A biodisponibilidade é o fator determinante da eficácia clínica de um fármaco e depende diretamente das propriedades de solubilidade e permeabilidade da substância ativa. O Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB), baseado nestas características, consolidou-se nos últimos anos como ferramenta de auxílio na predição da biodisponibilidade de fármacos. O SCB tem sido empregado no desenvolvimento de formas farmacêuticas, contendo novos fármacos ou não, e no registro de medicamentos genéricos, por conta das limitações técnicas, econômicas e éticas para a realização dos ensaios diretos de biodisponibilidade. Assim, a avaliação das propriedades de solubilidade e permeabilidade dos fármacos, embora indiretamente, oferece objetivas indicações sobre a eficácia dos medicamentos, com vantagem de consolidar modelos in vitro, mais facilmente reprodutíveis, sem trazer riscos a voluntários sadios. Dentre os estudos de solubilidade destaca-se o método do equilíbrio que emprega a técnica de shake-flask. Para a determinação da permeabilidade in vitro, diferentes técnicas têm sido empregadas, dentre as quais destacam-se modelos que empregam tecido intestinal de animais. O presente trabalho teve como objetivos a avaliação da solubilidade e da permeabilidade de fármacos antirretrovirais (lamivudina e zidovudina) e o desenvolvimento de protocolo para determinação da permeabilidade em segmentos de intestino de ratos, por meio de modelo in vitro em ensaios com células de Franz. A solubilidade dos fármacos propostos foi caracterizada pela técnica shake-flask e por meio da dissolução intrínseca, sendo que os resultados permitiram concluir que, segundo o SCB, os fármacos zidovudina e lamivudina apresentam alta solubilidade. Os ensaios de permeabilidade demonstram que o método proposto é viável e os valores de permeabilidade da lamivudina e da zidovudina sugerem que ambos os fármacos podem ser classificados como de alta permeabilidade. / Bioavailability is the determinant of the clinical efficacy of a drug and is directly dependent on the properties of solubility and permeability of the active substance. The Biopharmaceutical Classification System (BCS), based on these characteristics, has become in recent years as a tool to aid in predicting the bioavailability of drugs. The BCS has been used in the development of dosage forms, containing new drugs or not, and the registration of generic drugs, since there are technical limitations, economic and ethical guidelines for the testing of direct bioavailability. Thus, the evaluation of the solubility and permeability of the drugs, although indirectly, provides objective indications on the effectiveness of medicines, with the advantages of consolidating in vitro models more easily reproducible without bringing risk to healthy volunteers. Among the solubility studies highlight the shake-flask method, recommended by regulatory agencies. To determine the in vitro permeability, different techniques have been employed, among which stand out models based on intestinal tissue obtained from different animals. This study aims to evaluate the solubility and permeability of antiretroviral drugs (lamivudine and zidovudine), and the development of protocol for the determination of permeability in intestine segments of rats using in vitro model in experimental Franz cells. So far, the solubility of proposed drugs was characterized by shake-flask method and through the intrinsic dissolution. About the solubility, results showed that, according to BCS, the drugs zidovudine and lamivudine has high solubility. About the intrinsic dissolution, results showed agreement with the results of the solubility. Permeability tests showed that the proposed method is feasible and the permeability values of lamivudine and zidovudine suggest that both drugs can be classified as high permeability.

A cefalexina é um antibiótico semi-sintético, derivado das cefalosporinas, que exibe amplo espectro de ação, sendo largamente empregado por via oral. No Brasil é comercializado na forma de comprimido revestido, por cinco laboratórios farmacêuticos diferentes. No presente estudo foram avaliados, do ponto de vista biofarmacotécnico, 2 especialidades farmacêuticas (A e B), sob a forma de comprimidos revestidos, contendo 500 mg de cefalexina, disponíveis no mercado nacional. A análise in vitro foi realizada para dois lotes (1 e 2) de cada produto (A e B), através de ensaios físicos e físico-químicos (peso médio, dureza, umidade, teor de cefalexina, teste e perfil de dissolução), com a finalidade de verificar sua conformidade com especificações estabelecidas pelos compêndios oficiais. Estudos de cinética de dissolução foram empregados para avaliação mais precisa quanto às características biofarmacotécnicas in vitro das respectivas formulações. Os estudos de bioequivalência entre os produtos A e B (lote 2) empregaram delineamento experimental cruzado aleatório, em dois períodos, utilizando-se 24 voluntários. Os parâmetros farmacocinéticos empregados nesta avaliação foram obtidos a partir de dados de excreção urinária da cefalexina, sendo sua concentração na urina determinada por cromatografia líquida de alta eficiência, através de metodologia desenvolvida e validada no presente estudo. A bioequivalência entre os produtos foi determinada a partir da análise estatística (ANOVA) dos seguintes dados: quantidade de cefalexina acumulada excretada na urina (Du acumulado); quantidade total de cefalexina excretada na urina no tempo infinito (Du∞); velocidade máxima de excreção urinária ([Ddu/dt]max). Os resultados das análises físicas e físico-químicas indicaram que ambos os produtos estudados apresentaram-se dentro das especificações farmacopéicas. Na avaliação da bioequivalência