CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Immobilization of enzymes provides advantages such as increased in: stability, level of process control, yield and purity of the final product, in addition to allowing the use of different reactor configurations. In this study, two types of support, an organic polymer (polimetilmetacrilato- PMMA) and other inorganic (silica) were used for the immobilization of lipase Candida antarctica type B (CALB). Different alcohols (ethanol, iso-propanol, n-butanol) were evaluated as agents for optimization of the immobilization process, the concentrations of 5, 10 and 15% (volume of alcohol à 100 / solution volume immobilization). Immobilization of PMMA was conducted using two different protocols here denominated first and second protocol generation. The best results of hydrolytic activity and esterification to the derivative of the first generation was 3,91  0,09 UpNPB/g. of catalyst e 409,5  19,7 Uoleic acid/g. of catalyst, respectively. When using the protocol of the second generation, the best results were obtained when aa immobilization was carried out in the presence of 5% Triton X-100 2 mM, rising rate of the esterification reaction between the derivatives studied was highly significant with a higher ratio of 3,81 times to the derivative prepared with Triton X-100. The CALB was also immobilized for the macroporous silica support (IB S60S - Chiralvision), the activate agent used was Triethoxy(octyl)silane (C8-TEOS). The results observed for immobilization in the presence of 5% n-butanol were the best for both hydrolytic activity, being four times higher than the activity for the immobilized derivative without alcohol, as for the esterification activity was 985,1  5,6 Uoleic acid/g. of catalyst . All observed derivatives supported on silica and PMMA reached a level conversion for equilibrium esterification reaction for a reaction time of 24 h the best results varying between 80 to 90%. / A imobilizaÃÃo das enzimas traz vantagens como: aumento da estabilidade, do nÃvel de controle do processo, do rendimento e da pureza do produto final, alÃm de possibilitar o uso de reatores de diferentes configuraÃÃes. Neste trabalho, dois tipos de suporte, um polÃmero orgÃnico (polimetilmetacrilato- PMMA) e outro inorgÃnico (sÃlica), foram utilizados para a imobilizaÃÃo da lipase do tipo B de Candida antarctica (CALB). Diferentes Ãlcoois (etanol, iso-propanol, n-butanol) foram avaliados como agentes de otimizaÃÃo do processo de imobilizaÃÃo, nas concentraÃÃes de 5, 10 e 15 % (volume de Ãlcool Ã100 / volume da soluÃÃo de imobilizaÃÃo). A imobilizaÃÃo em PMMA foi conduzida atravÃs de dois protocolos diferentes, aqui denominados de protocolo de primeira e segunda geraÃÃo. Os melhores resultados de atividade hidrolÃtica e de esterificaÃÃo para o derivado de primeira geraÃÃo foi de 3,91  0,09 UpNPB/g. de catalisador e 409,5  19,7 UÃc. olÃico/g. de catalisador, respectivamente. Quando se utilizou o protocolo de segunda geraÃÃo, melhores resultados foram obtidos quando a a imobilizaÃÃo foi conduzida na presenÃa de n-butanol 5 % e Triton X-100 2mM; o aumento da velocidade da reaÃÃo de esterificaÃÃo entre os derivados estudados foi bastante significativo, sendo 3,8 vezes maior para o derivado preparado com Triton X-100. A CALB foi imobilizada tambÃm para o suporte sÃlica macroporosa (IB S60S - Chiralvision), o agente ativante utilizado foi o octiltrietoxisilano (C8-TEOS). Os resultados observados para imobilizaÃÃo na presenÃa de n-butanol 5 % foram os melhores tanto para a atividade hidrolÃtica, sendo quatro vezes maior que a atividade para o derivado imobilizado sem Ãlcool, quanto para a atividade de esterificaÃÃo que foi de 985,1  5,6 UÃc. olÃico/g. de catalisador. Todos os derivados observados suportados em PMMA e sÃlica atingiram um patamar de conversÃo do equilÃbrio para reaÃÃo de esterificaÃÃo por um perÃodo de reaÃÃo de 24 h com os melhores resultados variando entre 80 a 90%.

