Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2017-02-24T13:45:52Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Caroline Menti.pdf: 287733 bytes, checksum: 1e558da754c143ffdcf1b15be9ec54fc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-24T13:45:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Caroline Menti.pdf: 287733 bytes, checksum: 1e558da754c143ffdcf1b15be9ec54fc (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul, FAPERGS.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-01-20Bitstream added on 2014-06-13T20:38:24Z : No. of bitstreams: 1 uliana_cv_me_araiq.pdf: 918548 bytes, checksum: 4ad442ea1851369c0a0d4d0151318282 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente trabalho relata o desenvolvimento de um biossensor amperométrico para detecção do vírus da Hepatite C (HCV) por meio da reação de hibridização do DNA imobilizado na superfície do eletrodo com o DNA complementar proveniente de amostras de soro de pacientes. Neste dispositivo, a reação da enzima peroxidase com o substrato peróxido de hidrogênio e com o mediador de elétrons ácido 5-aminossalicílico é utilizada como marcadora da reação de hibridização. Estudos eletroquímicos e espectrofotométricos foram empregados na investigação do produto da oxidação do mediador pela enzima, sugerindo-se que este seja um complexo formado entre o Fe4+ presente no grupo heme da peroxidase e o grupo NH2 do ácido 5-aminossalicílico. Este complexo sofre redução na superfície do eletrodo resultando na resposta analítica do sistema proposto. Na construção do biossensor, os eletrodos de ouro, obtidos a partir de CDs graváveis denominados CDtrodos, foram modificados com monocamadas auto-organizadas de ácido lipóico 1,0 x 10-3 mol L-1 por 120 minutos. Estudos quimiométricos, por meio do planejamento fatorial completo e fracionado, foram aplicados para obtenção das melhores condições de imobilização das biomoléculas, compreendendo a concentração e o tempo de incubação dos CDtrodos nas soluções da proteína estreptavidina, da sonda de DNA específica para o HCV genótipos 1 e 3, do DNA complementar e do conjugado avidina-peroxidase, marcador da reação de hibridização. O valor de cut-off foi determinado como sendo de –0,599 A e biossensor foi então aplicado em amostras positivas para HCV. Os resultados mostraram que o biossensor desenvolvido é adequado para aplicação em amostras dos genótipos 1 e 3, os quais prevalecem no Brasil. / This work presents the development of an amperometric biosensor for the detection of Hepatitis C virus (HCV) through the reaction of hybridization of DNA immobilized on the electrode surface with the complementary DNA (c-DNA) from serum samples of patients. In this device, the reaction of the enzyme peroxidase with the substrate hydrogen peroxide and with the electron mediator 5-aminossalicylic acid is used as hybridization label. Electrochemical and spectrophotometric studies were carried out to investigate the oxidation product of the mediator by the enzyme, suggesting that one is a complex formed between the Fe4+ of heme peroxidase group and NH2 group of 5-aminossalicylic acid. This complex undergoes reduction in the electrode surface resulting in the analytical response of the proposed system. For the construction of the biosensor, the gold electrodes, obtained from recordable CDs namely CDtrodes, were modified with self-assembled monolayers of lipoic acid 1.0 x 10-3 mol L-1 for 120 minutes. Chemometric studies, through the full and fractional factorial design, were applied to obtain the best conditions for the biomolecules immobilization, including the concentration and the incubation time of CDtrodes in the solutions of the protein streptavidin, the DNA probe specific for the HCV genotypes 1 and 3, c-DNA and the avidin-peroxidase conjugate, label of the reaction of hybridization. The cut-off value was determined as -0599 A and the biosensor was applied for HCV positive samples. The results showed that the developed biosensor is suitable for application in samples of genotypes 1 and 3, which are those that prevail in Brazil.