entre os mesmos, obtiveram-se intervalos de confiança dentro dos limites estabelecidos internacionalmente (80 a 125%), para todos os parâmetros avaliados, comprovando, desta forma, que os produtos A e B são bioequivalentes e, portanto, intercambiáveis. / Cephalexin is a semi-synthetic cephalosporin-derived antibiotic which has an extensive action spectrum, widely used by oral administration. In Brazil, where it is largely marketed, in a tablet coated way, five differents brands can be found. The goal of this study was to evaluate from the biopharmaceutic point of view two cephalexin 500 mg tablet brands (A and B) availables in brazilian market. In order to check its accordance with official pharmacopeial specifications, two lots (1 and 2) of each brand (A and B) were analysed in vitro through physical and physical-chemical assays in vitro tests (average weight, hardness, wet, cephalexin content, dissolution test). Both formulations were also submitted to dissolution kinetics studies to reach an accurate evaluation of their in vitro biopharmaceutics features. The bioequivalence studies between A and B brands (Iot 2) was based on an open randomized two period cross over design with twenty-four male and female healthy volunteers. Pharmacokinetics parameters used in this evaluation were obtained from cephalexin urinary excretion data; to assess urine cephalexin concentrations a high performance liquid chromatographic assay developed and validated in this study was used. Bioequivalence was confirmed using a multiway ANOVA and when the 90 % confidence interval for accumulated cephalexin amount excreted in urine (Du accumulated); total amount of cephalexín excreted in urine (Du∞ ) and maximum rate of urinary excretion ([dDu/dt]max), fell within the interval 80-125 %.No discrepancies between both cephalexin brands in physical-chemycal tests were found. Confidence intervals for pharmacokinetics parameters were inside the bioequivalence limits according with the international atandars (80-125%), demonstrating that A and B formulations can be considered bioequivalent and therefore interchangeable.

O cetoconazol (CTZ) é um antifúngico imidazólico de amplo espectro, administrado tipicamente pela via oral (200 ou 400 mg por dia) ou topicamente (creme 2% aplicado duas vezes ao dia). A efícácia da terapia tópica depende das características de liberação do fármaco, do veículo e da farmacocinética da substância ativa no tecido cutâneo, ou seja, de como ela se difunde através da pele. No presente trabalho, duas formulações comerciais (A e B), uma manipulada (C) e três desenvolvidas (D2:0; El: 1 e FO:2) contendo CTZ na concentração de 20 mg/g, foram estudadas quanto às características físico-químicas e quanto ao comportamento biofarmacêutico/bioequivalente tópico, através de medidas adequadas do ativo na camada do estrato córneo (EC). Uma metodologia in vivo denominada tape-stripping ou \'remoção do estrato córneo\' por fitas adesivas foi utilizada para medir a velocidade e extensão da penetração do CTZ no EC do antebraço de voluntários sadios. Um sistema bicompartimental de difusão vertical com membrana sintética (acetato de celulose) e membrana natural (pele suína) foi empregado para avaliar in vitro a taxa de liberação e a avaliação da penetração e eventual permeação do fármaco, respectivamente. Todas as amostras foram analisadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), com método previamente validado. Nos estudos in vivo, as quantidades de fármaco determinadas no EC (µg/mg) para cada tempo da aplicação foram analisadas estatisticamente empregando-se análise da variância (ANOVA) considerando dois fatores: Fator 1 = tratamento com dois níveis e Fator 2 = antebraços (esquerdo e direito). Dentre os produtos avaliados somente entre A e C houve diferença estatisticamente significativa (p < 0,05). Os ensaios de liberação, através da avaliação do fluxo de fármaco para o meio aceptor, evidenciaram agrupamento das formulações em duas categorias distintas entre si com fluxo entre 2,41, 2,16 e 2,49 µg/cm2/h compreendendo A, B e F0:2 (p = 0,171) e outra com fluxo entre 5,85, 6,28 e 7,21µg/cm2/h para C, D2:0 e E1:1 (p = 0,478) pela ANOVA com α = 0,05. A quantidade de CTZ nos estratos cutâneos da pele suína diminuiu com a profundidade, ou seja, na derme foi detectado menor quantidade de fármaco após aplicação das formulações A, B e F0:2 e não foi detectado sua presença na solução receptora. As formulações A, B e F0:2 não apresentaram um perfil de penetração cutânea na epiderme e na estatisticamente diferente ao nível de 5% (p =0,609 e p = 0,269, respectivamente). A bioequivalência foi avaliada empregando os dados obtidos nos estudos in vivo, de acordo com os critérios das razões (ASC0-240min) entre os produtos B, C e F0:2 em relação a A (considerado referência) com intervalo de confiança de 90% (IC 90%). Considerat1do o limite de 80-125%, as formulações não seriam bioequivalentes, pois existe uma grande diferença entre os produtos A e B, entre A e C, já A e F apresentam intervalo mais próximo do limite citado. Com base nesses resultados, a formulação do produto F poderia ser indicada a um possível desenvolvimento de genérico do produto A. / Ketoconazole (KTZ) is an imidazolic antifungal, of broad-spectrum, typically administered orally (200 or 400 mg per day) or topical1y (2% cream, applied twice daily). The efficacy of the topical therapy depend on the characteristics of the drug\'s release, of the vehicle and of the active substance\'s pharmacokinetic in the cutaneous tissue, in other words, on how this substance diffuses through the skin. On this paper, two commercial formulations (A and B), one manipulated (C) and three developed (D2:0; E1: 1 and F0:2) containing