L'Organisation Mondiale de la Santé estime que le VIH-1 est porté par 40 millions de personnes à travers le monde, et qu'il a causé 3,1 millions de décès et 4,9 millions de nouvelles infections au cours de l'année 2004. Les traitements actuels ciblent principalement la rétrotranscriptase du VIH-1 (RT), qui catalyse le passage de l'ARN viral génomique en ADN double brin, substrat de l'intégrase virale (IN). Les antiviraux dirigés contre la RT et utilisés en thérapie sont soit des terminateurs de chaîne analogues de nucléosides (NRTIs), soit des inhibiteurs non-nucléosidiques (NNRTIs) qui se fixent au niveau d'une poche hydrophobe, à proximité du site de fixation des nucléotides. <br />Dans le cadre du développement de nouveaux inhibiteurs de la RT, nous nous sommes intéressés aux 3,7-dihydroxytropolones (3,7-DHT), qui inhibent l'inositol monophosphatase humaine par chélation de deux ions Mg2+ catalytiques distants de 3,7Å. Or les sites catalytiques polymérase et RNase H de la RT contiennent respectivement deux ions Mg2+ distants de 3,57 et 4Å. En outre, l'IN du VIH-1 possède une plate-forme catalytique proche de celle du site RNase H. Nous avons ainsi entrepris d'étudier l'effet des 3,7-DHT sur les activités de la RT et de l'IN du VIH-1. <br />Nous avons observé une inhibition spécifique de l'une ou l'autre activité de la RT par certaines 3,7-DHT. Des études enzymatiques ont ensuite montré que l'inhibition de l'activité ADN polymérase est non-compétitive vis-à-vis des nucléotides, à l'instar des NNRTIs. Néanmoins, l'étude de RT résistante ou dépourvue du site de fixation des NNRTIs permet d'exclure un mode d'action identique à cette classe d'inhibiteurs. Des expériences de gel-filtration, permettant de suivre l'état d'oligomérisation de la forme active de la RT, hétérodimérique, montrent que les 3,7-DHT ne sont pas capables de la dissocier. L'inhibition des activités de la RT par liaison des 3,7-DHT aux acides nucléiques a été écartée, entre autres, par des expériences de fluorescence. Enfin nous avons montré que les 3,7-DHT n'inhibent pas la polymérisation lors de l'étape de translocation. <br />En revanche, une forte baisse de l'inhibition de la synthèse d'ADN a été mise en évidence lorsque la concentration en Mg2+ diminue, ce qui suggère que les 3,7-DHT ne lient le site actif polymérase qu'en présence des ions Mg2+. L'implication des cations catalytiques dans les mécanismes d'inhibition par les 3,7-DHT a également été étayée par l'observation d'une inhibition des activités de « processing » et de transfert de l'IN, dépendante du cation utilisé.<br />Malheureusement, des cultures cellulaires en présence de 3,7-DHT ont révélé une cytotoxicité importante. Ce résultat était partiellement prévisible, compte tenu de l'existence de nombreuses enzymes bimétalliques cellulaires et de l'utilisation de 3,7-DHT de première génération. Dans l'objectif d'améliorer ces composés, sur la base de leur relation structure/activité, nous avions également pour projet d'obtenir la structure cristallographique d'un complexe ternaire RT/(matrice/amorce)/dNTP, en présence d'une 3,7-DHT. Des cristaux de différents complexes ont été obtenus, mais n'ont pas permis d'obtenir de clichés de diffraction aux rayons X et restent par conséquent à améliorer. <br />Nous avons également étudié l'influence de la concentration en Mg2+ libre sur les activités catalytiques de la RT du VIH-1.<br />En résumé, les résultats obtenus au cours de mon travail de thèse permettent d'élaborer les prémices d'une stratégie de conception « rationalisée » d'inhibiteurs de la RT et de l'IN, dans l'objectif d'obtenir des composés plus spécifiques et plus affins de l'un ou l'autre site catalytique.