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-04-25Bitstream added on 2014-06-13T20:38:25Z : No. of bitstreams: 1 prado_tm_me_araiq.pdf: 1251787 bytes, checksum: e701c01c70d3c55f076e7d02386ea0b5 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente trabalho mostra o desenvolvimento do primeiro biossensor descrito na literatura para determinação de antibióticos β-lactâmicos, usando pasta de carbono modificada com a enzima β-lactamase, e sua aplicação em amostras de leite de vaca in natura. A partir de estudos prévios de otimização da preparação do biossensor, o grafite em pó foi ativado com carbodiimida para permitir a ligação covalente da enzima β-lactamase que, junto com o mediador de elétrons ftalocianina de cobalto ofereceram variações na corrente catódica na presença da penicilina G, sendo esta escolhida para representar os antibióticos β-lactâmicos. Utilizando este procedimento para a construção dos biossensores, foi possível registrar voltamogramas cíclicos e amperogramas que permitiram quantificar a benzilpenicilina (penicilina G) em condições de análise também otimizadas, que incluíram estudo da quantidade de mediador na pasta; o pH, tipo e concentração do eletrólito usado para realização das medidas e o potencial aplicado na amperometria. Com o método otimizado foi possível detectar penicilina G em amostras de leite in natura, fortificadas com o antibiótico, com alta exatidão (erro relativo de 1%) e boa precisão (desvio padrão relativo de 8,3%, n = 3), mostrando que o biossensor desenvolvido é uma ferramenta promissora para detecção de penicilinas, e que ao serem realizados mais estudos para diminuir seu limite de quantificação, poderá se tornar uma um método de análise alternativo aos kits comerciais existentes / This work describes the development of the first biosensor described in the literature for the determination of β-lactam antibiotics using a carbon paste electrode modified with the enzyme β-lactamase, and its application in samples of fresh cow's milk. After optimizing the biosensor preparation procedure, the graphite powder was activated with carbodiimide to allow covalent binding of the enzyme β-lactamase, which together with the electron mediator, cobalt phthalocyanine, offered variations in cathodic currents in the presence of penicillin G, which was chosen as representative of the β-lactam antibiotics. Using this procedure for the construction of biosensors, it was possible to record cyclic voltammograms and amperograms that enabled quantification of benzylpenicillin (penicillin G) under analytical conditions that had been optimized in terms of the amount of mediator in the paste, the pH, the type and concentration of the electrolyte used in the measurements, and the applied amperometric potential. With the optimized method, it was possible to detect penicillin G in samples of fresh milk fortified with the antibiotic, with high accuracy (error of 1%) and adequate precision (RSD of 8.3%, n=3), demonstrating that the proposed biosensor is a promising tool for the detection of penicillins. Once quantitation limits have been further improved, the analytical method could become an alternative to existing commercial kits

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-18Bitstream added on 2014-06-13T19:38:08Z : No. of bitstreams: 1 boni_tc_me_araiq.pdf: 641126 bytes, checksum: 96c81cb1d84e4b33d5cd556438ad7458 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este trabalho descreve o desenvolvimento e aplicação de um sensor biomimético descartável com transdução amperométrica, sensível a hidroquinona (HQ). Para isto, eletrodos impressos de grafite – SPE (FS-1, Florence sensors®) foram modificados com um catalisador biomimético do sítio ativo da tirosinase, uma cupro-enzima. O complexo de cobre usado foi o cloreto de tris-2,2’-bipiridil cobre II, [Cu(dipy)3]Cl2. Para efeitos de comparação também foram preparados sensores empregando eletrodos de carbono vítreo convencionais (GC). Os sensores foram preparados modificando os eletrodos SPE e GC com membrana de Nafion® dopada com o complexo de cobre. Para tal, foram misturados em aparelho de ultrassom, 100 μL de uma solução de complexo 5 mg mL-1, preparada em dimetilformamida (DMF) com 50 μL de solução de Nafion® a 5 % (v/v). A seguir, 100 μL da mistura foram colocados na