Orientador: Bastiaan Philip Reydon / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Economia / Made available in DSpace on 2018-08-22T16:46:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_AndreiaMara_D.pdf: 3044162 bytes, checksum: 5b4e661c49e0f4646dca3b29bc6c1898 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A presente tese de doutorado teve como foco apresentar uma proposta de criação de uma instituição gestora para o uso da biodiversidade e dos conhecimentos tradicionais associados à biodiversidade, para as atividades de bioprospecção no Brasil. Para tanto, identificaram-se alguns dos elementos que fazem parte das práticas de bioprospecção, ressaltando as especificidades dos biomas brasileiros e apresentando as peculiaridades dos povos dos conhecimentos tradicionais, indígenas e não indígenas. A tese abordou algumas distinções entre o conhecimento tradicional e o conhecimento científico, tendo em vista que as práticas de bioprospecção envolvem a gestão de acordos que utilizam recursos da biodiversidade, mas também agentes com interesses nem sempre convergentes. Para melhor visualização deste framework, foram apresentadas as características das atividades econômicas da bioprospecção e foram analisados estudos de casos internacionais e do Brasil, com base na Economia dos Custos de Transação aplicados a estes acordos de bioprospecção. Dentro dos casos analisados, identificou-se que há necessidade da criação de instituições intermediárias e de mecanismos pelo governo federal para facilitar a interação entre os agentes. Neste sentido, como resultado, o estudo propõe o desenho de um modelo institucional para a biodiversidade e conhecimentos tradicionais associados para as práticas de bioprospecção no Brasil / Abstract: This doctoral thesis focused on presenting a proposal to establish an institution for managing the use of biodiversity and traditional knowledge associated with biodiversity, bioprospecting activities in Brazil. For this, we identified some of the elements that compose the bioprospecting practices, emphasizing the specificities of Brazilian biomes and explaining the singularities of traditional indigenous and non-indigenous peoples and knowledge. We have also addressed some distinctive features between traditional knowledge and scientific knowledge. All considering that bioprospecting practices involve the management of agreements, which use biodiversity resources, but also agents who not always show converging interests. To provide a better understanding of this framework, we present the characteristics of economic activities related to bioprospection and analyze national and international case studies based on the Transaction Cost Economics applied to these bioprospecting agreements. Based on the cases analyzed, we realized that the Federal Government should create intermediate institutions and mechanisms to facilitate the interaction between the agents. In this regard, and as a result, the study proposes the design of an institutional model for the use of biodiversity and associated traditional knowledge with bioprospecting practices in Brazil / Doutorado / Desenvolvimento Economico, Espaço e Meio Ambiente / Doutora em Desenvolvimento Econômico

Os peptídeos antimicrobianos tem sido alvo de cada vez mais estudos como candidatos a antibióticos naturais devido a seu amplo espectro de ação e baixa suceptibilidade a induzir resistência microbiana. Carentes de sistema imune específico, os invertebrados contam com um eficiente sistema imune inato para se defenderem de microrganismos patogênicos, incluindo uma coleção de peptídeos antimicrobianos. Através de cromatografia, ensaios antimicrobianos, espectrometria de massas e análise em banco de dados, isolou-se frações do muco de lesmas da espécie P boraceiensis com efeito antimicrobiano e obteve-se sequencias mais prováveis de fragmentos de algumas das frações ativas encontradas, relacionando-os as proteínas e peptídeos conhecidos mais similares e sugerindo relação entre as sequencias encontradas, as proteínas e peptídeos similares, bem como possível relação com atividade antimicrobiana. Obteve-se uma gama de frações ativas contra bactérias e/ou leveduras e sequências e informações relacionadas que podem ser úteis para futuros estudos de isolamento e caracterização de fatores antimicrobianos no muco de P boraceiensis. / Antimicrobial peptides are becoming increasingly more important as natural antibiotics candidates since they show a broad spectrum of action and low suceptibility to induce microbial resistance. Lacking specific imunne system, invertebrates count with an efficient innate imunne system to deffend theirselves from pathogenic microrganisms, including a collection of antimicrobial peptides. Through chromatografy, antimicrobial tests, mass spectometry and database analysis, we isolated fractions from the mucucs of P boraceiensis slugs showing antimicrobial effect. We obtained most propable sequences from several active fractions, relating them with most similar known peptides and proteins. There were sugesteg some possible connections between the found sequences and related peptides and proteins as well as possible antimicrobial activity relations. We found several active fractions against bacteria and/or yeast as well as sequences and related information that may be usefull in further isolation and caracterization studies of antimicrobial factors in P boraceiensis mucus.

