La microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) se usa como técnica alternativa de análisis químico, donde las aplicaciones dependen directamente de la sensibilidad del cristal. Por tanto, es el parámetro más importante que determina el uso de los cristales de cuarzo frente a otras técnicas. La ecuación de Sauerbrey, teóricamente relaciona la variación de la densidad de masa en la superficie del cristal con el cambio de la frecuencia y al mismo tiempo predice que la sensibilidad aumenta en la misma proporción que el cuadrado de la frecuencia fundamental de resonancia serie del cristal. Aumentar la frecuencia fundamental de trabajo para aumentar la sensibilidad, es una necesidad; el objetivo principal de esta tesis doctoral es estudiar los sistemas de caracterización de resonadores de cuarzo, que se usan en la actualidad y proponer un sistema o una mejora a los ya existentes que permitan el uso de cristales de cuarzo de alta frecuencia de fundamental (HFF-QCM). De los sistemas que en la actualidad caracterizan a la microbalanza de cuarzo, se destacan los analizadores de impedancia y los osciladores, como métodos de caracterización de HFF-QCM. Los analizadores, por su gran tamaño y coste, quedan relegados a su uso como instrumento de referencia en el laboratorio. Los osciladores en cambio, por su bajo coste, su capacidad de integración, su sencillez del circuito y la monitorización continua de frecuencia de oscilación, lo hacen adecuados como interfaz para sistemas sensores basados en QCM. En esta tesis, se propone un sistema oscilador, basado en un oscilador diferencial equilibrado, como sistema de caracterización de cristales a 10 MHz, estudiándose el comportamiento del circuito, la capacidad de este sistema para compensar la capacitancia paralela del cristal, las aplicación de este tipo de interfaz para la caracterización de líquidos y finalmente se desarrollo una aplicación como inmunosensores piezoeléctricos para la detección del pesticida Carbaryl. / Montagut Ferizzola, YJ. (2011). Sistema Oscilador Mejorado para Aplicaciones de Microbalanza (QCM) en Medios Líquidos y Propuesta de un Nuevo Método de Caracterización para Biosensores Piezoeléctricos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/9688

No / A PDMS stamp is used to transfer a synthetic peptide in a given pattern to any suitable surface. Using this method two-dimensional neuronal model networks could be formed on glass substrates as well as on electronic devices and adjusted to the given microelectronic structure. The present work focuses on the mechanism of neurite guidance under simplified in vitro conditions, using in vitro guidance cues and outline the incorporation of these interfacial methods into microelectronic sensor devices.

Stroke is a chronic illness which often impairs survivors for extended periods of time, leaving the individual limited in motor function. The ability to perform daily activities (ADL) is closely linked to motor recovery following a stroke. The objective of this work is to employ surface electromyography (sEMG) gathered through a novel, wearable armband sensor to monitor and quantify ADL performance. The first contribution of this work seeks to develop a relationship between sEMG and and grip aperture, a metric tied to the success of post-stroke individuals’ functional independence. The second contribution of this work aims to develop a deep learning model to classify RTG movements in the home setting using continuous EMG and acceleration data. In contribution one, ten non-disabled participants (10M, 22.5 0.5 years) were recruited. We performed a correlation analysis between aperture and peak EMG value, as well as a one-way non parametric analysis to determine cylinder diameter effect on aperture. In contribution two, one non-disabled participant is instructed to wash a set of dishes. The EMG and acceleration data collected is input into a recurrent neural network (RNN) machine learning model to classify movement patterns. The first contribution’s analysis demonstrated a strong positive correlation between aperture and peak EMG value, as well as a statistically significant effect of diameter (p < 0.001). The RNN model built in contribution two demonstrated high capability at classifying movement at 94% accuracy and an F1-score of 86%. These results demonstrate promising feasibility for long-term, in-home classification of daily tasks. Future applications of this approach should consider extending the procedure to include post-stroke individuals, as this could offer valuable insight into motor recovery within the home setting.