La réparation de l'ADN est un processus cellulaire très important comme le montre son implication dans de nombreuses maladies génétiques et la carcinogenèse. Les mécanismes des différents systèmes de réparation présentent des interactions et des complémentarités. Les tests fonctionnels utilisés jusqu'alors pour étudier les activités de réparation ne prennent pas en compte toute cette complexité.<br />Nous avons développé un test in vitro offrant une mesure parallélisée, fonctionnelle et spécifique d'activités enzymatiques de réparation de l'ADN. Pour ce faire, nous avons adapté un test d'excision resynthèse au format biopuce.<br />Nous avons mis au point les différentes étapes du test : la fabrication de la biopuce, la normalisation et l'analyse des données, les conditions de réactions biologiques. Nous avons ensuite validé le test en démontrant que nous mesurions des activités enzymatiques de réparation. Enfin deux expériences applicatives de ce test ont été réalisées. Nous avons tout d'abord mis en évidence la similitude des profils de réparation de trois souches de fibroblastes humains issus de cultures primaires, mais aussi les différences des capacités de réparation qu'il existe entre les fibroblastes, kératinocytes, et cellules mononuclées du sang périphérique. Par la suite, nous avons démontré que la réparation de l'ADN est impliquée dans la réponse adaptative des cellules au rayonnement ionisant. <br />Les applications futures de ce test sont importantes, tant en recherche fondamentale qu'appliquée pour le criblage de molécules, ou encore dans le domaine diagnostic.

LES RIBONUCLEOTIDES REDUCTASES (RNRS) SONT DES ENZYMES UBIQUITAIRES ESSENTIELLES POUR LA SYNTHESE D'ADN. LA CROISSANCE EN ANAEROBIOSE D'ESCHERICHIA COLI DEPEND D'UNE RNR DE CLASSE III. L'ENZYME ACTIVEE CONTIENT UN RADICAL SENSIBLE A L'OXYGENE SITUE SUR LE RESIDU G681 DONT LA FORMATION IMPLIQUE L'INTERVENTION CONCERTEE D'UNE PROTEINE ACTIVATRICE FER-SOUFRE, DE S-ADENOSYLMETHIONINE, DE DITHIOTHREITOL (DTT), ET D'UN SYSTEME REDUCTEUR. LA STRUCTURE CRISTALLOGRAPHIQUE DE LA RNR DU BACTERIOPHAGE T4 A REVELE LA PRESENCE D'UN SITE METALLIQUE ZN(CYS)4 DANS LA PARTIE C-TERMINALE DE LA REDUCTASE. DANS CE TRAVAIL NOUS AVONS DEFINI DE NOUVELLES CONDITIONS DE PURIFICATION CONDUISANT A DES ENZYMES TRES ACTIVES, MONTRE QUE LE ZINC CONTROLE LA STRUCTURATION DE LA BOUCLE CTER CONTENANT LE SITE RADICALAIRE ET QUE, CONTRAIREMENT A CE QUI ETAIT ADMIS DEPUIS PLUS DE 15 ANS, LE DTT N'INTERVIENT PAS DANS LA FORMATION DU RADICAL GLY· MAIS PLUTOT DANS LES TRANSFERTS RADICALAIRES ENTRE GLY· ET LE SUBSTRAT.

Streptococcus pneumoniae, pathogène majeur de la sphère oro-pharyngée, résiste fréquemment aux antibiotiques de la famille des ?-lactamines généralement administrés dans les infections associées à ce pathogène. Les cibles de ces antibiotiques sont des enzymes responsables de la biosynthèse du peptidoglycane bactérien, les Penicillin-Binding Proteins (PBP) dont la structure du site actif est modifiée dans le cas de souches résistantes aux antibiotiques. Dans un premier temps, la résolution de la structure à haute résolution par cristallographie des rayons X de PBP1b, une des trois PBP bifonctionnelles du pneumocoque, a mis en évidence un phénomène de réorganisation structurale du site actif de la molécule en fonction de son interaction avec un pseudo-substrat de la réaction. Ce résultat nous a permis de proposer que l'ouverture du site actif joue un rôle clef lors du processus de division cellulaire. Dans un deuxième temps, nous avons résolu les structures de complexes entre PBP1b et de nouvelles molécules inhibitrices, ce qui permet d'ouvrir la voie de la mise au point rationnelle de nouveaux médicaments. Pour finir, nous avons caractérisé le domaine glycosyltransférase de PBP1b ,qui représente une nouvelle cible moléculaire pour le développement de nouveaux antibactériens, notamment par diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS). Cette approche originale nous a permis de proposer un modèle d'organisation et de repliement de ce domaine au sein de ces protéines.

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2001. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains xiii, 165 p. : ill. (some col.). Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 157-165).

Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η μελέτη των μη θερμικών αποτελεσμάτων της ηλεκτρομαγνητικής (ΗΜ) ακτινοβολίας στη δομή των βιομορίων χρησιμοποιώντας προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής με το πακέτο λογισμικού GROMACS. Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών παρουσιάζονται στα κεφάλαια 2,3,4 και όλα αντιστοιχούν σε δημοσιεύσεις σε περιοδικά με κριτές με το τελευταίο να έχει γίνει μόλις πρόσφατα δεκτό στο Electromagnetic Biology and Medicine. Το κεφάλαιο 1 αποτελεί μια μικρή εισαγωγή στις αλληλεπιδράσεις ΗΜ πεδίων και έμβιας ύλης. Τα Κεφάλαια 2,3 αφορούν ένα συνθετικό πεπτίδιο, την chignolin, που αντιπροσωπεύει ένα μικρό μοντέλο πρωτεΐνης που οφείλει την σταθερότητα της δομής του στου δεσμούς υδρογόνου. Εξαρχής οι δεσμοί υδρογόνου αποτέλεσαν πιθανούς στόχους των ΗΜ αλληλεπιδράσεων στα βιομόρια λόγω της μικρής τους ισχύος αφού από τη φύση τους κατατάσσονται στις αλληλεπιδράσεις μακράς εμβέλειας. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι δομικές αλλαγές που σχετίζονται με διάσπαση αυτών των δεσμών απαιτούν τρομακτικά ισχυρά πεδία της τάξης των 1V/nm που δεν απαντώνται στην καθημερινότητα. Αντίθετα το Κεφάλαιο 4 ασχολείται (για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία των MD προσομοιώσεων σε βιομόρια), με τις αλληλεπιδράσεις πιο ρεαλιστικών ηλεκτρικών πεδίων της τάξης των 1000V/m με το σύστημα ιοντικό διάλυμα–βιομόριο και βασίζεται στην υπόθεση ότι τα ηλεκτρικά πεδία επηρεάζουν εύκολα τα ευκίνητα ιόντα και αυτά με τη σειρά τους την δομή των πρωτεϊνών. Ως βιομόριο επελέχθη η τριαλανίνη κυρίως λόγω των προυπαρχουσών μελετών της δομής της. Αναπάντεχα βρέθηκαν ισχυρές δομικές αλλαγές παρουσία του ηλεκτρικού πεδίου στην περίπτωση του υπερκορεσμένου διαλύματος NaF μεταξύ των κρυστάλλων NaF και του πεπτιδίου. Το εύρημα αυτό ήδη προσανατολίζει την πορεία των επόμενων μελετών μιας και πολλές παθολογίες όπως η ποδάγρα σχετίζονται με το σχηματισμό κρυσταλλικών δομών στο ανθρώπινο σώμα. / This study focuses on the non-thermal effects of electromagnetic (EM) radiation on the structure of biomolecules using molecular dynamics simulations with the software package GROMACS. Simulation results are presented in Chapters 2,3,4 and they have already been published in refereed journals with the last one recently accepted in “Electromagnetic Biology and Medicine”. Chapter 1 is a brief introduction of EM interaction with living matter. Chapters 2,3 are about chignolin, a synthetic peptide resembling a small model stable protein due to its hydrogen bonds. Initially, long-range interactions such as hydrogen bonds were potential targets of EM interactions in biomolecules. The results suggest that conformational changes associated with these destructions require tremendously strong fields of the order of 1V/nm not encountered in daily life. On the contrary, Chapter 4 deals (for the first time in the literature of MD simulations with biomolecules), with more realistic electric fields around 1000 V/m in the system biomolecule-ionic solution. The hypothesis tested was that electric fields easily affect flexible ions and then these ions induce structural changes to the proteins. To this end, trialanini was chosen a a model biomolecule, primarily due to the extensive prior knowledge of its structure. Surprisingly, strong structural changes in the presence of an external electric field were found in the case of supersaturated NaF solution between the NaF crystals and the peptide. These findings orient the course of subsequent studies because it is well known that many pathologies such as gout are associated with the formation of crystalline structures in the human body.

Diamond is a promising material with unique chemical properties. In this thesis, nano-scale diamond quantum size effects were investigated using several chemical property indicators. The results show that the chemical properties are strongly dependent on size for film thicknesses smaller than 1 nm (1D), and for nanodiamond particle diameters less than 2 nm (3D). When the sizes exceed these ranges there are no longer any quantum effects. The influence of surface termination coverage on the surface chemical properties has been calculated for the 2×1 reconstructed diamond (100) surface and for the diamond (111) surface. The terminating species included COOH and NH2 groups, which both are beneficial for the immobilization of biomolecules. The results of the calculations show that it is energetically possible to terminate the diamond surfaces up to 100% with NH2, while it is only possible to cover the surfaces up to 50% with COOH species. The reason for the latter result is most probably the larger sterical hindrance amongst the adsorbates. Both types of termination species were shown to influence the diamond surface electronic properties (e.g., HOMO/LUMO levels). In order to extend the diamond utility for biomedical applications, especially implant design, interactions of various growth factors with the diamond surfaces were also simulated. For non-solvent diamond-biomolecule systems, the results show that adhesion affinities are strongly dependent on biomolecule molecular weights. When including a water based solvent in the systems, the results show good physisorption affinities between proteins and diamond. Proteins structures, before and after physisorption, were visualized, and further investigated with respect to electrostatic properties and functional groups. By comparing the biomolecular structural changes during the adhesion processes, it can be concluded that both the general structures, as well as the binding pocket structures, were kept intact after the adhesion to the diamond surfaces (regardless of the adhesion affinities). In addition, the surface electronic potential distributions were maintained, which indicate preserved biomolecule functionalities. / Vascubone