As caprilinas são acilgliceróis de cadeia média com diversas aplicações nos campos alimentício, farmacêutico e cosmético. A esterificação direta é um processo importante para a síntese de caprilinas, dado que o glicerol é subproduto da produção de biodiesel e que a tricaprilina, material de partida para a glicerólise e hidrólise, não é um composto abundante naturalmente. As reações existentes para a síntese de acilgliceróis podem ser catalisadas por via química ou enzimática, sendo esta última superior em diversos aspectos. Dois dos principais contrapontos à utilização de enzimas são seu alto custo e dificuldade de recuperação. A imobilização de enzimas é uma das maneiras existentes para contornar estas questões. A maioria dos estudos científicos relativos à obtenção destes compostos refere-se aos acilgliceróis de cadeia longa. Portanto, é necessário aprimorar a esterificação direta entre o glicerol e ácido caprílico catalisada por lipase, através da compreensão da cinética reacional e da influência dos parâmetros reacionais. A existência de uma metodologia de separação, identificação e quantificação simples e eficaz também é importante, tornando as pesquisas relacionadas às caprilinas mais rápidas e menos complicadas. Desta maneira, este trabalho consistiu de três etapas principais: (1) a imobilização de lipases em resinas de troca aniônica, visando reduzir os custos em relação à lipase imobilizada comercial; (2) o desenvolvimento de um método de cromatografia em camada delgada capaz de quantificar as caprilinas formadas; (3) o estudo da reação de esterificação para a obtenção de caprilinas em regime descontínuo e descontínuo-alimentado. A resina DOWEX® 1X2-400 foi a que apresentou a melhor eficiência de imobilização (EI) da Palatase®. Sua atividade lipolítica foi apenas 12,7% inferior à versão imobilizada comercial da lipase, a Lipozyme®RM IM, indicando a viabilidade de substituição desta última. O desenvolvimento de método de cromatografia em camada delgada resultou em relações lineares para a detecção e quantificação de ácido caprílico, monocaprilina, dicaprilina e tricaprilina com R2 e R2pred de 99,3%/98,73%; 98,9%/97,6%; 99,8%/99,8% e 99,7%/99,5%, respectivamente, e com valor-p de 0,000. As reações em regime descontínuo foram realizadas seguindo planejamento fatorial completo, no qual foram variadas a temperatura (30 ou 70°C), a proporção molar entre os reagentes (1:1 ou 3:1 - ácido caprílico : glicerol) e o tempo reacional (6 ou 10h). A análise de regressão do rendimento reacional expresso em porcentagem de consumo de ácido caprílico indicou que, nestas condições, os fatores relevantes para o resultado final são a temperatura e a proporção molar, bem como a interação entre eles. As melhores condições para a obtenção de mono e dicaprilinas foram, portanto, de 30ºC e razão molar de 1:1. O estudo da cinética da reação indica que 40,4% do ácido caprílico são consumidos na primeira hora e que o consumo máximo ocorre na terceira hora de reação. Houve uma queda drástica no rendimento reacional, quando a reação foi conduzida em regime descontínuo-alimentado, provavelmente devido à menor eficiência catalítica da lipase devido ao baixo teor de água na primeira hora de reação. / Caprylins are medium chain acylglycerols that find several applications in food, pharmaceutical and cosmetic fields. Direct esterification is an important route for the synthesis of caprylins, since glycerol is a byproduct of biodiesel production and tricaprylin, the starting material of glycerolysis and hydrolysis, is not a naturally abundant compound. The glycerides synthesis can be catalyzed by either chemical or enzymatic routes, the latter being superior in several aspects. The biggest issues regarding the use of enzymes are their high cost and difficult recovery. Using immobilized enzymes can minimize these concerns. Most of scientific studies concerning the obtainment of these compounds address to long chain acyglycerols. Thus, the improvement of lipase catalyzed esterification of glycerol and caprylic acid is necessary, by understanding the reaction kinetics and the role of reaction parameters. A simple and effective method of separation, identification and quantification of caprylins is also a relevant contributing factor for easier and faster researches. Therefore, this work consisted of three main steps: (1) immobilization of lipases on anion exchange resins in order to produce a cheaper alternative to imported commercial immobilized lipases; (2) development of a thin layer chromatographic method capable of quantifying caprylins; (3) studying the obtainment of caprylins by direct esterification in batch and fed batch systems. DOWEX® 1X2-400 resin presented the best immobilization efficiency (IE) results. Additionally, its lipolytic activity was only 12.7% lower than the commercial Lipozyme® RM IM, suggesting that Lipozyme\'s substitution is feasible. Regarding the developing of a thin layer chromatography method, linear correlations were obtained for detection and quantification of caprylic acid, monocaprylin, dicaprylin and tricaprylin, with a R2 and R2pred of 99,3%/98,73%; 98,9%/97,6%; 99,8%/99,8% e 99,7%/99,5%, respectively, with a p-value of 0,000. The batch reactions were carried out according to a complete factorial design, in which the temperature (30 or 70ºC), the molar ratio between the reagents (1:1 or 3:1) and reaction time (6h or 10h) were varied. The regression analysis of reactional yield expressed in terms of percentage of caprylic acid consumption indicated that only the temperature, molar-ratio and their interaction were important for reaction yields, within the studied conditions. The best conditions related to the obtainment of mono and dicaprylins were 30ºC and molar ratio of 1:1. The reaction kinetics indicates that 40.4% of the caprylic acid is consumed within one hour of reaction and that the maximal consumption was achieved in the third hour. A drastic drop in reaction yield was observed when the fed batch mode was adopted, probably due a lower catalytic efficiency presented by lipase as a result of the lower water content in the first hour of reaction.