Tesis por compendio / [ES] En esta tesis se ha abordado el desarrollo de biosensores ópticos label-free, basados en tecnología de disco compacto, permitiendo así abaratar y simplificar su fabricación. El trabajo llevado a cabo ha consistido en estudiar diferentes propiedades físico-químicas desarrolladas por diversos materiales. Ello ha permitido obtener sistemas compactos y accesibles, capaces de sensar con buenas prestaciones analíticas en diferentes escenarios. En el capítulo 1 se presenta un estudio de inhibición enzimática sobre discos Blu-ray como plataforma de ensayo para el cribado de fármacos. Para ello, se inmoviliza orientadamente una glicoenzima, de la familia de las peroxidasas sobre la superficie del disco, cuya actividad se relaciona con los compuestos a cribar. Después de ensayar cada compuesto, se determina el grado de inhibición enzimática mediante la adición de un sustrato. La cantidad de producto obtenido, inversamente proporcional al potencial inhibitorio del compuesto en estudio, es cuantificado con un lector de discos que registra las variaciones en la intensidad del haz laser reflejado debidas al producto enzimático. Ello permite realizar más de 1700 ensayos simultáneos en un único disco Blu-ray lo que muestra su potencial en análisis masivo de alto rendimiento. Además, se plantea una estrategia basada en hipersuperficies para el análisis de la elevada cantidad de datos que se generan en las etapas del proceso de descubrimiento de fármacos. En el capítulo 2 se aborda el estudio de una metodología para reducir el ruido generado en la lectura de resultados obtenidos con biosensores ópticos, mejorando así su sensibilidad. Para ello, se plantea la estructuración del ensayo en forma de franjas en lugar del tradicional microarray, generando una señal periódica sinusoidal al ser escaneadas. Al analizar dicha señal en dominio de frecuencias, ésta se concentra en un pico a la frecuencia del ensayo, mientras que la mayor parte del ruido aparece a frecuencias mucho más altas. Inicialmente se quería reducir al máximo el ruido, para diferenciar las interacciones moleculares en formato label free. Sin embargo, los ensayos realizados con discos DVD no generaron suficiente señal, teniendo que recurrir en esta ocasión al marcaje para la cuantificación de inmunoglobulinas G y de caseína. Pese a ello, la metodología desarrollada también se puede aplicar en biosensores tipo label-free, reduciendo el ruido y mejorando su sensibilidad. El capítulo 3 se centra en el desarrollo de sustratos interferométricos multicapa que varían la intensidad de la luz reflejada al realizar un ensayo analítico en su superficie. Los sustratos fueron fabricados utilizando los materiales que componen los DVD-RW, depositados en capas de espesor controlado con el fin de obtener la máxima respuesta. A su vez, se diseñaron de tal forma que uno de ellos disminuya la intensidad del haz reflejado como respuesta a las interacciones moleculares, mientras que el otro la aumenta. El trabajo incluye la utilización de principios y materiales de la tecnología de disco compacto para el desarrollo del sistema de detección. Para ello, se emplea el cabezal de un lector de DVD, ya que dispone de un láser y de todos los elementos ópticos necesarios para el escaneado vertical. Con este sistema se cuantifican con éxito y sin marcaje inmunoglobulinas G y sulfasalazina, una macromolécula y un fármaco de masa molecular reducida. El capítulo 4 consiste en la fabricación de un cristal fotónico utilizando la estructura de los discos compactos cubiertos con una película de óxido de titanio. Se han estudiado las propiedades físico-químicas de estos sustratos y se han caracterizado sus propiedades fotónicas. Todo ello está en concordancia con los resultados obtenido mediante simulaciones. Para interrogar los cristales fotónicos fueron necesarios una fuente de luz blanca y un espectrofotómetro, además de los elementos ópticos necesarios / [CA] En aquesta tesi s'ha abordat el desenvolupament de biosensors òptics label-free, basats en tecnologia de disc compacte, permetent així abaratir i simplificar la seua fabricació. El treball dut a terme ha consistit en estudiar diferents propietats fisicoquímiques desenvolupades per diversos materials. Això ha permès obtenir sistemes compactes i accessibles, capaços de sensar, amb bones prestacions analítiques, en diferents escenaris. En el capítol 1 es presenta un estudi d'inhibició enzimàtica sobre discos Blu-ray com a plataforma d'assaig per al cribratge de fàrmacs. Per a això, s'immobilitza de manera orientada una glicoenzima de la família de les peroxidases sobre la superfície del disc, i la seua activitat es relaciona amb els compostos a garbellar. Després d'assajar cada compost, es determina el grau d'inhibició enzimàtica mitjançant l'addició d'un substrat. La quantitat de producte obtingut, inversament proporcional al potencial inhibitori del compost en estudi, és quantificat amb un lector de discos que registra les variacions en la intensitat del làser reflectit degudes al producte enzimàtic. Això permet realitzar més de 1700 assajos simultanis en un únic disc Blu-ray el que mostra el seu potencial en anàlisi massiva d'alt rendiment. A més, es planteja una estratègia basada en hipersuperficies per a l'anàlisi de l'elevada quantitat de dades que es generen en les etapes del procés de descobriment de fàrmacs. En el capítol 2 s'aborda l'estudi d'una metodologia per reduir el soroll generat en la lectura de resultats obtinguts amb biosensors òptics, millorant