KTZ on the concentration of 20 mg/g, were studied in relation to the physical-chemical characteristics and to the bioavailability/bioequivalence topic behave by an adequate active layer\'s measurement of the stratum corneum (SC). The methodology in vivo called as tape stripping or \'stratum corneum remotion\' by adhesive tapes was proposed to measure the rate and KTZ penetration\'s extension in the SC of healthy volunteers\' forearm. A bicompartmental system of vertical diffusion with sintetic membrane (celullose acetate) and natural membrane (porcine skin) was used to evaluate in vitro the rate of release and the penetration evaluation and eventual drug permeation, respectively. All samples were then submitted to HPLC analysis by previously validated method. In the studies in vivo the amount of drug determined in the SC (µ/mg) for each application time was analyzed using variance\'s analysis (ANOVA) considering two factors: Factor 1 = treatment with two leveis and Factor 2 =forearm (left and right). Among the products evaluated there was only between A and C a statistical1y significant difference (p < 0,05). The assays of release, through the evaluation of the drug flow to the receptor chamber, evidenced the grouping of formulations in two categories, different among themselves, with flow among 2,41; 2,16 and 2,49 µg/cm2/h comprehending A, B and F(0:2) (p = 1,171) and other with flow among 5,85; 6,28 and 7,21µg/cm2/h and to C, D2:0 and E1:1 (p = 0,478) by ANOVA with a = 0,05. The amount of KTZ in the cutaneous stratum of porcine skin decreased with the depth, in other words, a lower value for drug was detected in the dermis after formulations\' application A, B and F0:2 and its presence was not detected in the receptor solution. Formulations A, B and F0:2 did not present a cutaneous penetration\'s profile, in the epidermis and dermis, statisticalIy different by level of 5% (p = 0,6097 e p = 0,269, respectively). Bioequivalence was evaluated using datas obtained from studies in vivo, according to criterias of reason_(ASC0-240min>) among the products B, C and F in relation to A (considered as reference) with interval of confidence of 90% (IC 90%). Considering the 80-125% limit, the formulations would not be bioequivalents, because there is a big difference among products A and B, A and C; now A and F present the nearest interval to thc quoted limito Basing on these results, the formulation of the product F could be indicated a possible generic development of product A.

A L-Asparaginase (L-ASNase) é uma enzima tetramérica bacteriana, utilizada em sessões de quimioterapia. Essa enzima depleta os aminoácidos asparagina (Asn) e glutamina (Gln), transformando-os em aspartato (Asp) ou glutamato (Glu), respectivamente, e em amônia. Contudo, a L-ASNase pode induzir resposta imune, levando à produção de anticorpos antiasparaginase, uma causa importante de resistência ao medicamento. Uma L-ASNase ideal seria aquela com alta atividade e estabilidade e baixo potencial imunogênico, porém, as L-ASNases utilizadas na terapêutica não reúnem essas características simultaneamente. Por essa razão, o presente trabalho utilizou técnicas de mutagênese randômica, a fim de criar uma nova proteoforma de L-ASNase de E. chrysanthemi com uma melhor atividade e estabilidade. Além disso, foram estudadas condições de cultivo em agitador metabólico, visando à otimização de condições de produção. Foi criada uma biblioteca com 1.056 clones, e desses, 19 foram selecionados por apresentarem atividade superior ou igual à enzima selvagem quando dosada em extrato bruto. Dentre eles, dois mutantes se destacaram por apresentarem a atividade específica glutaminásica diferente da enzima selvagem. Análises in silico indicam que o mutante 9-6D apresentou diminuição de desordem estrutural e epítopos imunogênicos. O mutante 9-5F demonstrou uma diminuição da porcentagem da atividade glutaminásica quando comparada a enzima selvagem. O estudo de produção do mutante 9-5F indicou que a temperatura de indução, seguida da concentração do indutor, são os parâmetros mais relevantes para a otimização da produção de L-ASNase de E. chrysanthemi mutante. / L-Asparaginase (L-ASNase) is a bacterial tetrameric enzyme used in chemotherapy sessions that deplete asparagine (Asn) and glutamine (Gln), transforming them into Aspartate (Asp) or glutamate (Glu), respectively, and ammonia. However, L-ASNase can induce immune response leading to the production of anti-asparaginase antibody, an important cause of drug resistance. Ideally, L-ASNase would be one with high activity, high stability and low immunogenic potential, but the L-ASNases commercially available today do not present these characteristics simultaneously. For this reason, this study used techniques of random and site-directed mutagenesis in order to create a new proteoform of E. chrysanthemi L-ASNase with improved activity and stability. In addition, culture conditions were studied in a metabolic shaker, aiming at the optimization of production conditions. A library with 1,056 clones was created, and of these clones, 19 were selected because they had activity superior or equal to the wild-type enzyme in crude protein extract. Among them, 2 mutants stood out for having different glutaminase specific activity in relation to wild-type enzyme. The 9-6D mutant also showed decreased structural disorder and immunogenic epitopes. The 9-5F mutant demonstrated a decrease in percentage of glutaminase activity when compared to the wild-type enzyme. The production study of 9-5F mutant indicated that the induction temperature followed by the inductor concentration are the most relevant parameters for the production optimization of E. chrysanthemi mutant L-ASNase.