superfície do GC e 10 μL sobre o SPE. A resposta do sensor à base de SPE (sensor- SPE) foi otimizada usando amperometria. Obtendo-se as melhores respostas em tampão Pipes 0,01 mol L-1 contendo 60 μmol L-1 de H2O2 e aplicando potencial de -300 mV vs Ag/AgCl. Sob estas condições o sensor-SPE mostrou uma faixa de resposta entre 6,0 x 10-5 e 5,6 x 10-4 mol L-1, sensibilidade de 5593,6 μA L mol-1, limite de detecção e quantificação de 5,4 x 10-6 e 1,80 x 10-5 mol L-1, respectivamente. Tratando-se de um sensor biomimético seu comportamento hiperbólico foi confirmado, e a constante aparente de Michaellis-Menten foi calculada através do gráfico de duplo recíproco obtendose um valor de 5,6 x 10-5 mol L-1, indicando uma alta afinidade do complexo pela HQ. Estudos voltamétricos também foram realizados visando à caracterização eletroquímica do sistema proposto. A seletividade do sensor foi estudada em vários compostos fenólicos... / This paper describes the development and application of a biomimetic sensor disposable with amperometric transduction, sensitive to hydroquinone (HQ). For this, printed graphite electrodes - SPE (FS-1, Florence sensors®) were modified with a biomimetic catalyst of the active site of tyrosinase, a cupro-enzyme. The copper complex used was the tris–2,2'-bipyridil cooper (II) chloride, [Cu(dipy)3]Cl2. For comparison were also prepared sensors employing conventional glassy carbon electrodes (GCE). The sensors were prepared by modifying the SPE and GCE electrodes with Nafion® membrane doped with the copper complex. For this, were mixed in an ultrasonic apparatus, 100 μL of 5 mg mL-1 complex solution, prepared in dimethylformamide (DMF), with 50 μL of Nafion® 5% (v/v) solution. Then 100 μL of this mixture were placed on the surface of GCE and 10 μL on the SPE. The response of the SPE-based sensor (sensor-SPE) was optimized using amperometry. Obtaining the best responses in 0.01 mol L-1 Pipes buffer containing 60 μmol L-1 H2O2 and applying potential of -300 mV vs Ag/AgCl. Under these conditions the SPE-sensor showed a response range between 6.0 x 10-5 and 5.6 x 10-4 mol L-1, sensitivity of 5593.6 μA L mol-1, limit of detection and quantification of 5.4 x 10-6 and 1.80 x 10-5 mol L-1, respectively. In this case, the hyperbolic behavior of the sensor response was confirmed, and the Michaelis-Menten apparent constant was calculated by the Lineweaver-Burk graph, obtained a value of 5.6 x 10-5 mol L-1, indicating a high affinity of the complex for the HQ. Voltammetric studies were also conducted to the electrochemical characterization of the proposed system. The selectivity of the sensor was studied in some phenolic compounds and the reproducibility in the sensors construction was evaluated as the relative standard deviation... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Sidney José Lima Ribeiro / Co-orientador: Marli Leite de Moraes / Banca: José Mauricio Almeida Caiut / Banca: Rogéria Rocha Gonçalves / Resumo: A construção de filmes pela técnica layer-by-layer com fibroína de seda (SF) e amiloide β de 40 aminoácidos (Aβ40) para aplicação em imunossensores eletroquímicos e ópticos foi investigada. O crescimento desses filmes foi confirmado por voltametria cíclica (VC) pela área dos voltamogramas e também por espectroscopia na região ultravioleta-visível (UV-vis) pela absorbância do filme em 230 nm. O recobrimento completo do eletrodo pela SF foi verificado por VC utilizando solução de ferri/ferrocianeto de potássio. A distorção dos voltamogramas foi observada com maior tempo de adsorção e o tempo de 30 minutos foi considerado como cobertura completa do eletrodo. Também foi verificada uma mudança de estrutura do peptídeo em filme juntamente com a SF por dicroísmo circular (CD). Em solução a Aβ40 apresentou um espectro característico de α-hélice, e quando incorporada no filme observou-se uma predominância de folhas-β. Para o imunossensor óptico, utilizou-se nanopartículas de YVO4:Eu3+ para monitorar a emissão do íon európio. Os filmes tiveram máximo de excitação em 270 nm e a emissão do Eu3+ em 619 nm e também uma emissão em 300 nm associada à SF e ao peptídeo. Após a adição dos anticorpos houve uma diminuição da emissão em 300 nm