així la seua sensibilitat. Per a això, es planteja l'estructuració de l'assaig en forma de franges en lloc del tradicional microarray, generant un senyal periòdic sinusoïdal en ser escanejades. En analitzar aquest senyal en domini de freqüències, aquesta es concentra en un pic a la freqüència de l'assaig, mentre que la major part del soroll apareix a freqüències molt més altes. Inicialment es volia reduir al màxim el soroll, per diferenciar les interaccions moleculars en format label-free. No obstant això, els assajos realitzats amb discos DVD no van generar prou senyal, havent de recórrer en aquesta ocasió al marcatge per a la quantificació d'immunoglobulines G i de caseïna. Malgrat això, la metodologia desenvolupada també es pot aplicar en biosensors tipus label-free, reduint el soroll i millorant la seua sensibilitat. El capítol 3 es centra en el desenvolupament de substrats interferometrics multicapa que varien la intensitat de la llum reflectida en realitzar un assaig analític en la seua superfície. Els substrats van ser fabricats utilitzant els materials que componen els DVD-RW, dipositats en capes de gruix controlat per tal d'obtenir la màxima resposta. Al seu torn, es van dissenyar de tal manera que un d'ells disminueixi la intensitat del feix reflectit com a resposta a les interaccions moleculars, mentre que l'altre l'augmenta. El treball inclou la utilització de principis i materials de la tecnologia de disc compacte per al desenvolupament del sistema de detecció. Per a això, es va utilitzar el capçal d'un lector de DVD, ja que disposa d'un làser i de tots els elements òptics necessaris per a l'escanejat vertical. Amb aquest sistema es quantifiquen amb èxit i sense marcatge immunoglobulines G i sulfasalazina, un macromolècula i un fàrmac de massa molecular reduïda. El capítol 4 consisteix en la fabricació d'un cristall fotònic utilitzant l'estructura dels discos compactes coberts amb una pel·lícula d'òxid de titani. S'han estudiat les propietats fisicoquímiques d'aquests substrats i s'han caracteritzat les propietats fotòniques. Tot això està en concordança amb els resultats obtingut mitjançant simulacions. Per interrogar els cristalls fotònics van ser necessaris una font de llum blanca i un espectrofotòmetre, a més dels elements òptics necessaris per guiar la llum. / [EN] In this thesis the development of label-free optical biosensors, based on compact disc technology, has been approached, thus making their manufacture cheaper and simpler. The work carried out has consisted of studying different physical-chemical properties manifested with several materials. This has allowed to obtain compact and accessible systems, capable of sensing with a great analytical performance in different scenarios. Chapter 1 presents an enzymatic inhibition study on Blu-ray discs as a test platform for drug screening. For this purpose, a glycoenzyme of the peroxidase family is immobilized on the surface of the disc whose activity is related to the compounds to be screened. After testing each compound, the degree of enzymatic inhibition is determined by adding the enzymatic substrate. The amount of product obtained is inversely proportional to the inhibitory potential of the compound, and is quantified with a disk reader that records the variations in the intensity of the reflected laser beam due to the enzymatic product. In addition, more than 1700 tests are performed on a single Blu-ray disc as proof of concept for application in high performance analysis and a hypersurface based strategy is proposed for the analysis of the large amount of data generated in the stages of the drug discovery process. Chapter 2 deals with the study of a methodology to reduce noise generated in the reading of results obtained with optical biosensors, hence improving their sensitivity. For this purpose, the structure of the test is proposed in the form of stripes instead of the traditional microarray, generating a sinusoidal periodic signal when they are scanned. When analysing this signal in frequency domain, it is concentrated in a peak at the frequency of the test, while most of the noise appears at much higher frequencies. Initially, the aim was to reduce noise as much as possible in order to differentiate molecular interactions in a label-free format. However, the tests carried out on a DVD did not generate enough signal, having to resort to labelling on this occasion for the quantification of immunoglobulins G and casein. Nevertheless, the methodology developed can be applied to label-free biosensors, reducing noise and improving sensitivity. Chapter 3 focuses on the development of multilayer interferometric substrates that vary the intensity of reflected light when performing an analytical test on their surface. The substrates were manufactured using the materials that make up the DVD-RW, deposited in layers of controlled thickness in order to obtain maximum response. At the same time, they were designed in such a way that one of them decreased the intensity of the reflected beam as a response to molecular interactions, while the other increased it. The work includes the use of principles and materials from compact disc technology for the development of the detection system. For this, the head of a DVD reader is used, as it has a laser and all the optical elements necessary for vertical scanning. With this system, immunoglobulins G and sulfasalazine, a macromolecule and a drug with reduced molecular mass are successfully quantified without labelling. Chapter 4 consists of the fabrication of a photonic crystal using the structure of the compact discs covered with a titanium oxide layer. The physical-chemical properties of these substrates have been studied and their photonic properties have been characterized. All this is in accordance with the results obtained through simulations. To interrogate the photonic crystals, a white light source and a spectrophotometer were needed, as well as the optical elements necessary to guide the light. / Sancho Fornés, G. (2019). Integración de diferentes fenómenos fotónicos en tecnología de disco compacto para el desarrollo de biosensores label-free [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/124819 / Compendio