O filo Cyanobacteria constitui um grupo filogeneticamente coerente, embora, apresente grande diversidade morfológica, sendo sua sistemática constantemente revisada. Esses micro-organismos são, ainda, alvos de estudos biotecnológicos em razão da produção de toxinas e na busca por substâncias de interesse farmacológico. Dentre as linhagens analisadas neste estudo, sete sequências do gene rRNA 16S foram geradas e avaliadas com sequências previamente obtidas. Ao menos dois grupos podem representar novos gêneros de cianobactérias, sendo que um grupo demonstra ser endêmico de manguezais brasileiros. Os genes de inibidores de proteases, aeuruginosina, cianopeptolina e microviridina, foram detectados e a produção de aeruginosina foi confirmada por LC-MS nos gêneros Cyanobium e Nostoc. Sequências de aminoácidos do precursor de microviridina indicaram a produção de três novas variantes em quinze linhagens de cianobactérias dos gêneros Cyanobium, Synechococcus, Cyanobacterium, Nodosilinea e Nostoc. O potencial genético para produção de cilindrospermopsina (cyrJ) foi confirmado em vinte e seis linhagens. Em cinco linhagens dos gêneros Cyanobium e Nostoc foram encontrados os genes mcyD, mcyE e mcyG, envolvidos na biossíntese de microcistina. A sequência McyG da linhagem Nostoc sp. CENA175 agrupou-se filogeneticamente com outras de linhagens produtoras de microcistina. Os genes sxtA e sxtI, envolvidos na biossíntese de saxitoxina, foram encontrados em nove linhagens dos gêneros Cyanobium, Oxynema, Leptolyngbya, Nodosilinea e Nostoc. A sequência de SxtI da linhagen Leptolyngbya sp. CENA134 apresentou similaridade >= 70 % com proteínas hipotéticas enquanto as de Nostoc sp. CENA159 e Nostoc sp. CENA160 apresentaram similaridade >= 82 % com O-carbamoiltransferase. Na análise filogenética, a sequência de SxtI da linhagem Nostoc sp. 160 agrupou-se com sequências de linhagens produtoras de saxitoxina. Nas análises químicas, a fração 3 do extrato da linhagem Oxynema sp. CENA135 revelou uma substância com características de ácidos graxos poli-insaturados e a fração 2 do extrato da linhagem Nostoc sp. CENA175 apresentou uma estrutura aromática ligada a uma cadeia alifática. Outros três extratos, obtidos das linhagens Cyanobium sp. CENA157, Nodosilinea sp. CENA183 e Nostoc sp. CENA184 mostraram-se promissores quanto à presença de substâncias nitrogenadas. Os ensaios de bioatividade revelaram que 48 % dos extratos metanólicos inibiram o crescimento de ao menos um isolado de bactéria e/ou levedura. Os extratos das linhagens Cyanobium sp. CENA142 e Cyanobacterium sp. CENA169 foram eficientes contra o crescimento de seis bactérias patogênicas. Nos ensaios de inibição de células tumorais, o extrato de DCM da linhagem Cyanobium sp. CENA154 (100 ?gomL-1) inibiu moderadamente culturas de células 3LL. Os extratos etanólicos de Oxynema sp. CENA135 (20 ?gomL-1) e Cyanobium sp. CENA154 (100 ?gomL-1) inibiram as células CT-26. Em ensaios conduzidos com linhagens de células de glioma (U251), câncer de mama (MCF-7) e câncer de pulmão (NCI-H460), o extrato de DCM da linhagem Cyanobium sp. CENA136 inibiu 50 % do crescimento das respectivas células tumorais nas concentrações 7,8; 27,1 e 14,0 ?gomL-1. Desta forma, além de filogeneticamente diversas, as cianobactérias isoladas de ambiente marinho do Estado de São Paulo constituem fonte promissora de inibidores de proteases, cianotoxinas e substância bioativas com ação antibacteriana, antifúngica e antitumoral. / The phylum Cyanobacteria is a phylogenetically coherent group, although presenting great diversity, and its systematic have been constantly reviewed. These microorganisms are also targets of biotechnological studies due to the production of toxins and the search for novel substances of pharmacological interest. Among the strains analyzed in this study, sequences of the 16S rRNA gene were generated for seven and, than, analyzed with sequences previously obtained. At least two groups may represent new cyanobacterial genera, while a group of Cyanobium proves to be endemic of Brazilian mangroves. Genes of the proteases inhibitors, aeuruginosin, cyanopeptolin and microviridin, were detected and the production of aeruginosin was confirmed by LC-MS for Nostoc and Cyanobium. The amino acid sequences of microviridin precursor indicated the production of three new variants in fifteen cyanobacterial strains of the genera Cyanobium, Synechococcus, Cyanobacterium, Nostoc and Nodosilinea. The genetic potential for production of cylindrospermopsin (cyrJ) was confirmed in twenty-six strains. In five strains of the genera Nostoc and Cyanobium the mcyD, mcyE and mcyG genes, which are involved in the microcystin biosynthesis, were found. The McyG sequence of Nostoc sp. CENA175 was phylogenetically grouped with sequences of microcystin-producing strains. The sxtA and sxtI genes, from saxitoxin biosynthesis, were found in nine strains of the genera Cyanobium, Oxynema, Leptolyngbya, Nodosilinea and Nostoc. The SxtI sequence of Leptolyngbya sp. CENA134 showed similarity >= 70 % with hypothetical proteins, while the sequences of Nostoc sp. CENA159 and Nostoc sp. CENA160 showed similarity >= 82% with O-carbamoyltransferase. In the phylogenetic analysis, the SxtI sequence of Nostoc sp. CENA160 grouped with sequences of strains that produce saxitoxin. In chemical analysis, the fraction 3 of the Oxynema sp. CENA135 extract revealed a substance with poly-unsaturated fatty acids characteristics and the fraction 2 of Nostoc sp. CENA175 extract indicated an aromatic structure, attached to an aliphatic chain. Other three extracts obtained from Cyanobium sp. CENA157, Nodosilinea sp. CENA183 and Nostoc sp. CENA184 were promising for the presence of nitrogenous substances. Bioactivity assays revealed that 48 % of the methanolic extracts inhibited the growth of at least one isolate of bacteria and/or yeast. The extracts of Cyanobium sp. CENA142 and Cyanobacterium sp. CENA169 were efficient against six pathogenic bacteria. In the inhibition assays of tumor cells, the DCM extract of Cyanobium sp. CENA154 (100 mgomL-1) moderately inhibited the growth of 3LL cells. Ethanol extracts of Oxynema sp. CENA135 (20 mgomL-1) and Cyanobium sp. CENA154 (100 mgomL-1) were able to inhibit cultures of CT- 26 cells. In tests conducted with glioma cell lines (U251), breast cancer (MCF-7) and lung cancer (NCI-H460), the DCM extract of Cyanobium sp. CENA136 caused 50 % of growth inhibition, respectively, when used at concentrations of 7.8, 27.1 and 14.0 mgomL-1. Thus, besides their phylogenetically diversity, the cyanobacteria strains from marine environment of the São Paulo state are a promising source of protease inhibitors, cyanotoxins and bioactive compounds with antibacterial, antifungal and antitumor activities.