The research detailed in this dissertation is focused on the use of biomolecules (i.e., peptides and proteins) to form non-biologically produced materials under mild reaction conditions (i.e, neutral pH, aqueous solutions, and room temperature). The peptides utilized in the studies detailed in this dissertation were identified through the screening of single crystal rutile TiO2 substrates or Ge powder with a phage-displayed peptide library. Twenty-one peptides were identified which possessed an affinity for Ge. Those peptides possessing a basic isoelectric point as well as hydroxyl- and imidazole-containing amino acid residues were found to be the most effective in precipitating amorphous germania from an alkoxide precursor. The phage-displayed peptide library screening of TiO2 substrates yielded twenty peptides. The titania formation activity of these peptides was found to correlate with the number of positive charges they carried. The titania materials generated by the library-identified and designed peptides were found to be composed of amorphous titania as well as <10 nm anatase and/or monoclinic TiO2 crystallites. Four recombinant proteins, derived from the amino acid sequences of proteins (silaffins) associated with biosilicification in diatoms, were also investigated for titania precipitation activity. The two most basic of these recombinant silaffins, rSil1L and rSilC, were able to induce the formation of titania. The titania precipitates generated by rSil1L were found to be similar to those produced by the phage-displayed library identified peptides. The second recombinant silaffin, rSilC, was found to produce hollow spheres of titania, which, following dehydration, were observed to transform into larger, solid spheres composed of radially aligned columns of rutile TiO2. The highly repetitive nature of the rSilC s amino acid sequence is believed to be responsible for the differences in TiO2 polymorph generated by the different recombinant silaffins and peptides. This dissertation also details research conducted on the formation of titania utilizing rSilC conjugated to synthetic and biogenic silica surfaces. These silica surfaces were functionalized with a newly developed drendritic growth technique. The dendritic functional-group amplification process was demonstrated to increase the loading of hexahisitidine tagged proteins on silica surfaces by more than 40%, as compared to traditional immobilization procedures.

The synthesis and biological sensing applications of novel water soluble poly(para-phenyleneethynylene)s (PPEs) are presented. The ease of synthesis, synthetic variability, and dramatic chromicity of PPEs makes them well suited for biological and sensing applications. Molecular recognition and signal transduction can be achieved by using PPEs as sensory materials. By incorporating biological functional groups (e.g. sugars), PPEs can efficiently detect the presence of toxic heavy metals, proteins, and bacteria through either fluorescence quenching or enhancement. Rapid, precise, and convenient sensory arrays for the detection of biological analytes are possible through the formation of gold nanoparticle-PPE constructs.

The thesis topic entitled above involves the use of small molecules as a general means to drive nucleic acid assembly and structural transitions. We have shown that coralyne, a crescent-shaped small molecule, can assemble homo-adenine DNA and RNA sequences into anti-parallel duplexes at neutral pH, a structure containing putative purine-purine (A*A) base pairs that is otherwise unstable. The importance of the structure of the small molecule in the recognition and stabilization of A*A base pairing has been established by experimental evidence. We further provide structural evidence for the putative A*A base pairing that is stabilized by coralyne and molecules of similar size and shape. Our hypothesis that planar molecules that are slightly too large to intercalate Watson-Crick base pairs might intercalate the larger purine-purine base pairs has led to the design of a new class of small molecules that tightly bind purine-purine duplexes with excellent selectively. We have demonstrated that azacyanines can exhibit strong and selective association with a human telomeric sequence that forms a unimolecular G-quadruplex in solution. The synthetic accessibility of azacyanines makes this class of molecules amenable to library preparation for high-throughput screening. Together, the findings reported in this thesis provide further evidence for the robust and versatile nature of selective small molecule recognition of nucleic acids, especially purine-purine duplexes.