O objetivo desta tese foi explorar o sistema de produção de proteínas heterólogas em microalga com ênfase em Chlamydomonas reinhardtii por meio de: (1) desenvolvimento de um fotobiorreator tubular fechado de escala laboratorial, utilizando técnicas de manufatura digital; (2) avaliação de 7 diferentes proteínas fluorescentes (mTagBFP, Cerulean, Emerald, crGFP, cOFP, tdTomato e mCherry), como sistema reporter de secreção de proteínas em microalga; (3) avaliação do fotobiorreator desenvolvido utilizando cultivo de cepas recombinantes; (4) desenvolvimento de novos peptídeos sinais para secreção de proteínas em C. reinhardtii; (5) avaliação da produção de um biofármaco (hialuronidase) em microalgas, por meio da expressão de duas isoenzimas codificadas pelos genes HYA1 e SPAM1 em C. reinhardtii. O fotobiorreator tubular foi avaliado quanto a sua capacidade de resistir ao processo de esterilização por autoclavação e seu desempenho por meio do cultivo de cepa recombinante secretando mCherry. A fluorescência das proteínas fluorescentes foi medida por leitor de placas de fluorescência e visualizada intracelularmente por microscopia confocal de fluorescência. A atividade de hialuronidase foi determinada através de um ensaio enzimático turbidimétrico. O desenvolvimento do fotobiorreator resultou em um sistema fechado resistente a autoclavação, com capacidade de cultivo de cepas recombinantes de C. reinhardtii. Esse fotobiorreator proporcionou uma produtividade máxima de 10 mg/L.d de mCherry da cepa recombinante em sistema fechado, com velocidade específica de crescimento máxima de 1,27 d-1 para a cepa recombinante testada. Todas as proteínas fluorescentes avaliadas apresentaram capacidade de secreção por C. reinhardtii, com diferentes níveis de interferências em sua medição, permitindo a escolha da mCherry como proteína reporter. Entre os peptídeos sinais avaliados (quatro descritos na literatura - BiP, ARS1, CAH1 e IBP1 - e seis preditos), o peptídeo predito \"SP5\" foi o que apresentou maior capacidade de secreção, determinado por níveis de fluorescência no sobrenadante. A avaliação dos peptídeos sinais constatou a necessidade de explorar o desenvolvimento de sistemas de expressão (e.g. vetores de expressão) aliados a análises computacionais, como o SignalP 4.0. Por último, os dados desse estudo mostram que C. reinhardtii transformadas com o vetor de expressão foi capaz de produzir as duas isoformas de hialuronidase em sua forma ativa, evidenciando a capacidade desse sistema para a produção de biofármacos. Portanto, nesta tese o sistema de expressão de proteínas heterólogas baseado em microalgas foi explorado, atingindo os objetivos propostos. O fotobiorreator desenvolvido tem a capacidade de esterilização em escala laboratorial (1) e em cultivo com cepa recombinante propiciou elevada produtividade (3). As proteínas vermelhas fluorescentes apresentaram-se como as proteínas com menores interferências para estudos de secreção em C. reinhardtii (2). Além disso, o peptídeo predito SP5 apresentou o melhor desempenho na secreção de proteínas (4) e o vetor de expressão empregado permitiu a identificação de cepas produtoras de biofármaco hialuronidase (5). Portanto, o sistema de produção de proteínas heterólogas por microalgas é um sistema promissor e poderá permitir, utilizando sistemas de secreção, obter proteínas de alto valor comercial a baixos custos, empregando a secreção e técnicas de cultivo como a fermentação extrativa. / In this thesis, the heterologous protein production in microalgae with emphasis on Chlamydomonas reinhardtii was explored through: (1) development of a laboratory scale closed tubular photobioreactor using digital manufacturing techniques; (2) evaluation of different fluorescent proteins (mTagBFP, Cerulean, Emerald, crGFP, cOFP, tdTomato and mCherry) as a reporter system for protein secretion in microalgae (3) evaluation of photobioreactor developed using recombinant strains culture; (4) development of new signals peptides for protein secretion in C. reinhardtii (5) expression evaluation of a biopharmaceutical (Hyaluronidase) in microalgae, through the expression of two isoenzymes encoded by the HYA1 and SPAM1 genes in C. reinhardtii. The tubular photobioreactor was evaluated for its ability to resist sterilization process by autoclaving and its performance by culturing recombinant strain secreting mCherry. Fluorescence of fluorescent proteins was measured by fluorescence plate reader and observed intracellularly by confocal fluorescence microscopy. The hyaluronidase activity was determined by a turbidimetric enzymatic assay. The development of the photobioreactor resulted in a closed system resistant to autoclaving, capable of culturing recombinant strains of C. reinhardtii. This recombinant strain achieved a maximum productivity of 10 mg/L.day of mcherry in the closed system, with a maximum growth rate of 1.27 d-1 for the recombinant strain tested. All the fluorescent proteins evaluated had C. reinhardtii secretion capacity, with different interference levels in their measurement, allowing the selection of mCherry as a reporter protein. Among the evaluated peptides (four described in the literature - BiP, ARS1, CAH1 and IBP1 - and six predicted), the predicted peptide \"SP5\" was the one that presented greater capacity of secretion, determined by levels of fluorescence in the supernatant. The results of this study point out the need to explore the development of biological systems (i.e., expression vectors) allied to computational analysis. Finally, the data from this study showed that C. reinhardtii could produce the two isoforms of hyaluronidase in its active form, evidencing the capacity of this system to produce biopharmaceuticals. Therefore, in this thesis the heterologous protein expression system based on microalgae was explored, reaching the proposed objectives. The developed photobioreator has sterilization capabilityin laboratorial scale (1) and in culture with recombinant strain had high productivity (3). The red fluorescent proteins was found as the most suitable proteins for studies of secretion in C. reinhardtii with lower interference levels(2). In addition, the predicted SP5 peptide showed the best performance in protein secretion (4) and the expression vector employed allowed the identification of strains producing biopharmaceutical hyaluronidase (5). Therefore, the system of heterologous proteins production by microalgae is promising and will allow, using secretion systems, to obtain proteins of high commercial value at low costs, using secretion and cultivation techniques such as extractive fermentation.