Whole-cell sensors represent an emerging branch in biosensor development since they obviate the need for enzyme/antibody purification and provide the unique opportunity to assess global parameters such as genotoxicity and bioavailability. Yeast species such as Saccharomyces cerevisiae are ideal hosts for whole-cell sensor applications. However, current approaches almost exclusively rely on analyte-induced expression of fluorescent proteins or luciferases that imply issues with light scattering and/or require the supply of additional substrates. In this study, the yeast α-factor mating pheromone, a peptide pheromone involved in cell-cell communication in Saccharomyces cerevisiae, was utilized to create the whole-cell sensor read-out signal, in particular by employing engineered sensor cells that couple the response to a user-defined environmental signal to α-factor secretion. Two novel immunoassays - relying on hydrophobin-based surface engineering - were developed to quantify the α-factor. Hydrophobins are amphiphilic fungal proteins that self-assemble into robust monolayers at hydrophobic surfaces. Two recombinant hydrophobins, either lacking (EAS) or exposing the α-factor pheromone (EAS-α) upon self-assembly, were used to functionalize polystyrene supports. In a first approach (competitive immunoassay), pheromone-specific antibodies initially bound to the functionalized surface (due to the α-factor exposed by the hydrophobin layer) were competitively detached by soluble α-factor. In a second approach, the antibodies were first premixed with pheromone-containing samples and subsequently applied to functionalized surfaces, allowing for the attachment of antibodies that still carried available binding sites (inverse immunoassay). Both immunoassays enabled quantitative assessment of the yeast pheromone in a unique but partially overlapping dynamic range and allowed for facile tuning of the assay sensitivity by adjustment of the EAS-α content of the hydrophobin layer. With a limit of detection of 0.1 nM α-factor, the inverse immunoassay proved to be the most sensitive pheromone quantification assay currently available. Due to the high stability of hydrophobin monolayers, functionalized surfaces could be reused for multiple consecutive measurements. Favorably, both immunoassays proved to be largely robust against the changes in the sample matrix composition, allowing for pheromone quantification in complex sample matrices such as yeast culture supernatants. Hence, these immunoassays could also be applied to study the pheromone secretion of wild-type and engineered Saccharomyces cerevisiae strains. Additionally, a proof-of-concept whole-cell sensor for thiamine was developed by combining the hydrophobin-based immunoassays with engineered sensor cells of Schizosaccharomyces pombe modulating the secretion of the α-factor pheromone in response to thiamine. Since this read-out strategy encompasses intrinsic signal amplification and enables flexible choice of the transducer element, it could contribute to the development of miniaturized, portable whole-cell sensors for on-site application.

In this thesis, different aspects within the research field of protein spectro- and electro-chemistry on nanostructured materials are addressed. On the one hand, this work is related to the investigation of nanostructured transparent and conductive metal oxides as platform for the immobilization of electroactive enzymes. On the other hand the second part of this work is related to the immobilization of sulfite oxidase on gold nanoparticles modified electrode. Finally direct and mediated spectroelectrochemistry protein with high structure complexity such as the xanthine dehydrogenase from Rhodobacter capsulatus and its high homologues the mouse aldehyde oxidase homolog 1. Stable immobilization and reversible electrochemistry of cytochrome c in a transparent and conductive tin-doped and tin-rich indium oxide film with a well-defined mesoporosity is reported. The transparency and good conductivity, in combination with the large surface area of these materials, allow the incorporation of a high amount of electroactive biomolecules (between 250 and 2500 pmol cm-2) and their electrochemical and spectroscopic investigation. Both, the electrochemical behavior and the immobilization of proteins are influenced by the geometric parameters of the porous material, such as the structure and pore shape, the surface chemistry, as well as the protein size and charge. UV-Vis and resonance Raman spectroscopy, in combination with direct protein voltammetry, are employed for the characterization of cytochrome c immobilized in the mesoporous indium tin oxide and reveal no perturbation of the structural integrity of the redox protein. A long term protein immobilization is reached using these