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B?squeda de enzimas LPMO de hongos para la producci?n de bioetanol a partir de material lignocelul?sicoCarvajal Loren, Gonzalo Nicol?s January 2014 (has links)
Tesis para optar al grado de Mag?ster en Ciencias de la Ingenier?a, Menci?n Qu?mica / Memoria para optar al t?tulo de Ingeniero Civil en Biotecnolog?a / La sociedad se enfrenta de forma cada vez m?s fehaciente y cercana a una crisis del modelo energ?tico actual. El uso indiscriminado de combustibles f?siles, y los problemas medioambientales que su uso acarrea han llevado lentamente hacia un cambio de paradigma. Una de las alternativas renovables al uso de estos es la producci?n de bioetanol a partir de desechos lignocelul?sicos. Este proceso, aunque prometedor, presenta problemas en la eficiencia de las etapas de pretratamiento y de hidr?lisis, que no le permiten afianzarse en el mercado energ?tico. En la b?squeda de soluciones, se ha apuntado en los ?ltimos a?os a las prote?nas de hongos capaces de degradar la madera para su consumo. Entre estas, las monooxigenasas l?ticas de polisac?ridos (LPMO) han cobrado gran importancia en el ?ltimo tiempo. Estas son parte importante del proceso de despolimerizaci?n de la celulosa, y su capacidad de aumentar la eficiencia de ?ste las han puesto en el centro de atenci?n.
Este trabajo de tesis tiene como objetivo la b?squeda de nuevas LPMOs desde dos hongos: Fusarium oxysporum y Gloeophyllum trabeum. M?s espec?ficamente, se busc? identificar enzimas de inter?s en el secretoma del hongo y secuenciarlas para su posterior an?lisis in silico.
Estos objetivos se desarrollaron en una primera instancia a trav?s de la b?squeda de medios de cultivo que indujeran la producci?n de celulasas por parte de los hongos. A partir de la biomasa producida en los cultivos se realiz? una extracci?n de RNA, para luego transcribir el mRNA a cDNA. El cDNA fue utilizado en reacciones de PCR con partidores degenerados. Esto tuvo como fin identificar LPMOs de entre las prote?nas transcritas por el hongo. Los genes identificados fueron amplificados usando partidores espec?ficos, y transformados en E. coli unidos a vectores de clonaci?n. Finalmente los genes fueron secuenciados y esta informaci?n se utiliz? para analizar in silico las propiedades de las LPMOs codificadas por los genes clonados.
Se pudo determinar durante el trabajo medios id?neos para la inducci?n de la producci?n de celulasas, y se tuvo la oportunidad de mejorar el proceso de extracci?n de RNA desde hongos. Del proceso de secuenciaci?n se obtuvo las secuencias de un gen perteneciente a G. trabeum y de dos genes pertenecientes a F. oxysporum. Se observ? que las prote?nas que estos codifican poseen los componentes estructurales descritos como indispensables para ser enzimas activas, vale decir las dos histidinas y la tirosina que forman el sitio activo; se estableci? el mapa de restricci?n de los genes, y se realiz? un an?lisis filogen?tico de estos en relaci?n a prote?nas de referencia. Del an?lisis de las secuencias obtenidas se determin? que, seg?n la clasificaci?n vigente, ser?an parte de la subfamilia 3 de las LPMOs. Finalmente, se pudo aproximar mediante herramientas computacionales la estructura tridimensional de estas prote?nas. Se observ? que la estructura predicha sigue los patrones que presentan las LPMOs ya caracterizadas, otro indicador de que se podr?a tratar de enzimas funcionales.
En conclusi?n, se puede decir que se cumplieron los objetivos propuestos en este trabajo. Se logr? identificar y secuenciar dos LPMOs expresadas por F. oxysporum y una por G. trabeum. Asimismo, se logr? realizar un an?lisis en profundidad de las secuencias utilizadas. Este permite suponer que se trata efectivamente de prote?nas con el potencial de mejorar el proceso de producci?n de biocombustibles, y que se debiese seguir al siguiente paso l?gico, que corresponder?a al an?lisis de la funcionalidad de la prote?na nativa o expresada en forma heter?loga, y su rol en la degradaci?n de lignocelulosa.