Protein misfolding and aggregation are the cause of many problems within the biopharmaceutical industry and medical fields. Although many experimental studies have been implemented in vivo in order to understand this process, the mechanism occurs in time and length scales inaccessible to conventional experiments. On the other hand, computational studies have shown significant improvement in elucidating key aspects of the aggregation pathways and gain insights to the folding behavior of the proteins. Consequently, this makes computational modeling an ideal complement to experiment in understanding the generic behavior and mechanisms of aggregation. This study is concerned with DynamO, a coarse-grained, off-lattice, general event-driven discontinuous molecular-dynamics simulation package. This simulator offers a unique opportunity to gain insight into the process of protein aggregation by displaying the optimal O(N) asymptotic scaling of the computational cost with the number of particles N, rather than O(NlogN) scaling found in most standard algorithms. The study was split into two loosely related projects: in the first project, a computer model was developed in which the effect of model parameters on folding behavior and characteristics of isolated peptides is investigated. The model parameters include chain stiffness (an overlap parameter defined as the ratio of the hard-core diameter to bond length 'sigma/l'), range of interaction potential 'Gamma', sequence, and chains length 'N '. Based on the model chosen from systems of isolated chains, aggregation in multichain systems is studied. In another project, we simulate various square-well fluid systems with different ranges of interaction potential in order to understand the phase behavior of proteins due to its relevance to aggregation and many bioprocessing events. Changing the model parameters shows different folding behaviors. The model-chains with 64 residues, Gamma equal to 1.1 and sigma/l equal to 1.9 is the least computationally expensive model displaying all the characteristics found in real proteins. We introduce a new order parameter which divides the conformational space into folded and unfolded ensemble-structures, this order parameter corresponds to a transition in the folding behavior of the chains. We define a native state ensemble as an ensemble of structures with small deviation in contact maps for spheres inaccessible to the solvent defined as the core of the chain. This native ensemble corresponds to the structures exhibiting low-temperature fluctuations simulating the 'breathing motions' of real proteins which is considered responsible for their catalytic activities. On the other hand, the non-native ensemble unfolds at higher temperatures, which increases the propensity for aggregation by forming intermolecular contacts, and therefore reproduce the behavior of proteins under severe solution conditions which occurs in bio- processing (this includes high concentration, temperature, pressure, pH ...). The behavior of multichain systems shows that it is possible to correlate the aggregation propensity of chains at room temperature from the behavior of chains in isolated system at the collapse temperature, which in turn correlate with the stability of the low-T ensemble. In the second project, we developed a more efficient way of calculating the critical temperature in SW fluids even for strongly short-ranged systems which are especially difficult to simulate. In the supercritical region, every isotherm obeys the linear equation for the pressure with a high precision within the bounds of uncertainty. The linear equation pm = p0 + Rm with Rm being the constant isothermal rigidity (dp/d)T . The constant rigidity can be used to estimate directly a critical temperature (Tc) and critical pressure (pc), respectively, and also to obtain the pressures and densities of the percolation loci based on an empirical quadratic nature of change in pressure with densities outside the percolation loci. Identifying the critical temperature and how it depends on the pair potential is very important in formulations with a growing need to predict when the solution will go opalescent.

Drugs for treating rare diseases had been neglected by the pharmaceutical industry for a long time, due to the complex and costly drug R&D process as well as a small unprofitable market. Since its introduction in 1983, the Orphan Drug Act (ODA) has sought to prompt the innovation of drugs for minority diseases by reducing the regulatory and economic barriers. The incentives of the ODA have been effected through market protection, tax credit, fee waiver and grants to increase the accessibility of orphan products for the public. The number of orphan drugs available in the market has risen sharply from just ten in the decade before 1983 to over 400 since 1983. This increase implies a substantial improvement of the healthcare of patients suffering rare diseases and a success of the orphan drug legislation with the aim to motivate the development and manufacture of products that have low commercial potentials. Although it is evident that the ODA has successfully stimulated drug companies to develop numerous orphan products, treatments are very expensive. The sales of blockbuster orphan drugs have provided drug companies with unusually highprofit margins and limited patient access to treatments. The dilemma presented by the ODA reflects many of the issues currently faced by policymakers. In this thesis, we have analyzed the long-term evolution of the biopharmaceutical industry. In particular, we have examined drug discovery in the period of random screening, rational design and network collaboration, and explored the influence of the ODA. We have taken the theory of the sectoral system of innovation, and combined it with the complex adaptive model of innovation, and found that the complex version of that theory is capable of explaining the comprehensive drug innovation system. A Multi-agent Based Model has been introduced to identify and analyze the dynamics of bio-pharmaceutical innovation. The model has explored the roles of the main players in the sector and the influence of their relationships embedded in the process of orphan drug innovation. Through this model, we have investigated the mechanisms of how the incentives stimulate orphan drug innovation during the period from 1983- 2012. Moreover, the model has been applied to solve the dilemma of the ODA through analyzing how to achieve the best trade-off between orphan drug developments. Drawing upon the results of the simulation, we provide a sound basis for adjusting the ODA incentives to strikes an appropriate balance between stimulating orphan drug innovation and providing benefits to society, propose some resolutions to the ODA, while also to motivate orphan drug development in a financial way. The Advice for other countries planning to enact the orphan drug legislation and directions for further research suggested by this model have been put forward.