e um aumento da emissão em 619 nm, associada à uma transferência de energia entre SF e Aβ40 e o európio. Na detecção óptica foi verificado que o anticorpo era incorporado ao filme mesmo sem a presença do peptídeo, fazendo necessárias mudanças experimentais para diminuir interações não específicas. A detecção eletroquímica da solução de anticorpos anti-Aβ 40 foi feita por VC, e foi observada uma mudança nas correntes obtidas em potenciais positivos, principalmente em 0,3V e também da área dos voltamogramas; em ambos os casos é verificada uma região linear entre 0 e 10 ng.mL-1 e essa resposta foi obtida apenas... / Abstract: Silk fibroin (SF) and amyloid-β with 40 aminoacids (Aβ40) layer-by-layer (LbL) films for optical and electrochemical imunosensing applications were investigated. The growth of this films was confirmed by cyclic voltammetry (VC), observing changes in the voltammogram area and ultraviolet-visible region spectroscopy (UV-vis), observing increasing absorbance in 230 nm. The complete covering of an carbon electrode was verified using potassium ferrocyanide and ferricyanide in VC. There was distortion of the voltammograms with increasing adsorption time for the SF, and with 30 minutes was observed the maximum distortion, and therefore maximum electrode coverage. A conformation change of the peptide Aβ40 in the film was also observed using circular dichroism (CD). In the solution the peptide presented an characteristic spectrum of α-helix structure and in the film was observed the predominance of β-sheet structure. For the optical immunosensor an YVO4:Eu3+ nanoparticle suspension to monitor the europium emission. The LbL films had an excitation maximum centered in 270 nm and the europium emission in 619 nm, it was also observed an emission centered in 300 nm attributed to the SF and Aβ40. After the addition of antibodies, it was observed an increase in Eu3+ emission and a decrease of protein emission, associated with an energy transfer from SF/Aβ40 to the Eu3+. In the optical detection this effect was observer in the absence of peptide, therefore non-specific interactions between antibodies and the substrate. The electrochemical detection of the antibodies solution was performed with VC and were observed changes in voltammograms: an increase of current in positive potentials and an increase in voltammogram area. Both had a linear response in the 0 through 10 ng.mL-1 range and this response was observed only in the presence of the Aβ40. / Mestre

Orientador: Paulo Roberto Bueno / Co-orientador: Fernanda Carvalho / Banca: Hideko Yamanaka / Banca: Ronaldo Censi Faria / Resumo: A dengue é uma doença infecciosa, não contagiosa, causada por um Flavivirus, transmitido pela picada do mosquito Aedes aegypti infectado. Sua evolução é rápida, o diagnóstico é baseado em sintomas clínicos imprecisos e laboratorial demorado e inespecífico, o tratamento é paliativo, trata-se os sintomas e não a infecção. Neste contexto, a proteína NS1, glicoproteína não estrutural do vírus da dengue, tem sido utilizada comercialmente como alvo para diagnóstico, pelo método ELISA. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um biossensor eletroquímico para diagnóstico da dengue baseado na detecção da proteína NS1, por técnica impedimétrica e capacitiva. Pela técnica impedimétrica, monocamadas auto-organizadas de alcanotióis, sobre os eletrodos de ouro, formadas pelo ácido 11-mercaptoundecanóico e 6-mercapto-1-hexanol foram usadas para ancorar o anticorpo anti-NS1 e minimizar o impedimento estérico entre as proteínas, respectivamente. Esta camada funcionalizada e sua interação com o analito, proteína NS1, geram um bloqueio para reações redox da espécie eletroativa [Fe+2(CN)6]4-/Fe+3(CN)6]3- contidas na solução de PBS, resultando em um aumento da resistência a transferência de carga em função da concentração do analito alvo. Para a abordagem capacitiva, foram utilizados os alcanotióis ácido 16-mercaptohexadecanoico e 11-ferrocenil-undecanotiol sobre o eletrodo de ouro para ancorar o anticorpo anti-NS1 e as medidas foram realizadas em TBAClO4 dissolvido em acetonitrila. Nesta técnica, esta camada funcionalizada e sua interação com o analito, proteína NS1, geram