Este trabalho descreve o desenvolvimento de um sistema microfluídico, contendo, como componente principal, um reator enzimático constituído de um microcanal fabricado em substrato de poli(metacrilato de metila) e um sistema amperométrico como detector. Para a construção de microcanais foi utilizando equipamento de usinagem a laser de CO2 para escavar os microcanais, que a seguir foram selados termicamente. A superfície interna desse microcanal foi submetida à modificação química com poli(etilenoimina), que se mostrou eficiente para posterior imobilização da enzima glicose oxidase, utilizando glutaraldeído como agente de ligação covalente cruzada, gerando assim um microrreator para determinação amperométrica de glicose. O peróxido de hidrogênio gerado na reação enzimática foi detectado em uma célula eletroquímica em fluxo, localizada externamente ao reator, com eletrodo de platina como eletrodo de trabalho. Uma bomba peristáltica programável foi empregada para promover a injeção de amostra, utilizando tubulação de pequeno diâmetro (0,3 mm), permitindo alcançar reprodutibilidade para a injeção de pequenos volumes, tipicamente da ordem de 5 microlitros de solução. O sistema proposto foi utilizado para a determinação amperométrica diferencial de glicose presente em amostras de refrigerantes, apresentando boa repetibilidade (DPR = 1,72%, n = 50), limite de detecção apreciável (1,40 x10-6 mol L-1), elevada frequência de amostragem (345 amostras h-1) e relativa estabilidade a longo prazo (420 determinações em mais de 20 dias com perda de atividade menor que 50%). As análises realizadas com o sistema proposto neste estudo levaram a resultados concordantes com os obtidos pelo método espectrofotométrico clássico, utilizado para análise de glicose em fluídos biológicos. / This work describes the development of a microfluidic system having as a main component an enzymatic reactor constituted by a microchannel assembled in poly(methyl methacrylate) substrate, connected to an amperometric detector. To manufacture the microchannels, a CO2 laser ablation machine was utilized to engrave the channels, which in sequence were thermally sealed. The internal surfaces of the microchannels were chemically modified with poly(ethyleneimine) which showed good effectiveness for the immobilization of glucose oxidase enzymes using glutaraldehyde as crosslinking agent, producing in this way a microreactor effective for the amperometric detection of glucose. The hydrogen peroxide generated in the enzymatic reaction was detected in the electrochemical flow cell, localized outside of the reactor, using platinum as the working electrode. A programmable peristaltic pump was utilized to inject the samples, utilizing tubes with small diameter (0.3 mm), allowing attain reproducibility even for injections of small volumes, in the order of 5 microliters of solution. The proposed system was applied for differential amperometric determination of glucose content in soft drinks, showing good repeatability (DPR = 1.72%, n = 50) low detection limit (1,40 x10-6 mol L-1), high sample frequency (345 samples h-1) and relatively good stability for long term (420 determinations along more than 20 days, with a decrease of activity lower than 50%). The analysis performed with the system proposed in this study lead to results which agree with those obtained by the classical spectrophotometric method, utilized to analyze glucose in biological fluids.

Este trabalho descreve o desenvolvimento de um sistema microfluídico, contendo, como componente principal, um reator enzimático constituído de um microcanal fabricado em substrato de poli(metacrilato de metila) e um sistema amperométrico como detector. Para a construção de microcanais foi utilizando equipamento de usinagem a laser de CO2 para escavar os microcanais, que a seguir foram selados termicamente. A superfície interna desse microcanal foi submetida à modificação química com poli(etilenoimina), que se mostrou eficiente para posterior imobilização da enzima glicose oxidase, utilizando glutaraldeído como agente de ligação covalente cruzada, gerando assim um microrreator para determinação amperométrica de glicose. O peróxido de hidrogênio gerado na reação enzimática foi detectado em uma célula eletroquímica em fluxo, localizada externamente ao reator, com eletrodo de platina como eletrodo de trabalho. Uma bomba peristáltica programável foi empregada para promover a injeção de amostra, utilizando tubulação de pequeno diâmetro (0,3 mm), permitindo alcançar reprodutibilidade para a injeção de pequenos volumes, tipicamente da ordem de 5 microlitros de solução. O sistema proposto foi utilizado para a determinação amperométrica diferencial de glicose presente em amostras de refrigerantes, apresentando boa repetibilidade (DPR = 1,72%, n = 50), limite de detecção apreciável (1,40 x10-6 mol L-1), elevada frequência de amostragem (345 amostras h-1) e relativa estabilidade a longo prazo (420 determinações em mais de 20 dias com perda de atividade menor que 50%). As análises realizadas com o sistema proposto neste estudo levaram a resultados concordantes com os obtidos pelo método espectrofotométrico clássico, utilizado para análise de glicose em fluídos biológicos. / This work describes the development of a microfluidic system having as a main component an enzymatic reactor constituted by a microchannel assembled in poly(methyl methacrylate) substrate, connected to an amperometric detector. To manufacture the microchannels, a CO2 laser ablation machine was utilized to engrave the channels, which in sequence were thermally sealed. The internal surfaces of the microchannels were chemically modified with poly(ethyleneimine) which showed good effectiveness for the immobilization of glucose oxidase enzymes using glutaraldehyde as crosslinking agent, producing in this way a microreactor effective for the amperometric detection of glucose. The hydrogen peroxide generated in the enzymatic reaction was detected in the electrochemical flow cell, localized outside of the reactor, using platinum as the working electrode. A programmable peristaltic pump was utilized to inject the samples, utilizing tubes with small diameter (0.3 mm), allowing attain reproducibility even for injections of small volumes, in the order of 5 microliters of solution. The proposed system was applied for differential amperometric determination of glucose content in soft drinks, showing good repeatability (DPR = 1.72%, n = 50) low detection limit (1,40 x10-6 mol L-1), high sample frequency (345 samples h-1) and relatively good stability for long term (420 determinations along more than 20 days, with a decrease of activity lower than 50%). The analysis performed with the system proposed in this study lead to results which agree with those obtained by the classical spectrophotometric method, utilized to analyze glucose in biological fluids.