O cetoconazol (CTZ) é um antifúngico imidazólico de amplo espectro, administrado tipicamente pela via oral (200 ou 400 mg por dia) ou topicamente (creme 2% aplicado duas vezes ao dia). A efícácia da terapia tópica depende das características de liberação do fármaco, do veículo e da farmacocinética da substância ativa no tecido cutâneo, ou seja, de como ela se difunde através da pele. No presente trabalho, duas formulações comerciais (A e B), uma manipulada (C) e três desenvolvidas (D2:0; El: 1 e FO:2) contendo CTZ na concentração de 20 mg/g, foram estudadas quanto às características físico-químicas e quanto ao comportamento biofarmacêutico/bioequivalente tópico, através de medidas adequadas do ativo na camada do estrato córneo (EC). Uma metodologia in vivo denominada tape-stripping ou \'remoção do estrato córneo\' por fitas adesivas foi utilizada para medir a velocidade e extensão da penetração do CTZ no EC do antebraço de voluntários sadios. Um sistema bicompartimental de difusão vertical com membrana sintética (acetato de celulose) e membrana natural (pele suína) foi empregado para avaliar in vitro a taxa de liberação e a avaliação da penetração e eventual permeação do fármaco, respectivamente. Todas as amostras foram analisadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), com método previamente validado. Nos estudos in vivo, as quantidades de fármaco determinadas no EC (µg/mg) para cada tempo da aplicação foram analisadas estatisticamente empregando-se análise da variância (ANOVA) considerando dois fatores: Fator 1 = tratamento com dois níveis e Fator 2 = antebraços (esquerdo e direito). Dentre os produtos avaliados somente entre A e C houve diferença estatisticamente significativa (p < 0,05). Os ensaios de liberação, através da avaliação do fluxo de fármaco para o meio aceptor, evidenciaram agrupamento das formulações em duas categorias distintas entre si com fluxo entre 2,41, 2,16 e 2,49 µg/cm2/h compreendendo A, B e F0:2 (p = 0,171) e outra com fluxo entre 5,85, 6,28 e 7,21µg/cm2/h para C, D2:0 e E1:1 (p = 0,478) pela ANOVA com α = 0,05. A quantidade de CTZ nos estratos cutâneos da pele suína diminuiu com a profundidade, ou seja, na derme foi detectado menor quantidade de fármaco após aplicação das formulações A, B e F0:2 e não foi detectado sua presença na solução receptora. As formulações A, B e F0:2 não apresentaram um perfil de penetração cutânea na epiderme e na estatisticamente diferente ao nível de 5% (p =0,609 e p = 0,269, respectivamente). A bioequivalência foi avaliada empregando os dados obtidos nos estudos in vivo, de acordo com os critérios das razões (ASC0-240min) entre os produtos B, C e F0:2 em relação a A (considerado referência) com intervalo de confiança de 90% (IC 90%). Considerat1do o limite de 80-125%, as formulações não seriam bioequivalentes, pois existe uma grande diferença entre os produtos A e B, entre A e C, já A e F apresentam intervalo mais próximo do limite citado. Com base nesses resultados, a formulação do produto F poderia ser indicada a um possível desenvolvimento de genérico do produto A. / Ketoconazole (KTZ) is an imidazolic antifungal, of broad-spectrum, typically administered orally (200 or 400 mg per day) or topical1y (2% cream, applied twice daily). The efficacy of the topical therapy depend on the characteristics of the drug\'s release, of the vehicle and of the active substance\'s pharmacokinetic in the cutaneous tissue, in other words, on how this substance diffuses through the skin. On this paper, two commercial formulations (A and B), one manipulated (C) and three developed (D2:0; E1: 1 and F0:2) containing KTZ on the concentration of 20 mg/g, were studied in relation to the physical-chemical characteristics and to the bioavailability/bioequivalence topic behave by an adequate active layer\'s measurement of the stratum corneum (SC). The methodology in vivo called as tape stripping or \'stratum corneum remotion\' by adhesive tapes was proposed to measure the rate and KTZ penetration\'s extension in the SC of healthy volunteers\' forearm. A bicompartmental system of vertical diffusion with sintetic membrane (celullose acetate) and natural membrane (porcine skin) was used to evaluate in vitro the rate of release and the penetration evaluation and eventual drug permeation, respectively. All samples were then submitted to HPLC analysis by previously validated method. In the studies in vivo the amount of drug determined in the SC (µ/mg) for each application time was analyzed using variance\'s analysis (ANOVA) considering two factors: Factor 1 = treatment with two leveis and Factor 2 =forearm (left and right). Among the products evaluated there was only between A and C a statistical1y significant difference (p < 0,05). The assays of release, through the evaluation of the drug flow to the receptor chamber, evidenced the grouping of formulations in two categories, different among themselves, with flow among 2,41; 2,16 and 2,49 µg/cm2/h comprehending A, B and F(0:2) (p = 1,171) and other with flow among 5,85; 6,28 and 7,21µg/cm2/h and to C, D2:0 and E1:1 (p = 0,478) by ANOVA with a = 0,05. The amount of KTZ in the cutaneous stratum of porcine skin decreased with the depth, in other words, a lower value for drug was detected in the dermis after formulations\' application A, B and F0:2 and its presence was not detected in the receptor solution. Formulations A, B and F0:2 did not present a cutaneous penetration\'s profile, in the epidermis and dermis, statisticalIy different by level of 5% (p = 0,6097 e p = 0,269, respectively). Bioequivalence was evaluated using datas obtained from studies in vivo, according to criterias of reason_(ASC0-240min>) among the products B, C and F in relation to A (considered as reference) with interval of confidence of 90% (IC 90%). Considering the 80-125% limit, the formulations would not be bioequivalents, because there is a big difference among products A and B, A and C; now A and F present the nearest interval to thc quoted limito Basing on these results, the formulation of the product F could be indicated a possible generic development of product A.

