaction and integrated polyphenol-Maillard humification pathways remained to be uncovered. Furthermore, the effect of the nature and relative abundance of biomolecules on humification and associated reaction products remained to be studied.<p>The results of this study show that the structure of polyphenols and the relative molar ratio of polyphenol, glucose and glycine, significantly affected humification processes and the associated carbonate formation in the integrated polyphenol-Maillard reaction catalyzed by birnessite. Increasing the molar ratio of ortho-polyphenols (catechol and pyrogallol) to Maillard reagents in the polyphenol-Maillard pathway catalyzed by birnessite enhanced humification while suppressing the formation of rhodochrosite (MnCO3). The opposite trend of MnCO3 formation was observed in the meta-polyphenol (resorcinol)-Maillard reaction system. Increasing the amount of glucose in the integrated catechol-Maillard system under the catalysis of birnessite promoted the formation of Maillard reaction-type humic acid in the supernatant and MnCO3 in the solid phase.<p>The catalytic abilities of commonly occurring mineral colloids from temperate and tropical regions greatly differed in influencing humification processes and products in the Maillard reaction and integrated polyphenol-Maillard pathways. Compared with layer silicate colloids, the poorly ordered Fe and Mn oxides were by far the strongest catalysts of humification reactions in the Maillard and catechol-Maillard pathways. This accounted for the significant difference in reactivity between the sesquioxide-rich Oxisol clay from the high rainfall region of South Africa and the Mollisol clay from the Canadian Prairies. Furthermore, the nature of the mineral colloids also affected the extent of organic C accumulation in the solid phase upon humification, and related mineral surface alteration. The metal oxide- and Oxisol clay-catalyzed Maillard and catechol-Maillard reaction systems had the highest accumulation of organic C in the solid phase, indicating their significance in contributing to C sequestration in the environment.<p>The findings obtained in this study are of fundamental significance in understanding the influence of the atomic bonding, structural configuration and related surface properties of mineral colloids, and the nature and abundance of biomolecules on the abiotic humification pathways and related reaction products in natural environments.

The force-induced activation of adhesive proteins such as von Willebrand Factor (VWF), which experience high hydrodynamic forces, is essential in initiating platelet adhesion. The importance of the mechanical force induced functional change is manifested in the multimeric VWF’s crucial role in blood coagulation, when high fluid shear stress activates pVWF multimers to bind platelets. Here we showed that a pathological level of high shear flow exposure of pVWF multimers results in domain conformational changes, and the subsequent shifts in the unfolding force allow us to use force as a marker to track the dynamic states of multimeric VWF. We found that shear-activated pVWF multimers (spVWF) are more resistant to mechanical unfolding than non-sheared pVWF multimers, as indicated in the higher peak unfolding force. These results provide insight into the mechanism of shear-induced activation of pVWF multimers.

The polyphenol pathway and Maillard reaction (polycondensation of sugars and amino acids) are regarded as important pathways in natural humification. The significance of linking the Maillard reaction and polyphenol pathways into an integrated humification pathway has been addressed. However, the ability of mineral colloids commonly occurring in tropical and temperate environments to promote the Maillard reaction and integrated polyphenol-Maillard humification pathways remained to be uncovered. Furthermore, the effect of the nature and relative abundance of biomolecules on humification and associated reaction products remained to be studied.<p>The results of this study show that the structure of polyphenols and the relative molar ratio of polyphenol, glucose and glycine, significantly affected humification processes and the associated carbonate formation in the integrated polyphenol-Maillard reaction catalyzed by birnessite. Increasing the molar ratio of ortho-polyphenols (catechol and pyrogallol) to Maillard reagents in the polyphenol-Maillard pathway catalyzed by birnessite enhanced humification while suppressing the formation of rhodochrosite (MnCO3). The opposite trend of MnCO3 formation was observed in the meta-polyphenol (resorcinol)-Maillard reaction system. Increasing the amount of glucose in the integrated catechol-Maillard system under the catalysis of birnessite promoted the formation of Maillard reaction-type humic acid in the supernatant and MnCO3 in the solid phase.<p>The catalytic abilities of commonly occurring mineral colloids from temperate and tropical regions greatly differed in influencing humification processes and products in the Maillard reaction and integrated polyphenol-Maillard pathways. Compared with layer silicate colloids, the poorly ordered Fe and Mn oxides were by far the strongest catalysts of humification reactions in the Maillard and catechol-Maillard pathways. This accounted for the significant difference in reactivity between the sesquioxide-rich Oxisol clay from the high rainfall region of South Africa and the Mollisol clay from the Canadian Prairies. Furthermore, the nature of the mineral colloids also affected the extent of organic C accumulation in the solid phase upon humification, and related mineral surface alteration. The metal oxide- and Oxisol clay-catalyzed Maillard and catechol-Maillard reaction systems had the highest accumulation of organic C in the solid phase, indicating their significance in contributing to C sequestration in the environment.<p>The findings obtained in this study are of fundamental significance in understanding the influence of the atomic bonding, structural configuration and related surface properties of mineral colloids, and the nature and abundance of biomolecules on the abiotic humification pathways and related reaction products in natural environments.

The study of noncovalent interactions between aromatic rings and various functional groups is a very popular topic in current computational chemistry. The research presented in this thesis takes steps to bridge the gap between theoretical prototypes and real-world systems. The non-additive contributions to the interaction energy in stacked aromatic systems are measured by expanding the prototype benzene dimer into trimeric and tetrameric systems. We show that the three- and four-body interaction terms generally do not contribute significantly to the overall interaction energy, and that the two-body terms are essentially the same as in the isolated dimer. The sulfur-pi interaction is then studied by using the hydrogen sufide-benzene dimer as a prototype system for theoretical predictions. We obtain higly-accurate potential energy curves, as well as an interaction energy extrapolated to the complete basis set limit. Energy decomposition analysis using symmetry-adapted perturbation theory shows that the sulfur-pi interaction is primarily electrostatic in nature. These theoretical results are then compared to an analysis of real sulfur-pi contacts found by searching protein structures in the Brookhaven Protein DataBank. We find that the most frequently seen configuration does not correspond to the theoretically predicted equilibrium for sydrogen sulfide-benzene, but instead to a configuration that suggests an alkyl-pi interaction involving the carbon adjacent to the sulfur atom. We believe our findings indicate that environmental effects within proteins are altering the energetics of the sulfur-pi interaction so that other functional groups are preferred for interacting with the aromatic ring.