Surfactantes de origem química e biológica são substâncias anfipáticas que se localizam em interfaces e diminuem a tensão intererficial. Este trabalho objetivou isolar microrganismos do gênero Pseudomonas, a partir de amostras ambientais; selecionar, dentre os isolados, aqueles que são capazes de produzir biossurfactante e caracterizar os biossurfactantes encontrados de acordo com suas propriedades. Foram isoladas 1713 linhagens, destas, 944 foram capazes de crescer em meio PIA. A análise do sobrenadante para presença de ácidos graxos normalmente encontrados em ramnolipídios demonstrou que em 31 linhagens, das 95 que apresentaram atividades tensoativas, foi detectada a presença de 3-hidroxidecanoato (3HD) e outras 56 não apresentaram picos característicos de ácidos graxos característicos de ramnolipídios. Foram selecionadas 10 linhagens para caracterização dos biossurfactantes produzidos por elas. Foi confirmada a produção de ramnolipídios por 3 linhagens e foi possível identificar um novo composto com tensoatividade, o 2-acetilfurano. / Biological and chemical surfactants are anphipatic compounds whitch reduce interfaces tension. The present work aimed to isolate microorganisms of samples from diverse environments, chosing among the isolated ones, those capaple of producing biosurfactants and characterizing it according to some of their properties. From 1713 isolated strains, 944 were capable of growing in PIA medium. The supernatant analysis for the presence of fatty acids usually found in rhamnolipds showed that 31 of the 87 strains that presented tensoactive activities, had 3-hydroxyalkanoates (3HD) detected in their supernatant. Other 56 strains did not present characteristic rhamnolipid fatty acids peaks. Based in this resoults 10 isolates were selected for a better characterization of their biosurfactants. The producton os RHLs were confirmed for 3 diferent strains. It was possible to identify a new compound called 2-acethylfuran that was not mentioned by other authors as a possible biosurfactant or as produced by Pseudomonas.

A utilização de plantas com ação inseticida tem sido considerada uma alternativa promissora no manejo integrado de pragas, apresentando diversas vantagens em relação aos atuais métodos de controle. Nos últimos anos no Brasil, uma série de estudos tem demonstrado que os produtos derivados de plantas apresentam bioatividade contra insetos. Assim, a identificação e a descrição dos compostos químicos responsáveis por essa bioatividade é fundamental, uma vez que tais compostos podem servir como modelos para a síntese de novos inseticidas sintéticos com estrutura química análoga à dos naturais, principalmente aqueles que apresentem mecanismos de ação diferentes dos produtos já registrados. Portanto, no presente estudo, foi realizada uma triagem com 17 extratos etanólicos provenientes de 9 espécies de Solanaceae para avaliar a bioatividade deles sobre o gorgulho-do-milho, Sitophilus zeamais Mots. (Coleoptera: Curculionidae). O extrato etanólico de folhas de Brugmansia suaveolens (Willd.) Bercht. & J. Presl foi o melhor entre todos, sendo as concentrações letais necessárias para matar 50 e 90% da população (CL50 e CL90) iguais a 2.231 mg kg-1 e 5.859 mg kg-1, respectivamente, e o tempo letal médio (TL50), usando a CL90, foi 99,78 h. Dessa forma, ele foi selecionado para uma série de fracionamentos químicos biomonitorados com ensaios toxicológicos para identificar compostos bioativos. Algumas das frações químicas obtidas a partir de B. suaveolens mataram mais de 50% dos adultos de S. zeamais, além de reduzirem a progênie F1 e, consequentemente, os danos nos grãos de milho. Essa bioatividade se deve, possivelmente, à presença de ácidos graxos e alcaloides. Por cromatografia líquida de alta pressão acoplada à espectrometria de massas de ultra resolução (UPLC-MS) da fração BSHex6F4, foram identificados compostos pertencentes ao grupo dos alcaloides. Por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) das frações BSHex1-F3, BSHex1-F4 e BSHex1-F6 foram identificados derivados de ácidos graxos. Os resultados adquiridos no presente estudo demonstram o potencial de prospectar compostos inseticidas de espécies da família Solanaceae para proteger grãos de milho armazenado contra os danos causados por S. zeamais. / The use of plants with insecticidal action has been considered a promising alternative in the integrated pest managment, showing several advantages over current control methods. In recent years in Brasil, a number of studies have shown that plant-derived products have bioactivity against insects. Thus, the identification and description of the chemical compounds responsible for this bioactivity is fundamental, since such compounds can be used as models for development of new synthetic insecticides with chemical structure analogous to the natural ones, mostly those that present different mode of action of those currently registred. Therefore, in the present study, a screening was performed with 17 ethanolic extracts from 9 Solanaceae species to evaluate their bioactivity on the maize weevil Sitophilus zeamais Mots. (Coleoptera: Curculionidae) on stored grain corn. The ethanolic extract from the leaves of Brugmansia suaveolens (Willd.) Bercht. & J. Presl was the most efficient among all, presenting the lethal concentrations to kill 50 and 90% of the population (LC50 and LC90) equal to 2,231 mg kg-1 and 