uma variação do sinal de capacitância redox ( ). Por Espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) e Voltametria Cíclica (CV), pôde-se verificar que a capacidade impedimétrica à transferência de carga foi gradativamente aumentada pela construção da monocamada, imobilização do anticorpo... / Abstract: Dengue is a non-contagious infectious disease caused by a Flavivirus transmitted by a bite of infected mosquito Aedes aegypti. The evolution is fast, the diagnosis is based on clinical symptoms inaccurate and prolonged and nonspecific laboratory, the treatment is palliative, is treated the symptoms and not the infection. In this context, NS1 protein, nonstructural glycoprotein of dengue virus has been used commercially as a diagnostic target by ELISA. The aim of this study was to develop an electrochemical biosensor for dengue diagnosis based on the detection of this protein, by impedimetric and capacitive technique. Through impedimetric technique, self-assembled monolayers of alkanethiols on gold electrodes formed by 11-mercaptoundecanoic acid and 6-mercapto-1-hexanol were used to anchor the anti-NS1 antibody and minimize steric hindrance between the proteins, respectively. This functionalized layer and its interaction with the analyte, the NS1 protein, generate a lock for redox reactions of electroactive species [Fe+2(CN)6]4-/Fe+3(CN)6]3- contained in the PBS solution, resulting in an increase in charge transfer resistance due to the concentration of the target analyte. For capacitive approach, alkanethiols acid 16-mercaptohexadecanoico and 11-ferrocenyl-undecanotiol on gold electrode were used to anchor the anti-NS1 antibody and measurements were performed in TBAClO4 dissolved in acetonitril. In this technique instead of a steric hindrance, this functionalized layer and its interaction with the analyte, the NS1 protein, generate a variation of signal redox capacitance ( ). Initially ELISA test was performed to verify and confirm the specificity of interaction anti-NS1 by NS1. Through Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV) can be verified that impedimetric ability to transfer load was gradually increased by the construction of the monolayer, immobilization of... / Mestre

Orientador: Eduardo Maffud Cilli / Co-orientador: Paulo Roberto Bueno / Banca: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Saulo Santerro Garrido / Banca: Thatyane Morimoto Nobre Pavinatto / Resumo: O diagnóstico precoce desempenha um papel importante no sucesso do tratamento da maioria das doenças. O desenvolvimento de dispositivos "label free" aliados às técnicas eletroanalíticas permite o desenvolvimento de métodos rápidos e de baixo custo para avaliar o estágio de doenças e/ou a eficácia do tratamento. Biossensores redox capacitivos foram recentemente introduzidos como uma plataforma de ensaios eletroanalíticos com grande potencial para o desenvolvimento deste tipo de dispositivo. No presente trabalho foram sintetizados peptídeos marcados com uma sonda redox, no caso o ferroceno (fc), capazes de formarem monocamadas auto-organizadas em interfaces metálicas, para utilização em ensaios de diagnósticos. Os peptídeos de sequências: Ac-Cys-Ala-Ala-Lys(fc)-Ala-Ala-COOH e Fc-Lys-Ala-Ala-Cys-NH2, foram sintetizados em fase sólida de modo que: 1) a cadeia lateral do resíduo de cisteína foi ligada covalentemente ao eletrodo de ouro (grupo enxofre); 2) a extremidade C-terminal ou a cadeia lateral do resíduo de Lys foram responsáveis, individualmente, pelo acoplamento do anticorpo anti-CRP; 3) a cadeia lateral do resíduo de Lys ou a extremidade N-terminal foram utilizadas, individualmente, para fixar o grupo ferroceno na cadeia peptídica. Apesar das sínteses terem mostrado dificuldade, os peptídeos puderam ser obtidos com sucesso. Após a fixação do peptídeo contendo ferroceno ao ouro, o anticorpo, que identifica a proteína C-reativa, foi acoplado ao sistema. A proteína C-reativa é importante, pois age como um biomarcador de processos inflamatórios e doenças cardiovasculares. Técnicas eletroquímicas como voltametria cíclica, espectroscopia de impedância e capacitância eletroquímica foram utilizadas para a caracterização do sistema e para a