As caprilinas são acilgliceróis de cadeia média com diversas aplicações nos campos alimentício, farmacêutico e cosmético. A esterificação direta é um processo importante para a síntese de caprilinas, dado que o glicerol é subproduto da produção de biodiesel e que a tricaprilina, material de partida para a glicerólise e hidrólise, não é um composto abundante naturalmente. As reações existentes para a síntese de acilgliceróis podem ser catalisadas por via química ou enzimática, sendo esta última superior em diversos aspectos. Dois dos principais contrapontos à utilização de enzimas são seu alto custo e dificuldade de recuperação. A imobilização de enzimas é uma das maneiras existentes para contornar estas questões. A maioria dos estudos científicos relativos à obtenção destes compostos refere-se aos acilgliceróis de cadeia longa. Portanto, é necessário aprimorar a esterificação direta entre o glicerol e ácido caprílico catalisada por lipase, através da compreensão da cinética reacional e da influência dos parâmetros reacionais. A existência de uma metodologia de separação, identificação e quantificação simples e eficaz também é importante, tornando as pesquisas relacionadas às caprilinas mais rápidas e menos complicadas. Desta maneira, este trabalho consistiu de três etapas principais: (1) a imobilização de lipases em resinas de troca aniônica, visando reduzir os custos em relação à lipase imobilizada comercial; (2) o desenvolvimento de um método de cromatografia em camada delgada capaz de quantificar as caprilinas formadas; (3) o estudo da reação de esterificação para a obtenção de caprilinas em regime descontínuo e descontínuo-alimentado. A resina DOWEX® 1X2-400 foi a que apresentou a melhor eficiência de imobilização (EI) da Palatase®. Sua atividade lipolítica foi apenas 12,7% inferior à versão imobilizada comercial da lipase, a Lipozyme®RM IM, indicando a viabilidade de substituição desta última. O desenvolvimento de método de cromatografia em camada delgada resultou em relações lineares para a detecção e quantificação de ácido caprílico, monocaprilina, dicaprilina e tricaprilina com R2 e R2pred de 99,3%/98,73%; 98,9%/97,6%; 99,8%/99,8% e 99,7%/99,5%, respectivamente, e com valor-p de 0,000. As reações em regime descontínuo foram realizadas seguindo planejamento fatorial completo, no qual foram variadas a temperatura (30 ou 70°C), a proporção molar entre os reagentes (1:1 ou 3:1 - ácido caprílico : glicerol) e o tempo reacional (6 ou 10h). A análise de regressão do rendimento reacional expresso em porcentagem de consumo de ácido caprílico indicou que, nestas condições, os fatores relevantes para o resultado final são a temperatura e a proporção molar, bem como a interação entre eles. As melhores condições para a obtenção de mono e dicaprilinas foram, portanto, de 30ºC e razão molar de 1:1. O estudo da cinética da reação indica que 40,4% do ácido caprílico são consumidos na primeira hora e que o consumo máximo ocorre na terceira hora de reação. Houve uma queda drástica no rendimento reacional, quando a reação foi conduzida em regime descontínuo-alimentado, provavelmente devido à menor eficiência catalítica da lipase devido ao baixo teor de água na primeira hora de reação. / Caprylins are medium chain acylglycerols that find several applications in food, pharmaceutical and cosmetic fields. Direct esterification is an important route for the synthesis of caprylins, since glycerol is a byproduct of biodiesel production and tricaprylin, the starting material of glycerolysis and hydrolysis, is not a naturally abundant compound. The glycerides synthesis can be catalyzed by either chemical or enzymatic routes, the latter being superior in several aspects. The biggest issues regarding the use of enzymes are their high cost and difficult recovery. Using immobilized enzymes can minimize these concerns. Most of scientific studies concerning the obtainment of these compounds address to long chain acyglycerols. Thus, the improvement of lipase catalyzed esterification of glycerol and caprylic acid is necessary, by understanding the reaction kinetics and the role of reaction parameters. A simple and effective method of separation, identification and quantification of caprylins is also a relevant contributing factor for easier and faster researches. Therefore, this work consisted of three main steps: (1) immobilization of lipases on anion exchange resins in order to produce a cheaper alternative to imported commercial immobilized lipases; (2) development of a thin layer chromatographic method capable of quantifying caprylins; (3) studying the obtainment of caprylins by direct esterification in batch and fed batch systems. DOWEX® 1X2-400 resin presented the best immobilization efficiency (IE) results. Additionally, its lipolytic activity was only 12.7% lower than the commercial Lipozyme® RM IM, suggesting that Lipozyme\'s substitution is feasible. Regarding the developing of a thin layer chromatography method, linear correlations were obtained for detection and quantification of caprylic acid, monocaprylin, dicaprylin and tricaprylin, with a R2 and R2pred of 99,3%/98,73%; 98,9%/97,6%; 99,8%/99,8% e 99,7%/99,5%, respectively, with a p-value of 0,000. The batch reactions were carried out according to a complete factorial design, in which the temperature (30 or 70ºC), the molar ratio between the reagents (1:1 or 3:1) and reaction time (6h or 10h) were varied. The regression analysis of reactional yield expressed in terms of percentage of caprylic acid consumption indicated that only the temperature, molar-ratio and their interaction were important for reaction yields, within the studied conditions. The best conditions related to the obtainment of mono and dicaprylins were 30ºC and molar ratio of 1:1. The reaction kinetics indicates that 40.4% of the caprylic acid is consumed within one hour of reaction and that the maximal consumption was achieved in the third hour. A drastic drop in reaction yield was observed when the fed batch mode was adopted, probably due a lower catalytic efficiency presented by lipase as a result of the lower water content in the first hour of reaction.

