Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4417.pdf: 4764292 bytes, checksum: f843bb063e4e62585bcaf3a316f53db2 (MD5) Previous issue date: 2012-06-22 / Universidade Federal de Minas Gerais / First, a glassy carbon electrode modified with functionalized carbon nanotubes (CNTs) and glucose oxidase was proposed. Cyclic voltammetry of GOx immobilized onto the surface of CNTs showed a pair of well-defined redox peaks, which corresponds to the direct electron transfer of GOx, with a formal potential of -0.418 V in 0.1 mol L-1 phosphate buffer solution (pH 7.0). An apparent heterogeneous electron transfer rate constant of 1.69 s-1 was obtained. The determination of glucose was carried out by square wave voltammetry and the developed biosensor showed good reproducibility and stability. The second biosensor was a boron-doped diamond electrode modified with AuNPs electrodeposited and Tyrosinase (Tyr). The occurrence of direct electron transfer between the electrode surface and the Tyr active site was verified by cyclic voltammetry, yielding the following parameter values: formal redox potential of 0.115 V. The developed Tyr-AuNPs/BDD biosensor exhibits good sensitivity, stability, and reproducibility for the determination of phenol by SWV. The third proposed biosensor was developed based on acetylcholinesterase, gold nanoparticles and poly (allylamine hydrochloride) film on the surface of screen printed carbon electrodes (SPCE) for the determination of pesticides using a portable micromachined flow injection system. The AChE-AuNPs/SPCE biosensor presented a limit of detection of 5.0 x 10-8 mol L-1 for Diuron. In addition, the biosensor showed good sensitivity, stability and reproducibility for Diuron determination in water samples. Finally, a novel electrochemical immunosensor using electrodeposited gold nanoparticles modified-screen-printed carbon electrodes (AuNPs/SPCEs) was developed for the determination of prolactin.The variables involved in the preparation of the immunosensor and the electrochemical detection step were optimized, which presented a limit of detection of 10 ng mL-1. The analytical usefulness of the immnunosensor for the analysis of real samples was demonstrated by analyzing human serum spiked with PRL at two different concentration levels. / Primeiramente desenvolveu-se uma nova arquitetura de um biossensor para glicose utilizando-se a enzima glicose oxidase (GOx) imobilizada em nanotubos de carbono funcionalizados (CNTs) e dihexadecil hidrogenio fosfato (DHP) sobre a superficie de carbono vitreo (GCE). Resultados de voltametria ciclica apresentaram um par de picos redox bem definidos, correspondente a transferencia eletronica direta da GOx para o eletrodo, com o potencial formal de -0,418 V (vs. Ag/AgCl (KCl 3,0 mol L-1)). O biossensor foi aplicado na determinacao de glicose, o qual mostrou boas reprodutibilidade, estabilidade e seletividade. O segundo biossensor desenvolvido foi aquele utilizando-se a enzima tirosinase (Tyr) imobilizada em nanoparticulas de ouro sobre a superficie de um eletrodo de diamante dopado com boro. Resultados de voltametria ciclica apresentaram um par de picos redox bem definidos, correspondente a transferencia eletronica direta da Tyr. As determinacoes de fenol foram realizadas por SWV e o biossensor proposto apresentou um limite de deteccao de 0,07 μmol L-1. Em sequencia foi proposto um biossensor para a determinacao de pesticidas utilizando-se a enzima acetilcolinesterase imobilizada sobre filme de nanoparticulas de ouro e hidrocloreto de polialilamina sobre a superficie de eletrodos de carbono impresso (SPCE). O eletrodo AChE-AuNPs/SPCE apresentou um limite de deteccao de 5,0 x 10-8 mol L-1 para Diuron, alem de boa estabilidade e reprodutibilidade para a determinacao do pesticida por amperometria. Por fim foi proposto tambem um imunossensor usando nanoparticulas de ouro eletrodepositadas sobre eletrodos de carbono impresso (AuNPs/SPCEs) para a determinacao de prolactina. Os anticorpos antiprolactina biotinilada foram imobilizados em AuNPs/SPCEs modificados com estreptavidina em um imunoensaio do tipo sanduiche envolvendo o analito e um anticorpo antiprolactina marcado com fosfatase alcalina (AP). O imunossensor proposto apresentou um limite de deteccao de 10 ng mL-1 e foi aplicado com sucesso em amostras de soro humano enriquecido com prolactina comprovando a eficacia do procedimento proposto.