5,859 mg kg-1, respectively, and the mean lethal time (LT50), using the LC90, of 99.78 h. Therefore, this extract was selected to continue the biomonitoring chemical fractions with toxicological bioassays to identify bioactive compounds. Some of the chemical fractions obtained from B. suaveolens extract killed more than 50% of the adults of S. zeamais, besides reducing the progeny F1 and, consequently, the damages in the corn grains. This bioactivity is possibly due to the presence of fatty acids and alkaloids. An ultra performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (UPLC-MS) analysis was performed with the BSHex6-F4 fraction and alkaloids derivatives compounds were identified. A gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) analysis was performed with the BSHex1-F3, BSHex1-F4 and BSHex1-F6 fractions and fatty acids derivatives were identified. The results obtained in the present study demonstrate the potential to prospect insecticidal compounds of Solanaceae family species to protect corn stored grains against damage caused by S. zeamais.

O filo Cyanobacteria constitui um grupo filogeneticamente coerente, embora, apresente grande diversidade morfológica, sendo sua sistemática constantemente revisada. Esses micro-organismos são, ainda, alvos de estudos biotecnológicos em razão da produção de toxinas e na busca por substâncias de interesse farmacológico. Dentre as linhagens analisadas neste estudo, sete sequências do gene rRNA 16S foram geradas e avaliadas com sequências previamente obtidas. Ao menos dois grupos podem representar novos gêneros de cianobactérias, sendo que um grupo demonstra ser endêmico de manguezais brasileiros. Os genes de inibidores de proteases, aeuruginosina, cianopeptolina e microviridina, foram detectados e a produção de aeruginosina foi confirmada por LC-MS nos gêneros Cyanobium e Nostoc. Sequências de aminoácidos do precursor de microviridina indicaram a produção de três novas variantes em quinze linhagens de cianobactérias dos gêneros Cyanobium, Synechococcus, Cyanobacterium, Nodosilinea e Nostoc. O potencial genético para produção de cilindrospermopsina (cyrJ) foi confirmado em vinte e seis linhagens. Em cinco linhagens dos gêneros Cyanobium e Nostoc foram encontrados os genes mcyD, mcyE e mcyG, envolvidos na biossíntese de microcistina. A sequência McyG da linhagem Nostoc sp. CENA175 agrupou-se filogeneticamente com outras de linhagens produtoras de microcistina. Os genes sxtA e sxtI, envolvidos na biossíntese de saxitoxina, foram encontrados em nove linhagens dos gêneros Cyanobium, Oxynema, Leptolyngbya, Nodosilinea e Nostoc. A sequência de SxtI da linhagen Leptolyngbya sp. CENA134 apresentou similaridade >= 70 % com proteínas hipotéticas enquanto as de Nostoc sp. CENA159 e Nostoc sp. CENA160 apresentaram similaridade >= 82 % com O-carbamoiltransferase. Na análise filogenética, a sequência de SxtI da linhagem Nostoc sp. 160 agrupou-se com sequências de linhagens produtoras de saxitoxina. Nas análises químicas, a fração 3 do extrato da linhagem Oxynema sp. CENA135 revelou uma substância com características de ácidos graxos poli-insaturados e a fração 2 do extrato da linhagem Nostoc sp. CENA175 apresentou uma estrutura aromática ligada a uma cadeia alifática. Outros três extratos, obtidos das linhagens Cyanobium sp. CENA157, Nodosilinea sp. CENA183 e Nostoc sp. CENA184 mostraram-se promissores quanto à presença de substâncias nitrogenadas. Os ensaios de bioatividade revelaram que 48 % dos extratos metanólicos inibiram o crescimento de ao menos um isolado de bactéria e/ou levedura. Os extratos das linhagens Cyanobium sp. CENA142 e Cyanobacterium sp. CENA169 foram eficientes contra o crescimento de seis bactérias patogênicas. Nos ensaios de inibição de células tumorais, o extrato de DCM da linhagem Cyanobium sp. CENA154 (100 ?gomL-1) inibiu moderadamente culturas de células 3LL. Os extratos etanólicos de Oxynema sp. CENA135 (20 ?gomL-1) e Cyanobium sp. CENA154 (100 ?gomL-1) inibiram as células CT-26. Em ensaios conduzidos com linhagens de células de glioma (U251), câncer de mama (MCF-7) e câncer de pulmão (NCI-H460), o extrato de DCM da linhagem Cyanobium sp. CENA136 inibiu 50 % do crescimento das respectivas células tumorais nas concentrações 7,8; 27,1 e 14,0 ?gomL-1. Desta forma, além de filogeneticamente diversas, as cianobactérias isoladas de ambiente marinho do Estado de São Paulo constituem fonte promissora de inibidores de proteases, cianotoxinas e substância bioativas com ação antibacteriana, antifúngica e antitumoral. / The phylum Cyanobacteria is a phylogenetically coherent group, although presenting great diversity, and its systematic have been constantly reviewed. These microorganisms are also targets of biotechnological studies due to the production of toxins and the search for novel substances of pharmacological interest. Among the strains analyzed in this study, sequences of the 16S rRNA gene were generated for seven and, than, analyzed with sequences previously obtained. At least two groups may represent new cyanobacterial genera, while a group of Cyanobium proves to be endemic of Brazilian mangroves. Genes of the proteases inhibitors, aeuruginosin, cyanopeptolin and microviridin, were detected and the production of aeruginosin was confirmed by LC-MS for Nostoc and Cyanobium. The amino acid sequences of microviridin precursor indicated the production of three new