Neste trabalho, apresentamos a eletrossíntese de um novo polímero condutor derivado do polipirrol (PPI) funcionalizado com um grupo carboxílico, o polipirrol-2-ácido carboxílico (PPI-2-COOH), e o seu uso como transdutor amperométrico em biossensores pelo uso da polifenol oxidase (PFO). São apresentadas todas as etapas de síntese e de caracterização dos filmes poliméricos em microeletrodos e o preparo e a resposta dos biossensores montados para a detecção de um composto fenólico. Nossos estudos sobre eletrossíntese, respostas eletroquímicas dos filmes, juntamente com resultados de microgravimetria e modelagem molecular de dímeros e trímeros derivados de PI-2-COOH, permitiram com que pudéssemos sugerir pela primeira vez um mecanismo de eletropolimerização deste monômero em meio não aquoso. Na caracterização dos filmes por espectroscopia in situ no UV-visível e infravermelho próximo foram observadas duas bandas idênticas às transições pi-pi* características dos filmes de PPI no seu estado neutro e de maior dopagem, confirmando a possibilidade de haver duas conformações na cadeia do PPI-2-COOH. Com a modelagem molecular de um oligômero formado a partir da oxidação do PI-2-COOH, verificamos que para cada 4 anéis heterocíclicos acoplados entre si na posição 4-5, um par de anéis se encontrava em um plano diferente do segundo par de anéis, mantendo este padrão em toda a extensão da cadeia polimérica. A resposta redox dos filmes nos permitiu observar a preferência do polímero pela entrada de cátions em sua estrutura. Nos espectros de FTIR também comprovamos a presença do grupo carboxílico na estrutura do polímero, o que permitiu uma imobilização enzimática por ligação covalente. A confecção de microeletrodos destinados para a análise por injeção em fluxo (FIA) nos possibilitou uma economia de reagentes, praticidade e boa reprodutibilidade das medidas. Os biossensores amperométricos obtidos pela imobilização covalente da PFO sobre filmes de PPI-2-COOH apresentaram um pH ótimo de funcionamento em 9,4 e um potencial ótimo de trabalho em +70 mV vs Ag/QRE. Finalizamos nosso trabalho obtendo as respostas amperométricas dos biossensores para a detecção de um composto fenólico, pirocatecol, com uma linearidade entre as concentrações de 5x10-4 até 2,5x10-2 mol/L. / In this work, we present the electrochemical synthesis of a new conducting polymer derived of polypyrrole (PPI) functionalized by carboxylic group, the polypyrrole-2-carboxylic acid, and its application as amperometric transducer in biosensor by use of polyphenol oxidase (PFO). All the steps of syntheses and characterization of the polymer film in microelectrodes and response of the biosensor build for detection of phenolic compost. Our study about electrosyntheses, electrochemical response of the films (PPI-2-COOH) together with microgravimetry result and the molecular modeling of dimer and trimer derived from PI-2-COOH allowed one to suggest, for the first time, the mechanism of electropolymerization of this monomer in non-aqueous medium. When the technique of in-situ ultraviolet-visible spectroscopy (UV-VIS in-situ) was observed two bands, identical to the transition pi-pi* which are characteristics of the PPI films on their neutral state and of bigger doping, confirming the possibility that there may be two conformations in the PPI-2-COOH chain. With the molecular modeling of an oligomer formed by PI-2-COOH oxidation, we verified that for each four heterocyclic ring coupled together in the position 4-5, there´s a pair of rings, maintaining this pattern in all the extension of the polymeric chain. The redox response through the electrochemical measurement we could observe in FTIR the polymer preference for the cations adsorption. On the FTIR measurements, we could also observe the presence of the carboxylic group in the polymers structure, which is needed for the enzymatic immobilization by covalent binding. The fabrication of the microelectrode destined to flow injection analysis (FIA), made possible not only to save a lot of reagents, but also demonstrated praticity in the experimental set up and good reproducibility of results. Hence, the obtaining of amperometric biosensor by covalent binding of PFO on the PPI-2-COOH film, presented good pH in 9.4 and great work potential in +70 mV vs Ag/AgCl. We finish the work with the amperometric response of the biosensor in the detection of pyrocatechol, forming a straight line between the concentrations of 5x10-4 to 2.5x10-2 mol/L.