A L-Asparaginase (L-ASNase) é uma enzima tetramérica bacteriana, utilizada em sessões de quimioterapia. Essa enzima depleta os aminoácidos asparagina (Asn) e glutamina (Gln), transformando-os em aspartato (Asp) ou glutamato (Glu), respectivamente, e em amônia. Contudo, a L-ASNase pode induzir resposta imune, levando à produção de anticorpos antiasparaginase, uma causa importante de resistência ao medicamento. Uma L-ASNase ideal seria aquela com alta atividade e estabilidade e baixo potencial imunogênico, porém, as L-ASNases utilizadas na terapêutica não reúnem essas características simultaneamente. Por essa razão, o presente trabalho utilizou técnicas de mutagênese randômica, a fim de criar uma nova proteoforma de L-ASNase de E. chrysanthemi com uma melhor atividade e estabilidade. Além disso, foram estudadas condições de cultivo em agitador metabólico, visando à otimização de condições de produção. Foi criada uma biblioteca com 1.056 clones, e desses, 19 foram selecionados por apresentarem atividade superior ou igual à enzima selvagem quando dosada em extrato bruto. Dentre eles, dois mutantes se destacaram por apresentarem a atividade específica glutaminásica diferente da enzima selvagem. Análises in silico indicam que o mutante 9-6D apresentou diminuição de desordem estrutural e epítopos imunogênicos. O mutante 9-5F demonstrou uma diminuição da porcentagem da atividade glutaminásica quando comparada a enzima selvagem. O estudo de produção do mutante 9-5F indicou que a temperatura de indução, seguida da concentração do indutor, são os parâmetros mais relevantes para a otimização da produção de L-ASNase de E. chrysanthemi mutante. / L-Asparaginase (L-ASNase) is a bacterial tetrameric enzyme used in chemotherapy sessions that deplete asparagine (Asn) and glutamine (Gln), transforming them into Aspartate (Asp) or glutamate (Glu), respectively, and ammonia. However, L-ASNase can induce immune response leading to the production of anti-asparaginase antibody, an important cause of drug resistance. Ideally, L-ASNase would be one with high activity, high stability and low immunogenic potential, but the L-ASNases commercially available today do not present these characteristics simultaneously. For this reason, this study used techniques of random and site-directed mutagenesis in order to create a new proteoform of E. chrysanthemi L-ASNase with improved activity and stability. In addition, culture conditions were studied in a metabolic shaker, aiming at the optimization of production conditions. A library with 1,056 clones was created, and of these clones, 19 were selected because they had activity superior or equal to the wild-type enzyme in crude protein extract. Among them, 2 mutants stood out for having different glutaminase specific activity in relation to wild-type enzyme. The 9-6D mutant also showed decreased structural disorder and immunogenic epitopes. The 9-5F mutant demonstrated a decrease in percentage of glutaminase activity when compared to the wild-type enzyme. The production study of 9-5F mutant indicated that the induction temperature followed by the inductor concentration are the most relevant parameters for the production optimization of E. chrysanthemi mutant L-ASNase.