unmodified mesoporous indium oxide based materials, i.e. more than two weeks even at high ionic strength. The potential of this modified material as an amperometric biosensor for the detection of superoxide anions is demonstrated. A sensitivity of about 100 A M-1 m-2, in a linear measuring range of the superoxide concentration between 0.13 and 0.67 μM, is estimated. In addition an electrochemical switchable protein-based optical device is designed with the core part composed of cytochrome c immobilized on a mesoporous indium tin oxide film. A color developing redox sensitive dye is used as switchable component of the system. The cytochrome c-catalyzed oxidation of the dye by hydrogen peroxide is spectroscopically investigated. When the dye is co-immobilized with the protein, its redox state is easily controlled by application of an electrical potential at the supporting material. This enables to electrochemical reset the system to the initial state and repetitive signal generation. The case of negative charged proteins, which does not have a good interaction with the negative charged indium oxide based films, is also explored. The modification of an indium tin oxide film with a positive charged polymer and the employment of a antimony doped tin oxide film were investigated in this work in order to overcome the repulsion induced by similar charges of the protein and electrode. Human sulfite oxidase and its separated heme-containing domain are able to direct exchange electrons with the supporting material. A study of a new approach for sulfite biosensing, based on enhanced direct electron transfer of a human sulfite oxidase immobilized on a gold nanoparticles modified electrode is reported. The spherical gold nanoparticles were prepared via a novel method by reduction of HAuCl4 with branched poly(ethyleneimine) in an ionic liquid resulting in particles of about 10 nm in hydrodynamic diameter. These nanoparticles were covalently attached to a mercaptoundecanoic acid modified Au-electrode and act as platform where human sulfite oxidase is adsorbed. An enhanced interfacial electron transfer and electrocatalysis is therefore achieved. UV-Vis and resonance Raman spectroscopy, in combination with direct protein voltammetry, were employed for the characterization of the system and reveal no perturbation of the structural integrity of the redox protein. The proposed biosensor exhibited a quick steady-state current response, within 2 s and a linear detection range between 0.5 and 5.4 μM with high sensitivity (1.85 nA μM-1). The investigated system provides remarkable advantages, since it works at low applied potential and at very high ionic strength. Therefore these properties could make the proposed system useful in the development of bioelectronic devices and its application in real samples. Finally protein with high structure complexity such as the xanthine dehydrogenase from Rhodobacter capsulatus and the mouse aldehyde oxidase homolog 1 were spectroelectrochemically studied. It could be demonstrated that different cofactors present in the protein structure, like the FAD and the molybdenum cofactor, are able to directly exchange electrons with an electrode and are displayed as a single peak in a square wave voltammogram. Protein mutants bearing a serine substituted to the cysteines, bounding to the most exposed iron sulfur cluster additionally showed direct electron transfer which can be attributable to this cluster. On the other hand a mediated spectroelectrochemical titration of the protein bound FAD cofactor was performed in presence of transparent iron and cobalt complex mediators. The results showed the formation of the stable semiquinone and the fully reduced flavin. Two formal potentials for each single electron exchange step were then determined. / In dieser Arbeit werden verschiedenen Aspekte im Forschungsfeld der Protein-Spekro- und Elektro-Chemie an nanostrukturierte Materialien behandelt. Zum einen werden in dieser Arbeit nanostrukturierte, transparente und leitfähige Metalloxide als Basis für die Immobilisierung von elektroaktiven Enzym untersucht. Des Weiteren behandelt diese Arbeit die Immobilisierung von humaner Sulfitoxidase auf einer Gold-Nanopartikel-modifizierten Elektrode. Schließlich wird die direkte und die vermittelte Elektrochemie von Xanthindehydrogenase aus Rhodobacter capsulatus und Aldehydoxidase Homolog 1, aus Mause, vorgestellt. Im ersten Teil der Arbeit wird über die stabile Immobilisierung und reversible Elektrochemie von Cytochrom c in einem transparenten und leitfähigen Zinn-dotierten und Zinn-reichen Indiumoxid Film mit einer gut definierten Mesoporosität berichtet. Die Transparenz und gute Leitfähigkeit in Kombination mit der großen Oberfläche dieser Materialien erlauben die Inkorporation einer große Menge elektroaktiver Biomoleküle (zwischen 250 und 2500 pmol cm-2) und deren elektrochemische und spektroskopische Untersuchung. Das elektrochemische Verhalten und die Proteinimmobilisierung sind durch die geometrischen Parameter des porösen Materials, wie die Struktur und Porenform, die Oberflächenchemie, sowie die Größe und Ladung des Proteins beeinflusst. UV-Vis und Resonanz-Raman-Spektroskopie in Kombination mit direkter Protein-Voltammetrie werden für die Charakterisierung von Cytochrom c eingesetzt und zeigen keine Störung der strukturellen Integrität des Redox-Proteins durch die Immobilisierung. Eine langfristige Immobilisierung des Proteins von mehr als zwei Wochen auch bei hoher Ionenstärke wurde unter Verwendung