variants in fifteen cyanobacterial strains of the genera Cyanobium, Synechococcus, Cyanobacterium, Nostoc and Nodosilinea. The genetic potential for production of cylindrospermopsin (cyrJ) was confirmed in twenty-six strains. In five strains of the genera Nostoc and Cyanobium the mcyD, mcyE and mcyG genes, which are involved in the microcystin biosynthesis, were found. The McyG sequence of Nostoc sp. CENA175 was phylogenetically grouped with sequences of microcystin-producing strains. The sxtA and sxtI genes, from saxitoxin biosynthesis, were found in nine strains of the genera Cyanobium, Oxynema, Leptolyngbya, Nodosilinea and Nostoc. The SxtI sequence of Leptolyngbya sp. CENA134 showed similarity >= 70 % with hypothetical proteins, while the sequences of Nostoc sp. CENA159 and Nostoc sp. CENA160 showed similarity >= 82% with O-carbamoyltransferase. In the phylogenetic analysis, the SxtI sequence of Nostoc sp. CENA160 grouped with sequences of strains that produce saxitoxin. In chemical analysis, the fraction 3 of the Oxynema sp. CENA135 extract revealed a substance with poly-unsaturated fatty acids characteristics and the fraction 2 of Nostoc sp. CENA175 extract indicated an aromatic structure, attached to an aliphatic chain. Other three extracts obtained from Cyanobium sp. CENA157, Nodosilinea sp. CENA183 and Nostoc sp. CENA184 were promising for the presence of nitrogenous substances. Bioactivity assays revealed that 48 % of the methanolic extracts inhibited the growth of at least one isolate of bacteria and/or yeast. The extracts of Cyanobium sp. CENA142 and Cyanobacterium sp. CENA169 were efficient against six pathogenic bacteria. In the inhibition assays of tumor cells, the DCM extract of Cyanobium sp. CENA154 (100 mgomL-1) moderately inhibited the growth of 3LL cells. Ethanol extracts of Oxynema sp. CENA135 (20 mgomL-1) and Cyanobium sp. CENA154 (100 mgomL-1) were able to inhibit cultures of CT- 26 cells. In tests conducted with glioma cell lines (U251), breast cancer (MCF-7) and lung cancer (NCI-H460), the DCM extract of Cyanobium sp. CENA136 caused 50 % of growth inhibition, respectively, when used at concentrations of 7.8, 27.1 and 14.0 mgomL-1. Thus, besides their phylogenetically diversity, the cyanobacteria strains from marine environment of the São Paulo state are a promising source of protease inhibitors, cyanotoxins and bioactive compounds with antibacterial, antifungal and antitumor activities.

Este trabalho teve como objetivo caracterizar a diversidade bacteriana presente em uma área de mineração. Os resultados mostraram que o filo mais abundante das bactérias classificadas foi o proteobacteria e 66% deste filo pertencem a classe betaproteobacteria. A diversidade de bactérias encontradas no solo de fora da mina mostrou-se diferente daquele encontrado dentro da mina, mostrando que a ação da mineração poderia ter modificado a comunidade microbiana nativa do local. Na tentativa de elucidar o mecanismo de resistência ao cobre presente nos isolados, foram escolhidas 2 cepas resistentes a altas concentrações de cobre: Acinetobacter sp. e Enterobacter sp. Os resultados de proteômica mostraram que as duas cepas possuem mecanismos diferentes de resistência. Acinetobacter teve a expressão de duas proteínas CopA e CopB em diferentes condições de cultivos (200 ppm de cobre 6h de cultivo; 24h e 72h de cultivo em 450 ppm de cobre). Com esses resultados foi possível elucidar que esta cepa tem o mesmo mecanismo de resistência encontrado em Enterococcus hirae, onde a proteína CopA tem como função o influxo de cobre e a proteína CopB o efluxo do excesso de cobre intracelular. Já a bactéria Enterobacter teve expressão apenas de proteínas de membranas e nenhuma proteína propriamente conhecida como de resistência à cobre. Este resultado foi corroborado por técnica de PCR, no qual não houve expressão para esse gene. Possivelmente as proteínas de membrana externa estão responsáveis pela homeostase do cobre realizada por esta cepa. / This work aimed to characterize the bacterial diversity present in a mining area. Results showed the most abundant phylum of the classified bacteria are proteobacteria and 66% of this phylum are class betaproteobacteria. The diversity of bacteria found in the soil outside the mine differed from those found within the mine, showing that the mining action may have modified the local microbial community. In an attempt to elucidate the mechanism of resistance to copper present in the isolates, two strains resistant to high concentrations of copper were chosen: Acinetobacter sp. and Enterobacter sp. Proteomics results showed these two strains have different mechanisms of resistance. Acinetobacter had the expression of two CopA and CopB proteins under different cultivation conditions (200 ppm of copper 6h of culture and 24h and also in 450 ppm of copper and 72h of culture). With these results it was possible to elucidate, this strain has the same mechanism of resistance found in Enterococcus hirae, which the CopA protein functions as the copper influx and the CopB protein the efflux of excess intracellular copper. On the other hand, Enterobacter bacterium had only membrane proteins, and no proteins known as copper resistance. This result was corroborated with PCR, where there was no expression for this gene. Possibly the outer membrane proteins are responsible for the copper homeostasis performed by this strain.