Neste trabalho, apresentamos a eletrossíntese de um novo polímero condutor derivado do polipirrol (PPI) funcionalizado com um grupo carboxílico, o polipirrol-2-ácido carboxílico (PPI-2-COOH), e o seu uso como transdutor amperométrico em biossensores pelo uso da polifenol oxidase (PFO). São apresentadas todas as etapas de síntese e de caracterização dos filmes poliméricos em microeletrodos e o preparo e a resposta dos biossensores montados para a detecção de um composto fenólico. Nossos estudos sobre eletrossíntese, respostas eletroquímicas dos filmes, juntamente com resultados de microgravimetria e modelagem molecular de dímeros e trímeros derivados de PI-2-COOH, permitiram com que pudéssemos sugerir pela primeira vez um mecanismo de eletropolimerização deste monômero em meio não aquoso. Na caracterização dos filmes por espectroscopia in situ no UV-visível e infravermelho próximo foram observadas duas bandas idênticas às transições pi-pi* características dos filmes de PPI no seu estado neutro e de maior dopagem, confirmando a possibilidade de haver duas conformações na cadeia do PPI-2-COOH. Com a modelagem molecular de um oligômero formado a partir da oxidação do PI-2-COOH, verificamos que para cada 4 anéis heterocíclicos acoplados entre si na posição 4-5, um par de anéis se encontrava em um plano diferente do segundo par de anéis, mantendo este padrão em toda a extensão da cadeia polimérica. A resposta redox dos filmes nos permitiu observar a preferência do polímero pela entrada de cátions em sua estrutura. Nos espectros de FTIR também comprovamos a presença do grupo carboxílico na estrutura do polímero, o que permitiu uma imobilização enzimática por ligação covalente. A confecção de microeletrodos destinados para a análise por injeção em fluxo (FIA) nos possibilitou uma economia de reagentes, praticidade e boa reprodutibilidade das medidas. Os biossensores amperométricos obtidos pela imobilização covalente da PFO sobre filmes de PPI-2-COOH apresentaram um pH ótimo de funcionamento em 9,4 e um potencial ótimo de trabalho em +70 mV vs Ag/QRE. Finalizamos nosso trabalho obtendo as respostas amperométricas dos biossensores para a detecção de um composto fenólico, pirocatecol, com uma linearidade entre as concentrações de 5x10-4 até 2,5x10-2 mol/L. / In this work, we present the electrochemical synthesis of a new conducting polymer derived of polypyrrole (PPI) functionalized by carboxylic group, the polypyrrole-2-carboxylic acid, and its application as amperometric transducer in biosensor by use of polyphenol oxidase (PFO). All the steps of syntheses and characterization of the polymer film in microelectrodes and response of the biosensor build for detection of phenolic compost. Our study about electrosyntheses, electrochemical response of the films (PPI-2-COOH) together with microgravimetry result and the molecular modeling of dimer and trimer derived from PI-2-COOH allowed one to suggest, for the first time, the mechanism of electropolymerization of this monomer in non-aqueous medium. When the technique of in-situ ultraviolet-visible spectroscopy (UV-VIS in-situ) was observed two bands, identical to the transition pi-pi* which are characteristics of the PPI films on their neutral state and of bigger doping, confirming the possibility that there may be two conformations in the PPI-2-COOH chain. With the molecular modeling of an oligomer formed by PI-2-COOH oxidation, we verified that for each four heterocyclic ring coupled together in the position 4-5, there´s a pair of rings, maintaining this pattern in all the extension of the polymeric chain. The redox response through the electrochemical measurement we could observe in FTIR the polymer preference for the cations adsorption. On the FTIR measurements, we could also observe the presence of the carboxylic group in the polymers structure, which is needed for the enzymatic immobilization by covalent binding. The fabrication of the microelectrode destined to flow injection analysis (FIA), made possible not only to save a lot of reagents, but also demonstrated praticity in the experimental set up and good reproducibility of results. Hence, the obtaining of amperometric biosensor by covalent binding of PFO on the PPI-2-COOH film, presented good pH in 9.4 and great work potential in +70 mV vs Ag/AgCl. We finish the work with the amperometric response of the biosensor in the detection of pyrocatechol, forming a straight line between the concentrations of 5x10-4 to 2.5x10-2 mol/L.

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Another alternative are the electrochemical processes as electro-oxidation and electrocoagulation. The aim of this study was to evaluate the removal efficiency of the EE2 for biological or/and electrochemical process. The crude extract containing the laccase from Pycnoporus sanguineus was immobilized in Ca/Cu-alginate-chitosan beads. For partial characterization were determined optimum pH and optimum temperature of enzyme activity, for free and immobilized enzyme. Biological remediation was performed in these conditions: shaking (100 rpm); temperature at 28°C (± 2); times of 4, 8 and 24 hours; EE2 solution buffered at pH 4 and 5, and EE2 solution without addition of buffer. For the electrochemical remediation: magnetic stirring; voltage of 2.5, 5 and 7.5 V; times of 10, 20 and 40 minutes; pHs 5 and 7. For bio-electrochemical remediation the best conditions were used. In the remediation assays of the EE2 with immobilized enzyme, the best result was obtained for the support Ca-alginate-chitosan with 89.81% (± 2.71) removal, in sodium acetate buffer pH 5.0 and 24 hours of treatment. Under the same conditions to the free enzyme, 91.81% (± 0.86) of removal was obtained. For electrochemical remediation with titanium electrode, 86.21% (± 9.30) was removed in pH 7 phosphate buffer and 40 minutes. For sequential bio-electrochemical remediation, EE2 concentrations