dieser unmodifizierten mesoporösen Indiumoxid-basierten Materialien erreicht. Das Potential dieses modifizierten Materials für die Verwendung in einem amperometrischen Biosensor zum Nachweis von Superoxid-Anionen wurde aufgezeigt. Es wurde eine Empfindlichkeit von etwa 100 A M-1 m-2, in einem linearen Messbereich der Superoxidkonzentration zwischen 0,13 und 0,67 µM, erreicht. Außerdem wurde ein elektrochemisch umschaltbares Protein-basiertes optisches Gerät konzipiert mit Cytochrom c und der mesoporösen Indiumzinnoxidschicht. Ein redox-sensitiver Farbstoff wurde als schaltbare Komponente des Systems verwendet. Die Cytochrom c Oxidation des Farbstoffs durch Wasserstoffperoxid wurde spektroskopisch untersucht. Der Redox-Zustand des Farbstoffs, co-immobilisiert mit dem Protein, ist leicht durch das Anlegen eines elektrischen Potentials an das Trägermaterial kontrollierbar. Dadurch wird die elektrochemische Zurücksetzung des Systems auf den Anfangszustand und eine repetitive Signalerzeugung ermöglicht. Für negativ geladene Proteine, die keine gute Interaktion mit dem negativ geladenen Indiumoxid-basierten Film zeigen wurden die Modifikation der Indiumzinnoxidschicht mit einem positiv geladenen Polymer sowie die Verwendung eines Antimon-dotierten Zinnoxid Films vorgeschlagen. Dadurch konnte die Abstoßung induziert durch die ähnliche Ladung des Proteins und der Elektrode überwunden werden. Es gelang für die humane Sulfit-Oxidase und die separate Häm-haltige Domäne der Austausch von Elektronen mit dem Trägermaterial. Im zweiten Teil der Arbeit wird über eine neue Methode für die Biosensorik von Sulfit berichtet, bei der direkte Elektronentransfer von humaner Sulfitoxidase immobilisierten auf einer mit Gold-Nanopartikeln modifizierten Elektrode verstärkt wurde. Die sphärischen Gold-Nanopartikeln, von etwa 10 nm im Durchmesser, wurden über eine neue Methode durch Reduktion von HAuCl4 mit verzweigtem Polyethylenimin in einer ionischen Flüssigkeit synthetisiert. Diese Nanopartikel wurden kovalent an eine mit Mercaptoundecansäure modifizierten Gold-Elektrode immobilisiert und dienen als Basis für die Adsorption von Sulfitoxidase adsorbiert wurde. Dadurch wurde ein schneller heterogener Elektronen-Transfer und verbesserte Elektrokatalyse erreicht. Für die Charakterisierung des verwendeten Systems eingesetzt wurden UV-Vis und Resonanz-Raman-Spektroskopie in Kombination mit direkter Protein-Voltammetrie. Es wurde keine Störung der strukturellen Integrität des Redox-Proteins beobachtet. Der vorgeschlagene Biosensor zeigte eine schnelle steady-state Stromantwort innerhalb von 2 s, eine lineare Detektion im Bereich zwischen 0,5 und 5,4 µM Sulfit mit einer hohen Empfindlichkeit (1,85 nA µM-1). Das untersuchte System bietet bemerkenswerte Vorteile da es ermöglicht bei niedriger angelegter Spannung und bei sehr hoher Ionenstärke zu arbeiten. Aufgrund dieser Eigenschaften hat das vorgeschlagene System großes Potential für die Entwicklung von bioelektronischen Geräten und der Anwendung in realen Proben. Schließlich werden im letzten Teil der Arbeit die komplexeren Enzymen Xanthindehydrogenase aus Rhodobacter capsulatus und Maus Aldehydoxidase Homolog 1 spektro- und elektrochemisch untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass verschiedene Kofaktoren in der Proteinstruktur, wie FAD und der Molybdän Kofaktor direkt Elektronen mit einer Elektrode austauschen können, was durch einzelne Peaks im Square Wave Voltammogramm angezeigt wird. Es konnte eine zusätzliche redoxaktive Gruppe mit direktem Elektronen-Transfer nach Austausch eines Cysteins durch Serin am exponierten Eisen-Schwefel-Cluster gezeigt werden. Außerdem wurde eine vermittelte spektroelektrochemische Titration des FAD-Kofaktors in Anwesenheit von Mediatoren der Klasse der Eisen und Kobalt-Komplexe durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass FAD in R. capsulatus XDH zu einem stabilen Semichinone reduziert werden kann. Es gelang die formalen Potentiale für die zwei einzigen Elektrontransferprozesse zu bestimmen.

The aim of this work was to functionalize silicon dioxide surfaces with biochemical molecules in such a way that biorecognition of target molecules in solution will be possible. By introducing a tool set of different molecules and characterization methods, a more universal approach towards various biosensor setups is presented. This includes on the one hand preparation of the biosensor surfaces to allow further molecule attachment via their reactive functional groups. Secondly, the selection of chemical molecules providing suitable counterparts for abundant functional groups of potential receptors is discussed. Two detection schemes are introduced – based on an antibody to detect the antibiotic amoxicillin and aptamers to detect thrombin. The antibody was implemented in an inverse competition assay to probe such small target molecules. Antibiotic residues are often present in wastewater. Aptamers, so-called artificial antibodies, were selected as they provide many advantages over antibodies. As a model system, two different thrombin binding aptamers were chosen which allowed to perform sandwich assays as well. The protein thrombin plays an important role in the blood coagulation cascade. To probe the individual modification steps, different techniques for analysis were applied. Surface micropatterning was introduced to improve recognition of modified areas and fluorescence-to-background ratios resulting in a thrombin detection limit down to 20 pM. One important goal was the