determinação da ligação da proteína ao anticorpo. O sistema desenvolvido utilizando a capacitância foi eficaz... / Abstract:Early diagnosis plays an important role in the successful treatment of diseases. The development of "label free" devices, coupled with the electroanalytical techniques allows the development of low cost and fast methods for evaluating the stage of disease and/or treatment efficacy. Redox capacitive biosensors have recently been introduced as a platform of electroanalytical assays with great potential for the development of this type of device. In this study peptides labeled with a redox probe, in the case ferrocene (fc), were synthesized capable to form self-assembled monolayers on metal interfaces for use in diagnostic assays. The sequences of peptides: Ac-Cys-Ala-Ala-Lys(fc)-Ala-Ala-Fc-COOH and Lys-Ala-Cys-NH2 were synthesized on solid phase: 1) the side chain of the cysteine residue is covalently bound to the gold electrode (sulfur group); 2) the C-terminal or side chain of Lys accounted individually by coupling the anti-CRP; 3) the side chain of Lys or the N-terminal were used individually to fix the ferrocene group in the peptide chain. Despite the syntheses have shown difficulty, the peptides were successfully obtained. After peptide attachment to gold containing ferrocene, the antibody which identifies C-reactive protein, was attached to the system. C-reactive protein is important because it is a biomarker of inflammation and cardiovascular disease. Electrochemical techniques such as cyclic voltammetry, electrochemical impedance and capacitance spectroscopy were used to characterize the system and determinate the protein binding to the antibody. The system was developed using the capacitance to detect C-reactive protein, detection limits of 0.8 nmol L-1 and 0.31 nmol L-1 were found for the peptides Ac-Cys-Ala-Ala-Lys(fc)-Ala-Ala-Fc-COOH and Fc-Lys-Ala-Ala-Cys-NH2, respectively, and stable redox capacitive signal. Thus, the number of amino acids that forms the monolayer has shown a correlation... / Mestre

Orientador: Marystela Ferreira / Banca: Debora Terezia Balogh / Banca: Débora Gonçalves / O Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Materiais, PosMat, tem caráter institucional e integra as atividades de pesquisa em materiais de diversos campi da Unesp / Resumo: Neste trabalho, investigou-se a fabricação e caracterização de filmes ultrafinos de poli(alilamina hidroclorada) PAH com as enzimas glicose oxidase (GOx) e invertase (INV) no desenvolvimento de biossensores amperométricos para a detecção de glicose e sacarose. Filmes nanoestruturados obtidos pela técnica layer-by-layer (LbL) possibilitaram estudar a imobilização de cada enzima juntamente com o polieletrólito, além de diversas arquiteturas bienzimáticas mais complexas, em eletrodos modificados com Azul da Prússia, no desenvolvimento do biossensor. O crescimento dos filmes produzidos foi acompanhado por técnicas de espectroscopia UV-vis e fluorescência; além de técnicas eletroquímicas de voltametria cíclica e amperometria na avaliação das propriedades e resposta do biossensor. Por fim, investigou-se o aprimoramento do biossensor e análises qualitativas preliminares na avaliação de bebidas comerciais / Abstract: In this work, we investigated the fabrication and characterization of ultrathin films of poly(allylamine hydrochloride) PAH and the enzymes glucose oxidase (GOx) and invertase (INV) in the development of amperometric biosensors for glucose and sucrose detection. Nanostructured films obtained by layer-by-layer (LbL) technique were able to study the immobilization of each enzyme coupled with the polyelectrolyte, beyond different and more complex bienzimatic architectures, in Prussian Blue modified electrodes, for the biosensor development. The films' growth was monitored by fluorescence and UV-vis spectroscopic techniques; moreover electrochemical techniques such as cyclic voltammetry and amperometry were used on the evaluation of biosensor properties and response. At last, we investigated the biosensor improvement and qualitative initial analysis on the evaluation of commercial beverages / Mestre