were below the limit of detection of the chromatograph, with the removal by immobilized enzyme acting in unbuffered solution. It can be concluded that the two technologies are very effective for the removal of the EE2. / Hormônios são lançados constantemente em esgotos, sejam oriundos de excretas humanas ou animais, sejam de resíduos provenientes das indústrias farmacêuticas, não tratados de forma eficaz. O despejo destes micropoluentes nos recursos hídricos produz grande impacto ambiental, como desregulação do sistema endócrino em animais. O 17α-etinilestradiol (EE2) é o mais popular estrogênio sintético, sendo encontrado nos recursos hídricos em concentrações consideráveis. Diversas estratégias estão sendo estudadas para remediação deste poluente. Enzimas como as lacases, que possuem baixa especificidade, são capazes de oxidar diversos poluentes, sugerindo assim seu potencial no tratamento de efluentes. Outra alternativa são os processos eletroquímicos, como a eletro-oxidação e eletrocoagulação. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência de remoção do EE2 por processo biológico ou/e eletroquímico. O extrato bruto contendo a lacase de Pycnoporus sanguineus foi imobilizado em beads de quitosana-alginato-Ca/Cu. Para caracterização parcial da enzima livre e imobilizada foram determinados pH e temperatura ótima de atividade enzimática. A remediação biológica foi realizada nas condições: agitação (100 rpm); temperatura em 28°C (± 2); tempos de 4, 8 e 24 horas; solução de EE2 tamponada em pHs 4 e 5, e solução do hormônio sem adição de tampão. A remediação eletroquímica: agitação magnética; tensão de 2,5, 5 e 7,5 V; tempos de 10, 20 e 40 minutos; solução de EE2 tamponada em pHs 5 e 7. Para remediação bio-eletroquímica, de modo sequencial, foram utilizadas as condições mais adequadas para ambas as tecnologias. Nos ensaios de remediação do hormônio EE2 com a enzima imobilizada, o melhor resultado foi obtido para beads de quitosana-alginato-Ca com remoção de 89,81% (± 2,71) em tampão acetato de sódio pH 5 e 24 horas de tratamento. Nas mesmas condições, para a enzima livre foi obtido 91,81% (± 0,86) de remoção. Para remediação eletroquímica, com eletrodo de titânio foi removido 86,21% (± 9,30) do EE2, em tampão fosfato pH 7 e 40 minutos. Para a remediação bio-eletroquímica em modo sequencial, obteve-se remoção do EE2 em concentrações abaixo do limite de detecção do cromatógrafo, com a enzima imobilizada atuando em solução não tamponada. Conclui-se que as duas tecnologias são bastante eficientes para a remoção do EE2, podendo ser utilizadas separadamente ou em conjunto.

Dans ce mémoire nous discutons le développement de l’électrode de travail d’un bioréacteur électrochimique, dispositif permettant de synthétiser suivant un procédé dit de « Chimie Verte » des substances chimiques à haute valeur ajoutée. L’électrode de travail étant le siège de la synthèse électrocatalytique en jeu, l’optimisation de sa structure a été étudiée dans le but de maximiser l’aire de sa surface active. L’élaboration d’électrodes macroporeuses hautement organisées et de taille définie par les dimensions du prototype du réacteur pilote, a pu être obtenue en utilisant la méthode de Langmuir-Blodgett pour assembler le cristal colloïdal servant de template. La formation de ce dépôt organisé de colloïdes est suivie de l’électrodéposition du matériau d’électrode puis de la dissolution du template afin de révéler la structure macroporeuse. L’immobilisation de l’intégralité du matériel bio-électrocatalytique à l’intérieur des pores a été investiguée dans le but de prévenir la pollution du milieu contenant le produit final d’électrosynthèse par un des constituants redox et d’augmenter la durée de vie du dispositif. Ainsi, des couches ultra-minces de silice électrogénérée et des matrices de polymère électrodéposé ont été étudiées dans le but de préserver et d’optimiser l’activité enzymatique du système qu’elles encapsulent. Une attention particulière a été portée sur la qualité des dépôts au sein des structures poreuses. La procédure d’immobilisation des protéines rédox dans les matrices de silice et de polymère a été en outre associée à un jeu de construction moléculaire qui a permis par l’instauration de diverses interactions électrostatiques, de retenir toutes les espèces responsables de la catalyse à la surface de l’électrode. Enfin, dans le but d’intensifier les réactions catalytiques responsables de la synthèse à réaliser, des nano-particules d’ormodifiées par une couche monomoléculaire d’un médiateur redox ont été incorporées aux différents matériaux d’immobilisation permettant de ce fait d’augmenter les interfaces d’échanges électrochimiques entre matériau conducteur et biomolécules. L’insertion de ces nano-objectscombinée à la nanostructuration du matériau d’électrode a permis de multiplier par plus de 170 fois l’intensité des réactions enregistrées. / The present work deals with the development of the working electrode of an electrochemicalbioreactor. This device enables the green synthesis of high added value chemical compounds. As theelectrochemical synthesis is located at the interface of the working electrode, structural optimizationof this reactor key component is required in order to maximize the available active surface area.Elaboration of highly organized macroporous gold electrodes with a size required by the pilot reactordimensions were obtained with the Langmuir-Blodgett method that was used to assemble a colloidalcrystal as a template. The elaboration of the organized colloidal deposit is first followed by theelectrodeposition of the electrode material, then by the dissolution of the template. The immobilization of the complete bio-electrochemical system inside the electrode pores was investigated in order to prevent pollution of the final product medium by one of the catalytic chaincomponent. This also improves the device life