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5421.pdf: 1977328 bytes, checksum: 1fdb74c2df039b25a8f5d6b1dc05e54c (MD5) Previous issue date: 2013-06-07 / Universidade Federal de Sao Carlos / In this work was described the development of new architectures for biosensors, using nanomaterials. The enzyme of interest was immobilized on glassy carbon electrode modified with multi-walled carbon nanotubes chemically treated and/or gold nanoparticles within a dihexadecylphosphate or poly(allylamine hydrochloride) film. Initially, a glassy carbon electrode (GCE) modified with functionalized multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs), 1-butyl-3-methylimidazolium chloride (BMIM) and tyrosinase (Tyr) within a dihexadecylphosphate (DHP) film for the development of a biosensor was proposed. MWCNTs, BMIM and Tyr were efficiently immobilized in the film using 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide/N-hydroxysuccinimide as crosslinking agents. The film characterization was realized by cyclic voltammetry (CV) in presence of catechol. The BMIM-MWCNTs nanocomposite showed good conductivity and biocompatibility with Tyr enzyme, once that the biosensor presented biocatalytic activity to the oxidation of catechol to o-quinone which was electrochemically reduced to catechol at a potential of 0.04 V. The Tyr-BMIMMWCNTs- DHP/GCE biosensor showed wide linear range, good repeatability, sensitivity and stability and, the biosensor was successfully applied in the determination of catechol in natural water samples. The second developed biosensor was based on the modification of a GCE with gold nanoparticles (AuNPs) and Tyr within a DHP film. The enzyme immobilization was performed using cystamine and glutaraldehyde as crosslinking agents. Amperometry technique was used to obtain the analytical curve that showed linear in the concentration of catechol in the range from 2.49 × 10−6 to 9.50 × 10−5 mol L−1 with a detection limit of 1.74 × 10−7 mol L−1. The Tyr-AuNPs-DHP/GCE biosensor was applied in the determination of catechol in water samples from the UFSCar Dam. The results were satisfactory when compared with a spectrophotometric method at a 95% confidence level. Finally, the modification of a GCE with MWCNTs and AuNPs within a poly(allylamine hydrochloride) (PAH) film for the development of a novel biosensor was proposed. This approach provided an efficient method used to immobilize polyphenol oxidase (PPO) obtained from the crude extract of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.). The principle of the analytical method is based on the inhibitory effect of sulfite on the activity of PPO, in the reduction reaction of o-quinone to catechol and/or the reaction of o-quinone with sulfite. Under the optimum experimental conditions using the differential pulse voltammetry technique, the analytical curve obtained was linear in the concentration range of sulfite from 5.0 × 10−7 to 2.2 × 10−5 mol L−1 with a detection limit of 4.0 × 10−7 mol L−1. The biosensor was successfully applied in the determination of sulfite in white and red wine samples with results in close agreement with those results obtained using a reference iodometric method at a 95% confidence level. / Neste trabalho descreve-se o desenvolvimento de novas arquiteturas para biossensores utilizando materiais nanoestruturados. A enzima de interesse foi imobilizada sobre um eletrodo de carbono vítreo modificado com nanotubos de carbono de paredes múltiplas tratados quimicamente e/ou nanopartículas de ouro em filme de dihexadecil hidrogenofosfato ou hidrocloreto de poli(alilamina). Inicialmente, foi proposto um eletrodo de carbono vítreo (GCE) modificado com nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNTs) funcionalizados, cloreto de 1-butil-3-metil-imidazol (BMIM) e tirosinase (Tyr) em filme de dihexadecil hidrogenofosfato (DHP) para o desenvolvimento de um novo biossensor. Os MWCNTs, BMIM e Tyr foram eficientemente imobilizados no filme usando 1etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida e N-hidroxisuccinimida, como agentes de reticulação. A caracterização do filme foi feita por voltametria cíclica (CV) em presença de catecol. O nanocompósito BMIM-MWCNTs exibiu boa condutividade e biocompatibilidade com a enzima Tyr, uma vez que o biossensor mostrou atividade biocatalítica para a oxidação de catecol a o-quinona, que foi reduzida eletroquimicamente para catecol em um potencial de 0,04 V. O biossensor Tyr- BMIM-MWCNTs-DHP/GCE apresentou ampla faixa linear, boa repetibilidade, sensibilidade e estabilidade sendo aplicado com sucesso na determinação de catecol em amostras de águas naturais. O segundo biossensor desenvolvido, baseou-se na modificação de um GCE com nanopartículas de ouro (AuNPs) e Tyr em filme de DHP. A imobilização enzimática foi realizada utilizando-se cistamina e glutaraldeído como agentes de reticulação. A técnica amperométrica foi utilizada para obtenção da curva analítica que apresentou uma faixa linear na concentração de catecol de 2,49 × 10−6 a 9,50 × 10−5 mol L−1 e um limite de detecção de 1,74 × 10−7 mol L−1. O biossensor Tyr-AuNPs-DHP/GCE foi aplicado