Orientador: Germano Francisco Biondi / Coorientador: Elenice Deffune / Banca: Cáris Maroni Nunes / Banca: Márjorie de Assis Golim / Banca: Marli Leite de Moraes / Banca: Milton Hissashi Yamamura / Resumo: A cisticercose bovina é uma zoonose cosmopolita e presente nos rebanhos bovinos de corte no Brasil, que ocorre em países em desenvolvimento, onde a infraestrutura sanitária inadequada e as más práticas na criação de gado permitem a contaminação de pastagem e água com fezes humanas contendo ovos do parasita. Os prejuízos financeiros decorrem da condenação ou tratamento (salga ou da congelação) das carcaças infectadas, dependendo da intensidade da infecção. O diagnóstico da cisticercose bovina é realizado durante o abate, pela inspeção das carcaças e realização de cortes em locais de predileção do parasita como a língua, masseter, coração e diafragma. Assim, a fim de promover o diagnóstico ante-mortem e permitir o tratamento adequado de animais infectados, muitos estudos foram realizados utilizando-se técnicas de detecção de anticorpos ou antígenos em amostras de soro bovino. O teste ELISA baseado em anticorpos monoclonais (MAbs) para a detecção de antígeno circulante (Ag-ELISA) tem sido estudado, mas apresenta baixa sensibilidade em animais com infecção leve, e permite a sua realização apenas em laboratórios bem equipados. O uso de biossensores em medicina tem crescido nos últimos anos, permitindo a detecção e quantificação de metabólitos, bem como o uso de diversos biopolímeros como matriz de imobilização como quitosana e fibroína da seda. Imunossensores são biossensores cuja resposta bioquímica relaciona-se à interação antígeno-anticorpo, que podem ser utilizados para detectar anticorpos ou antígenos, tendo sido utilizados no diagnóstico de enfermidades. Nesta pesquisa, desenvolveu-se o primeiro imunossensor para o diagnóstico da cisticercose bovina, com filmes produzidos camada por camada (LbL) contendo um MAb dirigido contra antígeno bruto de metacestódeos de T. saginata (TAEB) e fibroína de seda (SF), imobilizados, que mostrou-se promissor ... / Abstract: Bovine cysticercosis is a cosmopolitan zoonosis and very widespread in the Brazilian beef cattle. Cysticercosis usually occurs in developing countries, where poor sanitation and bad raising cattle practices allows the contamination of the pasture and water with human feces containing eggs. The financial losses are due to condemnation or treatment (salting or freezing) of infected carcasses, depending on the intensity of infection. Diagnosis of bovine cysticercosis is routinely done during slaughter by meat inspection of carcasses and incisions in predicted sites of muscles such as tongue, masseter, heart and diaphragm. Thus, in order to promote the ante-mortem diagnosis and allow appropriate treatment of infected animals, many studies have been performed using techniques to detect antibodies or antigens in bovine serum. ELISA using monoclonal antibodies (MAbs) for the detection of circulating antigen (Ag-ELISA) has been studied, but presents low sensitivity in animals with low parasite burden, and allows its realization only in well-equipped laboratories. The use of biosensors in medicine has grown in recent years, allowing detection and quantification of numerous metabolites, such as immobilization matrix having the most diverse biopolymers such as chitosan and silk fibroin. Immunosensors are biosensors which biochemical response is related to antigen-antibody interaction and can be used to detect antibodies or antigens, and has been tested for diseases diagnosis. In this research, we developed the first immunosensor for bovine cysticercosis diagnosis, produced with layer-by-layer (LbL) films containing a monoclonal antibody against crude Taenia saginata metacestode antigens (TAEB) and silk fibroin (SF) immobilized. Immunosensor showed to be a promising tool for further application in the ante-mortem bovine cysticercosis diagnosis / Doutor