Made available in DSpace on 2015-02-04T20:42:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Werley Barbosa Leite.pdf: 742543 bytes, checksum: 03621ab38e8aa4b40a88dcc263cbdef0 (MD5) Previous issue date: 2009-04-01 / A presente dissertação tem como objetivo o estudo do aspecto jurídico e do procedimento administrativo que envolve acesso ao patrimônio genético e aos conhecimentos tradicionais associados, para fins de bioprospecção no Brasil. Os temas conservação e uso sustentável da diversidade biológica são hoje uma das questões legislativas mais relevante para os Estados que assinaram a Convenção sobre Diversidade Biológica CDB, cujos objetivos são: a conservação da diversidade biológica, a utilização sustentável de seus componentes e a repartição justa e eqüitativa dos benefícios derivados da utilização dos recursos genéticos, mediante, inclusive, o acesso adequado aos recursos genéticos e a transferência adequada de tecnologias pertinentes, levando em conta todos os direitos sobre tais recursos e tecnologias . Para o adequado desenvolvimento do tema, esta dissertação se divide basicamente em três partes: na primeira parte (capítulos 1 e 2) são contextualizadas a biodiversidade e a bioprospecção, com objetivo de conhecer os valores da diversidade biológica e a importância da pesquisa num processo de exploração sustentável do patrimônio genético; a segunda parte (capítulo 3) trata de um estudo da legislação nacional que regulamenta o acesso ao patrimônio genético e aos conhecimentos tradicionais associados; na terceira parte (capítulo 4 e 5) é analisado o procedimento administrativo que aprova a atividade de bioprospecção no Brasil e os aspectos contratuais relacionados à repartição justa e eqüitativa dos benefícios associados. Com base nesse estudo, buscou-se identificar os problemas normativos que afetam o desenvolvimento da bioprospecção e as alternativas de solução que agilizem o processo administrativo de análise e aprovação, por parte do Conselho de Gestão do Patrimônio Genético CGEN. Esperamos que este trabalho seja útil no processo de discussão dos projetos de lei que se encontram no legislativo, bem como, contribua para a divulgação e o entendimento deste tema que, apesar de sua importância, é ainda pouco conhecido entre os brasileiros.

A biodiversidade microbiana de diferentes ecossistemas tem incentivado estudos químicos e biológicos com micro-organismos dos mais variados habitats, os quais têm conduzido à obtenção de moléculas bioativas com aplicações na medicina, indústria química e agricultura, proporcionando melhorias na qualidade de vida ao homem. O presente trabalho teve como objetivos a bioprospecção por actinobactérias endofíticas e seus metabólitos, além do estudo da via biossintética dos sesquiterpenos aristoloquenos produzidos pelo fungo fitopatogênico Botrytis cinerea. No estudo de bioprospecção foram isoladas 41 linhagens de actinobactérias endofíticas de duas espécies de Asteraceae (Thitonia diversifolia e Lychnophora ericoides). A identificação através do sequenciamento de DNAr indicou predominância do gênero Streptomyces. As linhagens foram cultivadas em meio de arroz e os extratos etanólicos submetidos aos ensaios de citotoxicidade frente a células tumorais e antimicrobiano. Um total de 58,5% dos extratos apresentou atividade em pelo menos um dos ensaios realizados. Foram selecionadas as linhagens Streptomyces cattleya RLe 4 e Streptomyces sp. RLe 8 para cultivo em escala ampliada, isolamento e identificação de metabólitos bioativos. O isolamento dos compostos foi realizado através de diferentes técnicas cromatográficas e a identificação estrutural foi baseada em dados de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C e espectrometria de massas. De S. cattleya RLe 4 foram isolados quatro compostos: 2-hidroxibenzamida, desferrioxamina E, 1-(3\',4\'-dimetoxifenil)-1-propanona e 1-(3\',4\'-dimetoxifenil)-1-etanona. Dos extratos de Streptomyces sp. RLe 8 foram isolados dez compostos: benzamida, 3- hidroxibenzamida, 3-hidróxi-4-metoxibenzamida, 4-hidróxi-3-metoxibenzamida, 3,4- dimetoxibenzamida, 2-fenilacetamida, dois isômeros de 3,4-diidro-3,4,6,8-tetraidróxi-1(2H)- naftalenona, 