O objetivo desta tese foi explorar o sistema de produção de proteínas heterólogas em microalga com ênfase em Chlamydomonas reinhardtii por meio de: (1) desenvolvimento de um fotobiorreator tubular fechado de escala laboratorial, utilizando técnicas de manufatura digital; (2) avaliação de 7 diferentes proteínas fluorescentes (mTagBFP, Cerulean, Emerald, crGFP, cOFP, tdTomato e mCherry), como sistema reporter de secreção de proteínas em microalga; (3) avaliação do fotobiorreator desenvolvido utilizando cultivo de cepas recombinantes; (4) desenvolvimento de novos peptídeos sinais para secreção de proteínas em C. reinhardtii; (5) avaliação da produção de um biofármaco (hialuronidase) em microalgas, por meio da expressão de duas isoenzimas codificadas pelos genes HYA1 e SPAM1 em C. reinhardtii. O fotobiorreator tubular foi avaliado quanto a sua capacidade de resistir ao processo de esterilização por autoclavação e seu desempenho por meio do cultivo de cepa recombinante secretando mCherry. A fluorescência das proteínas fluorescentes foi medida por leitor de placas de fluorescência e visualizada intracelularmente por microscopia confocal de fluorescência. A atividade de hialuronidase foi determinada através de um ensaio enzimático turbidimétrico. O desenvolvimento do fotobiorreator resultou em um sistema fechado resistente a autoclavação, com capacidade de cultivo de cepas recombinantes de C. reinhardtii. Esse fotobiorreator proporcionou uma produtividade máxima de 10 mg/L.d de mCherry da cepa recombinante em sistema fechado, com velocidade específica de crescimento máxima de 1,27 d-1 para a cepa recombinante testada. Todas as proteínas fluorescentes avaliadas apresentaram capacidade de secreção por C. reinhardtii, com diferentes níveis de interferências em sua medição, permitindo a escolha da mCherry como proteína reporter. Entre os peptídeos sinais avaliados (quatro descritos na literatura - BiP, ARS1, CAH1 e IBP1 - e seis preditos), o peptídeo predito \"SP5\" foi o que apresentou maior capacidade de secreção, determinado por níveis de fluorescência no sobrenadante. A avaliação dos peptídeos sinais constatou a necessidade de explorar o desenvolvimento de sistemas de expressão (e.g. vetores de expressão) aliados a análises computacionais, como o SignalP 4.0. Por último, os dados desse estudo mostram que C. reinhardtii transformadas com o vetor de expressão foi capaz de produzir as duas isoformas de hialuronidase em sua forma ativa, evidenciando a capacidade desse sistema para a produção de biofármacos. Portanto, nesta tese o sistema de expressão de proteínas heterólogas baseado em microalgas foi explorado, atingindo os objetivos propostos. O fotobiorreator desenvolvido tem a capacidade de esterilização em escala laboratorial (1) e em cultivo com cepa recombinante propiciou elevada produtividade (3). As proteínas vermelhas fluorescentes apresentaram-se como as proteínas com menores interferências para estudos de secreção em C. reinhardtii (2). Além disso, o peptídeo predito SP5 apresentou o melhor desempenho na secreção de proteínas (4) e o vetor de expressão empregado permitiu a identificação de cepas produtoras de biofármaco hialuronidase (5). Portanto, o sistema de produção de proteínas heterólogas por microalgas é um sistema promissor e poderá permitir, utilizando sistemas de secreção, obter proteínas de alto valor comercial a baixos custos, empregando a secreção e técnicas de cultivo como a fermentação extrativa. / In this thesis, the heterologous protein production in microalgae with emphasis on Chlamydomonas reinhardtii was explored through: (1) development of a laboratory scale closed tubular photobioreactor using digital manufacturing techniques; (2) evaluation of different fluorescent proteins (mTagBFP, Cerulean, Emerald, crGFP, cOFP, tdTomato and mCherry) as a reporter system for protein secretion in microalgae (3) evaluation of photobioreactor developed using recombinant strains culture; (4) development of new signals peptides for protein secretion in C. reinhardtii (5) expression evaluation of a biopharmaceutical (Hyaluronidase) in microalgae, through the expression of two isoenzymes encoded by the HYA1 and SPAM1 genes in C. reinhardtii. The tubular photobioreactor was evaluated for its ability to resist sterilization process by autoclaving and its performance by culturing recombinant strain secreting mCherry. Fluorescence of fluorescent proteins was measured by fluorescence plate reader and observed intracellularly by confocal fluorescence microscopy. The hyaluronidase activity was determined by a turbidimetric enzymatic assay. The development of the photobioreactor resulted in a closed system resistant to autoclaving, capable of culturing recombinant strains of C. reinhardtii. This recombinant strain achieved a maximum productivity of 10 mg/L.day of mcherry in the closed system, with a maximum growth rate of 1.27 d-1 for the recombinant strain tested. All the fluorescent proteins evaluated had C. reinhardtii secretion capacity, with different interference levels in their measurement, allowing the selection of mCherry as a reporter protein. Among the evaluated peptides (four described in the literature - BiP, ARS1, CAH1 and IBP1 - and six predicted), the predicted peptide \"SP5\" was the one that presented greater capacity of secretion, determined by levels of fluorescence in the supernatant. The results of this study point out the need to explore the development of biological systems (i.e., expression vectors) allied to computational analysis. Finally, the data from this study showed that C. reinhardtii could produce the two isoforms of hyaluronidase in its active form, evidencing the capacity of this system to produce biopharmaceuticals. Therefore, in this thesis the heterologous protein expression system based on microalgae was explored, reaching the proposed objectives. The developed photobioreator has sterilization capabilityin laboratorial scale (1) and in culture with recombinant strain had high productivity (3). The red fluorescent proteins was found as the most suitable proteins for studies of secretion in C. reinhardtii with lower interference levels(2). In addition, the predicted SP5 peptide showed the best performance in protein secretion (4) and the expression vector employed allowed the identification of strains producing biopharmaceutical hyaluronidase (5). Therefore, the system of heterologous proteins production by microalgae is promising and will allow, using secretion systems, to obtain proteins of high commercial value at low costs, using secretion and cultivation techniques such as extractive fermentation.