A caracterização das propriedades ópticas de moléculas de DNA, tais como a absorção e a fluorescência por excitação, são importantes para a determinação de parâmetros usados no desenvolvimento de biossensores fotônicos. O estudo da absorção óptica do DNA, obtido por diferentes métodos tem se mostrado muito eficiente na determinação do grau de pureza do material genético obtido por amplificação, ou extração e purificação do DNA total. Por outro lado, a fluorescência por excitação a partir de um marcador cromóforo é uma técnica importante em processos de quantificação de massa, em técnicas tais como a eletroforese em gel de agarose. Devido à baixa fluorescência de moléculas de DNA na região visível do espectro, entre 500-600nm, utiliza-se destes marcadores que se ligam à molécula e que são opticamente ativos nesta região para detecção de sua emissão de fluorescência. Neste trabalho foi realizado um estudo da fluorescência do DNA, obtido a partir de uma amplificação por transcriptase reversa do RNA (RT-PCR), na região de 400nm a 600nm, sem adição de marcador e utilizando excitação por um e dois fótons (405nm e 800nm) através da técnica de microscopia confocal. As amostras contendo solução de dsDNA (237ng/μL) foram depositadas sobre um filme de prata de 200nm de espessura que também é crescido previamente sobre um substrato de vidro. Sobre o filme metálico é fabricado nanoestruturas metálicas por de litografia por feixe de íons com um microscópio de duplo feixe FEI Quanta 3D 200i. As nanoestruturas são formadas por arranjos concêntricos de anéis com diâmetros de até 20 μm, largura 50nm e separados por 400nm. Quando a excitação do material genético ocorre sobre a nanoestrtutura o laser gera na nanoestrutura plasmon-polaritons de superfície (SPP) que interagem com as moléculas de dsDNA na solução. Observa-se que nas regiões onde as nanoestruturas são fabricadas que a intensidade de fluorescência da macromolécula é muito maior do que a obtida fora da estrutura e sobre o filme metálico. Os efeitos da interação entre SPPs e as moléculas aumentam a atividade óptica (taxa de emissão) e podem servir como base para a fabricação de sensores fotônicos ultrasensíveis. Concluindo, os efeitos dos campos plasmônicos sobre o fluoróforo são significativos e foram observados pela diminuição do tempo de vida das moléculas e o aumento da sua fluorescência. / The characterization of the optical properties of DNA molecules, such as absorption and excitation fluorescence, is important to the determination of the parameters used for the preparation of photonic biosensors. The study of optical absorption of DNA, obtained through different methods, currently has a high sensitivity to determine the degree of purity of the genetic material obtained by amplification, extraction and purification of the total DNA. On the other hand, excitation fluorescence using a marker is an important technique in mass quantification processes together with techniques such as agarose gel electrophoresis. Because of low fluorescence of DNA molecules, in the visible region of the spectrum, between 500-600nm, the use of labels that bind to the molecule are critically for the detection of their fluorescence emission. In this work we studied the DNA fluorescence, obtained from a RNA reverse transcriptase (RT-PCR) amplification, in the region from 400nm to 600nm, without the addition of a marker as a fluorophore and using confocal microscopy with one and two photons (405nm and 800nm). The solutions of dsDNA (237ng/μL) were dropped on a silver film with 200nm tackiness deposited on a glass substrate. In the silver film nanostructures were fabricated ion beam lithography with FEI Quanta 3D 200i dual beam microscope. The nanostructures are formed by concentric arrangements of rings with diameters up to 20 μm, width 50nm and separated by 400nm. When the excitation of the genetic material occurs on a nanostructure an excited surface plasmon-polaritons (SPP) is responsible for the DNA excitation. It is observed in these regions an increase of the fluorescence intensity many times higher than one obtained out of the nanostructure on the silver film. The effects of the interaction between SPPs and molecules increase the optical activity of the molecule (emission rate) and can serve as the basis of photonic sensors. Concluding, the effects of the plasmon fields on the fluorophore are significant and were observed by decreasing the life time of the molecules and the increasing of their fluorescence.