time. Subsequently electrogenerated ultra-thin silicalayers and electrodeposited polymer matrices were studied in order to preserve and optimize the catalytic activity of the redox proteins. In order to enhance the electrocatalytic synthesis, mediatormodified gold nanoparticules were incorporated in the different immobilization matrices. This allowed to increase the area of the electrochemical interface. The combination of the nano-objectincorporation and electrode nano-structuring intensified by a factor of 170 the catalytic process. / Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung einer Arbeitselektrode für einenelektrochemischen Bioreaktor, der die umweltfreundliche Synthese von wertvollen chemischenKomponenten ermöglicht. Da die elektrochemische Synthese an der Oberfläche der Arbeitselektrodestattfindet, ist es nötig, den strukturellen Aufbau der Schlüsselkomponente des Reaktors zuoptimieren und die aktive Oberfläche der Elektrode zu erhöhen. Mit Hilfe der Langmuir-BlodgettTechnik wurden kolloidale Kristalle erzeugt, die als Template dienten, um hochgeordnetemakroporöse Goldelektroden, deren Dimensionen von dem Pilotreaktor bestimmt wurden,herzustellen. Nach dem Erzeugen von geordneten kolloidalen Filmen wurde der Zwischenraumzwischen den Partikeln mittels elektrochemischer Abscheidung gefüllt und das Templateanschließend chemisch aufgelöst. In der Folge wurde die Immobilisierung des komplettenbioelektrochemischen Systems im Poreninnenraum untersucht, mit dem Ziel eine Verunreinigung desReaktionsmediums durch eine der katalytischen Komponenten zu verhindern. Die Lebensdauer derElektrode kann so zusätzlich erhöht werden. Es wurde untersucht, inwieweit durch elektrogenerierteultra-dünne Silikaschichten oder durch Elektroabscheidung erzeugte Polymerfilme die katalytischeAktivität der Redoxproteine erhalten und weiter optimiert werden kann. Goldnanopartikel, die miteinem Mediator modifiziert wurden, wurden in die jeweilige Immobilisationsschicht integriert, mitdem Ziel die Effizienz der elektrokatalytischen Synthese zu erhöhen. Auf diese Weise konnte dieaktive elektrochemische Oberfläche der Elektrode weiter erhöht werden. Die Kombination aus einernanostrukturierten Elektrode und Nanoobjekten die in die Immobilisationsschicht eingebettetwurden, führte zu einer Signalerhöhung des katalytischen Prozesses um mehr als eineGrössenordnung.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5238.pdf: 5294587 bytes, checksum: 025b13ac00d18b1830afac47325d6ffe (MD5) Previous issue date: 2013-04-29 / Financiadora de Estudos e Projetos / In this study, our goal was evaluate the interactive forces between the Atomic force microscope tip (AFM tip) and an important enzyme responsible to fatty acids synthesis in all living beings (Acetyl CoA Carboxylase - fic biosensors to detect pesticides molecules used in agriculture. The AFM tip can be functionalized through its oxidation with spacer molecules. In order to simulate computationally this modified AFM tip that was called surface spacer-agent (SSA) using molecular dynamic (MD) simulations, the force field (FF) parameters had to be calculated. The FF parameters were obtained using quantum mechanical calculations and were implemented in an appropriate FF protocol. Three types of geometric molecular orientations of the ACCase were evaluated as a starting point to enzymatic immobilization, but only one was used to MD simulation. The criteria to define xyz orientation were basically based on the active sites from the ACCase enzyme are available to interact with molecules from the bulk and the surface contact area of the enzyme interacting with SSA ensure an strong interaction force to maintain the enzyme immobilized on the tip. Surface contact area, hydrogen bonds and protein stability were the parameters monitored during the MD trajectory as the enzymeherbicide interactions using a combination of molecular docking and molecular dynamics. The clusters formed using docking calculations in different regions along the ACCase enzyme were submitted to MD simulations in order to measure interactive energies of the system. / Neste estudo, o objetivo foi quantificar e analisar as forças de interação entre a ponta do microscópio de força atômica (AFM) modificada quimicamente com moléculas ligantes e uma importante enzima responsável pela síntese de ácidos graxos em todos os seres vivos, a Acetil CoA carboxilase - ACCase. Nosso objetivo é desenvolver biossensores específicos para a detecção de pesticidas usados na agricultura. A fim de simular computacionalmente esta superfície modificada, utilizando a metodologia de dinâmica molecular (MD), os parâmetros campo de força foram desenvolvidos e implementados no modelo computacional aqui proposto. Estes parâmetros foram obtidos utilizando cálculos de mecânica quântica e implementados no campo de força do programa de MD utilizado. Três tipos de orientações moleculares da ACCase foram avaliadas como ponto de partida para os cálculos de MD, porém, apenas uma posição foi utilizada para a simulação. Os critérios para definir a orientação espacial da enzima na superfície tiveram com base a localização dos sítios ativos da enzima e a área de contato da enzima com a superfície funcionalizada. Este último parâmetro foi levado conta com a intenção de assegurar uma força de interação forte o suficiente para manter a enzima imobilizada na ponta sem que haja o despreendimento da mesma devido a fracas interações. Superfície de contacto, ligações de hidrogênio e estabilidade estrutural da proteína foram os parâmetros avaliados e monitorados. As regiões da enzima expostas para interação com as moléculas do bulk foram avaliadas utilizando uma combinação de docking molecular e dinâmica molecular. Os clusters formados dos cálculos de docking em diferentes regiões da enzima ACCase foram submetidos a simulação por MD para o cálculo das energias envolvidas no sistema.