na determinação de catecol em amostras de águas naturais, da represa da UFSCar. Os resultados foram concordantes quando comparados com as concentrações obtidas empregando-se um método espectrofotométrico de referência em um nível de confiança de 95%. Por fim, foi proposta a modificação de um GCE com MWCNTs e AuNPs em filme de hidrocloreto de poli(alilamina) (PAH) para o desenvolvimento de um biossensor. Esta abordagem proporcionou um método eficiente usado para imobilizar a enzima polifenol oxidase (PPO), obtida a partir do extrato bruto de batata doce (Ipomoea batatas (L.) Lam.). O princípio do método analítico baseia-se na inibição da atividade da PPO pelo sulfito, na reação de redução da o-quinona para catecol e/ou na reação entre o-quinona e sulfito. Empregando-se as melhores variáveis experimentais para a técnica de voltametria de pulso diferencial, a curva analítica obtida foi linear no intervalo de concentração de sulfito de 5,0 × 10−7 a 2,2 × 10−5 mol L−1 com um limite de detecção de 4,0 × 10−7 mol L−1. O biossensor foi aplicado com sucesso na determinação de sulfito em amostras de vinho branco e tinto com resultados satisfatórios em comparação com um método iodométrico de referência em um nível de confiança de 95%.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5238.pdf: 5294587 bytes, checksum: 025b13ac00d18b1830afac47325d6ffe (MD5) Previous issue date: 2013-04-29 / Financiadora de Estudos e Projetos / In this study, our goal was evaluate the interactive forces between the Atomic force microscope tip (AFM tip) and an important enzyme responsible to fatty acids synthesis in all living beings (Acetyl CoA Carboxylase - fic biosensors to detect pesticides molecules used in agriculture. The AFM tip can be functionalized through its oxidation with spacer molecules. In order to simulate computationally this modified AFM tip that was called surface spacer-agent (SSA) using molecular dynamic (MD) simulations, the force field (FF) parameters had to be calculated. The FF parameters were obtained using quantum mechanical calculations and were implemented in an appropriate FF protocol. Three types of geometric molecular orientations of the ACCase were evaluated as a starting point to enzymatic immobilization, but only one was used to MD simulation. The criteria to define xyz orientation were basically based on the active sites from the ACCase enzyme are available to interact with molecules from the bulk and the surface contact area of the enzyme interacting with SSA ensure an strong interaction force to maintain the enzyme immobilized on the tip. Surface contact area, hydrogen bonds and protein stability were the parameters monitored during the MD trajectory as the enzymeherbicide interactions using a combination of molecular docking and molecular dynamics. The clusters formed using docking calculations in different regions along the ACCase enzyme were submitted to MD simulations in order to measure interactive energies of the system. / Neste estudo, o objetivo foi quantificar e analisar as forças de interação entre a ponta do microscópio de força atômica (AFM) modificada quimicamente com moléculas ligantes e uma importante enzima responsável pela síntese de ácidos graxos em todos os seres vivos, a Acetil CoA carboxilase - ACCase. Nosso objetivo é desenvolver biossensores específicos para a detecção de pesticidas usados na agricultura. A fim de simular computacionalmente esta superfície modificada, utilizando a metodologia de dinâmica molecular (MD), os parâmetros campo de força foram desenvolvidos e implementados no modelo computacional aqui proposto. Estes parâmetros foram obtidos utilizando cálculos de mecânica quântica e implementados no campo de força do programa de MD utilizado. Três tipos de orientações moleculares da ACCase foram avaliadas como ponto de partida para os cálculos de MD, porém, apenas uma posição foi utilizada para a simulação. Os critérios para definir a orientação espacial da enzima na superfície tiveram com base a localização dos sítios ativos da enzima e a área de contato da enzima com a superfície funcionalizada. Este último parâmetro foi levado conta com a intenção de assegurar uma força de interação forte o suficiente para manter a enzima imobilizada na ponta sem que haja o despreendimento da mesma devido a fracas interações. Superfície de contacto, ligações de hidrogênio e estabilidade estrutural da proteína foram os parâmetros avaliados e monitorados. As regiões da enzima expostas para interação com as moléculas do bulk foram avaliadas utilizando uma combinação de docking molecular e dinâmica molecular. Os clusters formados dos cálculos de docking em diferentes regiões da enzima ACCase foram submetidos a simulação por MD para o cálculo das energias envolvidas no sistema.