2,3-diidro-2,2-dimetil-4(1H)-quinazolinona e desferrioxamina B. O composto 2,3-diidro-2,2-dimetil-4(1H)-quinazolinona apresentou elevada atividade frente as células de câncer de cólon (HCT-8) e glioblastoma (SF295), com 93,9 % e 87.0 % de inibição, respectivamente. O outro enfoque da tese envolveu a otimização da produção de sesquiterpenos aristoloquenos por linhagens de B. cinerea, seguido de estudo biossintético destes produtos naturais através de experimentos de incorporação de precursores isotopicamente enriquecidos com 2H (deutério) e 13C (carbono treze). As análises dos dados obtidos de RMN de 2H e de 13C do sesquiterpeno majoritário indicaram que a biossíntese desta substância ocorre pela via do mevalonato (MVA). Os resultados também sugeriram o possível envolvimento da via do metil-eritritolfosfato ou 1-desoxi-D-xilulose-fosfato (MEP/DPX) na biossíntese deste sequiterpeno. Estes resultados podem contribuir para o planejamento racional de fungicidas seletivos com aplicação na agricultura. O trabalho desenvolvido mostrou o grande potencial de actinobactérias endofíticas para a obtenção de moléculas bioativas e que estudos usando precursores isotopicamente marcados fornecem informações precisas acerca da origem biossintética de produtos naturais. / The microbial biodiversity from different ecosystems has incited chemical and biological studies with microorganisms from several habitats, leading to the isolation of bioactive natural products with applications in medicine, chemical industry and agriculture, and thus contributing to a better quality of life. This thesis aimed the biopropecting on endophytic actinobacteria and their natural products, and also the biosynthetic study of aristolochene sesquiterpenes in the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea. A total of 41 actinobacterial strains were isolated of two Asteraceae species (Thitonia diversifolia and Lychnophora ericoides) for the bioprospecting study. The rDNA sequencing showed predominancy of Streptomyces genus. All the strains were cultured on rice medium, and the ethanolic extracts were screened in cytotoxity and antimicrobial assays. As a result, 58.5% of the extracts showed activity in al least one bioassay. The strains Streptomyces cattleya RLe 4 and Streptomyces sp. RLe 8 were selected for scale up cultures, isolation and identification of bioactive compounds. Different chromatographic methods were applied for the isolation of compounds, and structural analysis were based on 1H and 13C nuclear magnetic resonance and mass spectrometry data. Four compounds were isolated from S. cattleya RLe 4: 2- hydroxybenzamide, desferrioxamine E, 1-(3\',4\'-dimethoxyphenyl)-1-propanone, and 1-(3\',4\'- dimethoxyphenyl)-1-etanone. Ten compounds were isolated from Streptomyces sp. Rle 8: benzamide, 3-hydroxybenzamide, 3-hydroxy-4-methoxybenzamide, 4-hydroxy-3- methoxybenzamide, 2-phenylacetamide, two isomers of 3,4-dihydro-3,4,6,8-tetrahydroxy- 1(2H)-naphthalenone, 2,3-dihydro-2,2-dimethyl-4(1H)-quinazolinone, and desferrioxamine B. Compound 2,3-dihydro-2,2-dimethyl-4(1H)-quinazolinone showed high antiproliferative activity against colon cancer cells (HCT-8) and glioblastoma cells (SF295), with 93.9 and 87.0% of inhibition, respectively. The second focus of the thesis involved the optimization of aristolochene sesquiterpenes production by two strains of B. cinerea, followed by the biosynthetic study through feeding experiments with 2H (deuterium) and 13C isotopically labeled precursors. The 2H and 13C NMR obtained data showed that the biosynthesis of the sesquiterpene proceeds by the mevalonate pathway (MVA). The results also suggested the possible participation of the non mevalonate pathway, methylerytritol phosphate ou 1-deoxy- D-xylulose phosphate (MEP/DXP), in the biosynthesis. These results might contribute to the rational design of selective fungides with application in agriculture. This thesis showed the endophytic actinobacteria as promising sources of bioactive natural products, and also showed that the isotopically labeled feeding experiments give reliable information about the natural products biosynthetic pathways.