integration in ion-sensitive field-effect transistor devices. Aptamers are small in size which might enable a higher sensitivity of these devices compared to the use of antibodies because of the Debye layer thickness. As a final step, first measurements towards silicon nanowire based field-effect transistor biosensors were carried out on devices with bottom-up and top-down fabricated nanowires using both proposed receptor-analyte combinations. The potential of these devices as portable sensors for real-time and label-free biosensing is demonstrated. / Ziel dieser Arbeit war es Siliziumdioxidoberflächen so mit biochemischen Molekülen zu funktional- isieren, dass die biologisch spezifische Erkennung von Zielmolekülen in Lösung möglich wird. Hier wird eine Auswahl an geeigneten Molekülen und Charakterisierungsmethoden für einen vielseitigen Ansatz gezeigt, der auf verschiedene Biosensorsysteme anwendbar ist. Das beinhaltet zum Einen die Präparation der Biosensoroberflächen, so dass die Moleküle über reaktive funktionelle Gruppen angebunden werden können. Als zweites ist die Auswahl der chemischen Moleküle wichtig, da diese die passenden Gegenstücke zu potentiellen funktionellen Gruppen der Rezeptoren darstellen. Zwei verschiedene Detektionsvarianten werden eingeführt – Antikörper gegen das Antibiotikum Amoxicillin und Aptamere gegen Thrombin. Der Antikörper wurde in einen inversen Wettbewerbsassay integriert um einen solch kleinen Ana- lyten detektieren zu können. Rückstände von Antibiotika sind häufig in Abwässern zu finden. Ap- tamere, sogenannte künstliche Antikörper, weisen gegenüber Antikörpern viele Vorteile auf. Als ein Modellsystem wurden zwei unterschiedliche Thrombin bindende Aptamere verwendet, was auch die Durchführung von Sandwich Assays ermöglichte. Das Protein Thrombin spielt eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung. Um die einzelnen Modifikationsschritte zu untersuchen, wurden verschiedene Charakterisierungsmethoden angewendet. Die Mikrostrukturierung der Funktionalisierung erleichterte die Erkennung der modifizierten Flächen und verbesserte das Fluoreszenz-zu-Hintergrund Verhältnis. Das führte zu einer Detektionsgrenze von 20 pM für Thrombin. Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit war die Integration der Funktionalisierung in einen ionen-sensitiven Feldeffekttransistor. Die kleinen Aptamere könnten dabei aufgrund der geringen Debye-Schichtdicke bei diesen Sensoren eine höhere Sensitivität als mit Antikörpern ermöglichen. Zuletzt wurden erste Messungen hin zu Silizium Nanodraht basierten Feldeffekttransistor Biosen- soren mit beiden untersuchten Rezeptor-Analyt-Kombinationen durchgeführt. Sowohl die Chips mit bottom-up als auch mit top-down gewachsenen Nanodrähten zeigen dabei ihr Potential als handliche Sensoren zur markerfreien Detektion in Echtzeit.

The term "Lab-on-a-Chip" (LoC) describes highly miniaturized systems in which the functionalities of entire laboratories are scaled down to the size of transportable microchips. Particularly in the field of chemical and bio-analysis, such platforms are desired for a fast and highly sensitive sample analysis at the point of care. This work focuses on silicon nanowire (SiNW) based sensors. Innovative device fabrication concepts are developed from various directions, for a facile and reliable assembly of LoC analysis systems. Firstly, a multifunctional microfluidic set-up is developed which allows for a facile reversible sealing of channel structures on virtually any kind of substrate while maintaining the possibility of a rapid prototyping of versatile channel designs and the applicability of high working pressures of up to 600 kPa. Secondly, a 3-(triethoxysilyl)propylsuccinic anhydride (TESPSA) based surface modification strategy for the attachment of specific receptor molecules without additional binding site passivation is explored. Thirdly, bottom-up grown SiNWs are utilized for producing parallel arrays of Schottky barrier field-effect transistors (FETs) via contact printing. Using the initially developed microfluidic set-up, the concept of the TESPSA-based receptor immobilization is proved via fluorescence microscopy and by applying the SiNW FETs as biosensors. Using a receptor-analyte system based on a set of antibodies and a peptide from human influenza hemagglutinin, it is shown that antibodies immobilized with the developed method maintain the specificity for their antigens. The fourth major research field in this work is the microfluidics-based alignment of one-dimensional nanostructures and their deposition at predetermined trapping sites for reliably fabricating single NW-based FETs. Such devices are expected to provide superior sensitivity over sensors based on parallel arrays of FETs. Consequently, within this work, innovative LoC devices fabrication approaches over a broad range of length scales, from micrometer scale down to the molecular level, are investigated. The presented methods are considered a highly versatile and beneficial tool set not only for SiNW-based biosensors, but also for any other LoC application. / Unter dem Begriff „Lab-on-a-Chip“ (LoC) fasst man stark miniaturisierte Systeme zusammen, die die Fähigkeiten eines ganzen Labors auf einen transportablem Mikrochip übertragen. Insbesondere im Bereich der Analyse chemischer und biologischer Proben werden solche Plattformen bevorzugt eingesetzt, da sie direkt am Ort der Probenentnahme schnelle, hoch sensible Messungen ermöglichen. Im Mittelpunkt dieser Doktorarbeit stehen