Grandes esforços têm sido empreendidos para preservar recursos naturais e desenvolver sistemas de produção agrícola mais sustentáveis, reduzindo o uso de fertilizantes. Uma das alternativas ao uso de fertilizantes nitrogenados na agricultura são os inoculantes com bactérias diazotróficas. Os micro-organismos diazotróficos mais estudados para produção de inoculantes são os simbiontes noduladores de leguminosas. Para outros grupos de plantas, os diazotróficos mais utilizados são assimbióticos. Estudos conduzidos na Mata Atlântica e na Amazônia tem mostrado que a fixação biológica de nitrogêncio (FBN) assimbiótica associada a filosfera pode contribuir com aportes de N significativos, e que esses biomas podem abrigar uma grande diversidade de bactérias diazotróficas, sendo ambientes apropriados para prospectar diazotróficos eficientes para o uso na agricultura. O objetivo deste trabalho foi isolar novos genótipos de bactérias diazotróficas assimbióticas da filosfera e serapilheira de espécies arbóreas da floresta Amazônica, e estimar suas taxas de FBN e de síntese de ácido indolacético in vitro, bem como identificar taxonomicamente os isolados considerados mais promissores para uso biotecnológico. Bactérias diazotróficas de vida-livre foram isoladas da filosfera e serapilheira de três espécies arbóreas (Rinorea pubiflora, Amphirrhox longifolia e Chamaecrista xinguensis), e cultivadas em meio isento de N. Um total de 86 isolados foram obtidos. A taxa de fixação de nitrogênio foi estimada para todos os isolados, através do ensaio de redução de acetileno (ARA), pelo complexo nitrogenase. Para todos os isolados, também foi determinada a taxa de produção de ácido indolacético (AIA), na presença de L-triptofano. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott e pelo teste de Duncan (p<0,05), através do software estatístico R. Os isolados que apresentaram as maiores taxas de redução de acetileno e de síntese de AIA foram identificados através do sequenciamento parcial do gene rRNA 16S. Cerca de 84,8% dos isolados apresentaram atividade de nitrogenase in vitro, e o teste estatístico desmonstrou não haver diferenças significativas entre as taxas de redução de acetileno entre os isolados, exceto o isolado 10RF, o qual apresentou uma taxa de redução de acetileno maior do que a dos demais isolados (p<0,05). Todos os isolados produziram AIA in vitro, e houve diferenças significativas na síntese de AIA entre os isolados, e quanto origem dos mesmos. Isolados bacterianos de Amphirrox longifolia sintetizaram mais AIA in vitro, em comparação aos isolados das outras duas espécies arbóreas. Cerca de 22% dos isolados apresentaram taxas de fixação de nitrogêncio maiores que 0.025ng N &mu;g-1 h-1, e 20% dos isolados produziram mais de 21,87 &mu;g/mL-1 de AIA. 21 isolados, considerados promissores para uso agrícola (fixadores de N e produtores de AIA), foram identificados através do sequenciamento do gene rRNA 16S, e afiliados aos gêneros Pseudomonas, Bacillus, Burkholderia, Citrobacter, Rhizobium e Stenotrophomonas. Aproximadamente 71 % dos isolados considerados promissores para promoverem o crescimento de plantas foram isolados da filosfera, indicando ser este um ambiente propício à prospecção de bactérias diazotróficas promotoras de crescimento de plantas. / Great efforts have been made to preserve natural resources and develop more sustainable agricultural production systems, reducing the use of fertilizers. One of the alternatives to the use of nitrogen fertilizers in agriculture is the use of inoculants with diazotrophic bacteria. The most studied diazotrophic microorganisms for the production of inoculants are nodule-forming symbionts of legumes. For other groups of plants, the most used diazotrophs are asymbiotic. Several studies in the Atlantic and Amazon forests have shown that the biological nitrogen fixation (BNF) associated with the phyllosphere may contribute with significant N inputs, and that these biomes can harbor a great diversity of diazotrophic bacteria, making them important environments for the prospection of efficient diazotrophs for agricultural use. The objective of this work was to isolate new genotypes of asymbiotic diazotrophic bacteria from the phyllosphere and litter of tree species of the Amazon forest, and to estimate their rates of BNF and indoleacetic acid biosynthesis in vitro, as well as to identify taxonomically the most promising isolates for biotechnological use. Asymbiotic diazotrophic bacteria were isolated from the phyllosphere and litter of three tree species (Rinorea pubiflora, Amphirrhox longifolia and Chamaecrista xinguensis), and cultivated in N-free medium. A total of 86 isolates were obtained. The nitrogen fixation rate was estimated for all isolates measuring the nitrogenase activity by the acetylene reduction assay (ARA). The rates of indoleacetic acid (IAA) production in the presence of L-tryptophan was also determined for all isolates. The data obtained were submitted to analysis of variance and the means were compared by the Scott-Knott test and the Duncan test (p<0.05) using the statistical software R. The isolates showing the highest rates of acetylene reduction and IAA biosynthesis were identified through the partial sequencing of the 16S rRNA gene. Approximately 84.8% of the isolates were positive for nitrogenase activity in vitro, and the statistical analyses showed that there were no significant differences between the acetylene reduction rates among the isolates, except the isolate 10RF, which showed a higher acetylene reduction rate than the other isolates (p<0.05). All isolates produced IAA in vitro, and there were significant differences in the biosynthesis rates among the isolates, as well as regarding the origin of the isolate. Bacterial isolates from Amphirrox longifolia synthesized higher amounts of IAA in vitro as compared to the isolates from the other two tree species. Approximately 22% of the isolates showed nitrogen fixation rates greater than 0.025 ng N &mu;g-1 h-1, and 20% of the isolates produced more than 21.87 &mu;g mL-1 of IAA. 21 isolates, considered promising for agricultural use (N-fixers and IAA producers), were identified by sequencing the 16S rRNA gene, and affiliated to the genera Pseudomonas, Bacillus, Burkholderia, Citrobacter, Rhizobium and Stenotrophomonas. Approximately 71% of the isolates considered promising to promote plant growth were isolated from the phyllosphere, suggesting that this environment is propitious to the prospection of diazotrophic plant growth promoting bacteria.