Sensoren auf Basis von Siliziumnanodrähten (SiNWs). Auf verschiedenen Gebieten werden innovative Konzepte zur einfachen und zuverlässigen Herstellung von LoC Systemen entwickelt. Zu Beginn wird ein multifunktionaler Mikrofluidik-Aufbau vorgestellt, der ein einfaches reversibles Verschließen von Mikrofluidik-Kanälen auf nahezu allen möglichen Substraten erlaubt. Der Aufbau ermöglicht das schnelle Anfertigen und Testen verschiedener Kanalstrukturen sowie das Betreiben von Fluidik-Experimenten mit hohen Arbeitsdrücken von bis zu 600 kPa. Der zweite Schwerpunkt der Arbeit ist die Entwicklung einer Methode zur Funktionalisierung von Sensor-Oberflächen mittels 3-(Triethoxysilyl) Propyl Bernsteinsäure Anhydrid (TESPSA) für die Immobilisierung spezifischer Rezeptormoleküle. Bei dieser Methode entfällt die Notwendigkeit einer zusätzlichen Passivierung ungenutzter Anbindungsstellen. Des Weiteren erfolgt die Herstellung von Parallelschaltungen von Schottky-Barrieren-Feld-Effekt-Transistoren (SB-FETs) aus „bottom-up“ gewachsenen SiNWs durch mechanisches Abreiben der SiNWs vom Wachstumssubstrat auf ein Empfängersubstrat. Unter Verwendung des eingangs entwickelten Mikrofluidik-Aufbaus wird die prinzipielle Anwendbarkeit der TESPSA-basierten Rezeptor-Immobilisierung nachgewiesen, sowohl anhand von Fluoreszenzmikroskopie-Untersuchungen als auch mit Hilfe der SiNW FETs als Biosensoren. Mittels eines Rezeptor-Analyt-Systems, bestehend aus verschiedenen Antikörpern und einem Peptid des Influenzavirus A, wird gezeigt, dass Antikörper, die über TESPSA an Oberflächen gebunden werden, ihre Spezifizität für ihre Antigene beibehalten. Der vierte große Forschungsabschnitt dieser Arbeit widmet sich der mikrofluidischen Ausrichtung eindimensionaler Nanomaterialien und deren Ablage an vorgegebenen Fangstellen, wodurch eine zuverlässige Herstellung von FETs aus Einzelnanodrähten erreicht wird. Es wird davon ausgegangen, dass Einzelnanodraht-FETs gegenüber Parallelschaltungen von Nanodraht-FETs verbesserte Sensoreigenschaften aufweisen. Folglich beinhaltet diese Arbeit viele zukunftsweisende Ansätze für die Herstellung von LoC Systemen. Untersuchungen über eine Bandbreite von Längenskalen, von Mikrometer großen Strukturen bis hinab zur molekularen Ebene, werden präsentiert. Es wird davon ausgegangen, dass die vorgestellten Methoden als eine vielfältige Sammlung von Werkzeugen nicht nur bei der Herstellung von Biosensoren auf SiNW-Basis Einsatz finden, sondern ganz allgemein den Aufbau verschiedenster LoC Systeme vorantreiben.

Title: Study of cerium oxide thin films for biosensing applications Author: Yuliia Kosto Department: Department of Surface and Plasma Science Supervisor: Prof. RNDr. Vladimír Matolín, DrSc. Abstract: The presented scientific work was conducted in two main directions. The first one is an investigation of the simple biomolecules (glycine and sarcosine) bonding to cerium oxide model films by surface science techniques: photoelectron and near-edge X-ray absorption spectroscopies. Adsorption chemistry and thermal stability of the molecules on the oxides were studied in relation to the oxidation state of ceria cations, film morphology, and molecular deposition method. The oxygen vacancies in the oxide were shown to affect the adsorption geometry of glycine and stimulate molecular decomposition. The polycrystalline oxide morphology provided stabilizing effect on the glycine adlayer. Sarcosine deposited in vacuum formed densely packed adlayer with the molecules directed outwards. Interestingly, the results revealed that molecular film deposited from the aqueous solution, in contrast to deposition in vacuum, induces continuous reduction of the cerium oxide during thermal annealing. The second part is a study of polycrystalline cerium oxide thin films as an electrode for electrochemical and electrochemiluminescent...

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Anwendung elektrochemischer Biosensoren zur Erweiterung oder zum Ersatz herkömmlicher Diagnostikverfahren. Als Basis für die Biosensoren wurden Elektrodenarraychips entworfen und im Reinraum gefertigt. Die als 9WPtE bezeichneten Elektrodenarrays waren aus 3 x 3 Elektrodenpaaren im 96-well-Maßstab (ANSI-Standard) aufgebaut. Jedes Elektrodenpaar bestand aus einer kreisrunden Arbeitselektrode mit einem Durchmesser von 1,9 mm und einer Gegenelektrode als offenem Kreisring um die Arbeitselektrode mit einem Durchmesser von 7 mm. Außerhalb des Reinraums wurden separate Messkammern und Ag/AgCl-Referenzelektroden integriert. Sowohl das Referenzsystem als auch die Signalqualität der 9WPtE-Elektrodenarraychips wurden mittels Zyklovoltammetrie, Impedanzspektroskopie und Rasterkraftmikroskopie analysiert und anhand dieser Untersuchungen optimiert. Das Augenmerk lag hierbei auf den Produktionsprozessen zur Herstellung der Elektrodenarraychips, auf den Elektrolytbedingungen für die elektrochemischen Messungen und auf der Recyclebarkeit der Chips. Die Funktionalisierung der Arbeitselektroden der 9WPtE-Chips erfolgte mit sich selbst-organisierenden Schichten aus Thiolen. An die Thiole wurden mittels Chemoligation die biologischen Erkennungskomponenten kovalent gekoppelt. Mit dem 9WPtE-Elektrodenarray wurde auf diese Weise ein funktionsfähiger kompetitiver Immunosensoren gegen den Tumormarker Tenascin C entwickelt. Außerdem wurden der 9WPtE-Chip und ein zusätzlich entwickelter Durchflusssensor, basierend auf dem Prinzip des 9WPtE, genutzt, um die Möglichkeit der Detektion ganzer eukaryotischer Zellen zu untersuchen.