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Otimiza??o da produ??o da enzima anti-leuc?mica L-asparaginase por Penicillium sp.Ardila, Jorge Andr?s Rueda 09 June 2017 (has links)
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Previous issue date: 2017 / A enzima L-asparaginase ? atualmente utilizada na ind?stria de alimentos e na ind?stria farmac?utica devido ? facilidade de catalisar a rea??o de hidr?lise da L-asparagina em aspartato e am?nia. Esta propriedade tem aplica??o na ind?stria dos alimentos, pois evita a produ??o de compostos carcinog?nicos como as acrilamidas. Por outro lado, na ind?stria farmac?utica, esta rea??o enzim?tica det?m o crescimento de c?lulas leuc?micas devido ? falta de L-asparagina que estas c?lulas devem afrontar. Conforme as c?lulas leuc?micas t?m pouca ou nenhuma asparagina sintetase, as rotas metab?licas dependem exclusivamente da absor??o desse amino?cido do meio fisiol?gico. V?rias pesquisas foram feitas desde que a L-asparaginase mostrou a habilidade de reduzir alguns c?nceres na d?cada de 50. Estas pesquisas incluem a triagem de micro-organismos produtores, a otimiza??o de meios de cultura para melhorar a produ??o e a procura de uma metodologia que consiga purificar a enzima a partir do estrato bruto. Tais pesquisas se intensificaram recentemente no Brasil devido a uma crise de abastecimento gerada pela interrup??o da importa??o pelo fornecedor. A L-asparaginase ? um princ?pio ativo de alta demanda para tratar a leucemia linfobl?stica aguda e por isso deve ser produzida no Brasil. Este estudo foi realizado utilizando a linhagem Penicillium sp. T8.3 e teve como objetivo aprimorar a produ??o da enzima ajustando as condi??es de cultivo, usando glicerol e L-asparagina (como fontes de carbono e nitrog?nio, respectivamente) e pH como as tr?s vari?veis de entrada. Os experimentos foram desenvolvidos aplicando ferramentas da estat?stica multivari?vel como planejamento fatorial, desenho composto central para gerar um modelo matem?tico emp?rico. Foram analisadas a concentra??o de am?nio e a atividade enzim?tica produzida nos bioprocessos. A atividade enzim?tica foi determinada em rea??o conduzida a 37 ?C e pH 7,0, condi??es semelhantes ? do meio fisiol?gico. Todos os dados estat?sticos foram gerados com o programa Statistica 7.0 ?. Foi produzida uma atividade m?xima de 12,7 U por bioprocesso estacion?rio conduzido em meio ajustado com 15,5 g.L-1 de glicerol, 5,6 g.L-1 de L-asparagina e pH 4,8. Desse modo, o ajuste das condi??es de cultivo permitiu elevar a produ??o em mais de 30 vezes e alcan?ar uma atividade enzim?tica superior ? maioria dos relatos da literatura que tratam da produ??o da enzima f?ngica. O modelo estat?stico previu a produ??o enzim?tica com 77% de acerto, mostrando sua validade experimental e o potencial da linhagem T8.3 para a produ??o de L-asparaginase eucarionte. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-gradua??o em Ci?ncias Farmac?uticas, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2017. / The enzyme L-asparaginase is nowadays used in both pharmaceutics and food industry because of its ability to catalyze the reaction of hydrolysis of L-asparaginase into ammonia and aspartate. This feature is useful in the food industry because it hinders the formation of carcinogenic compounds such as acrylamide. On the other hand, in the pharmaceutical industry, this enzymatic reaction prevents some leukemic cells from growing due to asparagine depletion. Since these cells have low levels or no asparagine synthase, their metabolic routes depend on amino acid absorption from physiological medium. Several researches have been carried out since L-asparaginase showed to reduce some cancers in the 50?s. These researches include the screening of producing-microorganisms, optimization of the culture media to increase enzyme production, and development of methodology to purify the enzyme from crude extracts. Such researches have recently been intensified in Brazil due to a supply crisis resulting from interruption of the importer activities. L-asparaginase is a pharmaceutical of high demand to treat acute lymphoblastic leukemia, and therefore, it must be produced by Brazil. This study was carried out with the strain Penicillium sp. T8.3, and aimed to improve enzyme production by adjusting culture conditions, and by evaluating glycerol and L-asparagine ? as carbon and nitrogen sources, respectively ? and pH as input variables. The experiments were developed by using multivariable statistic tools such as factorial planning and central composite design to generate an empirical mathematical model. It was analyzed the ammonium concentration and the enzymatic activity produced in the bioprocesses. L-asparaginase activity was determined in reactions conduced at 37 ?C and at pH 7.0, similar to the physiological conditions. All statistical data were obtained with the software Statistica 7.0 ?. A maximum activity of 12.7 U was produced by stationary bioprocess in media adjusted with 15.5 g.L-1 glycerol, 5.6 g.L-1 L-asparagine, and pH 4,8. Thus, adjustment of culture conditions allowed to increase production by 30 times, and to reach an enzyme activity higher than those reported by most of the literature that deals with production of the fungal enzyme. The statistical model predicted enzyme production with 77% of accuracy, showing its experimental validity and the potential of strain T8.3 to produce the eukaryote L-asparaginase. / La enzima L-asparaginasa es usada actualmente en la industria de alimentos y en la industria farmac?utica debido a su facilidad para catalizar la reacci?n de degradaci?n de L-asparagina en amoniaco y aspartato. Esta caracter?stica es ?til en la industria de alimentos puesto a que evita la producci?n de compuestos cancer?genos como la acrilamida. Por otro lado, en la industria farmac?utica, esta reacci?n detiene el crecimiento de c?lulas leuc?micas debido al desabastecimiento de L-asparagina al que las c?lulas se enfrentan. Ya que estas c?lulas tienen poca o ninguna asparagina sintetasa, sus rutas metab?licas dependen exclusivamente de la absorci?n de amino?cidos desde el medio fisiol?gico. Varias investigaciones se han llevado a cabo desde que la L-asparaginasa mostr? su capacidad para reducir algunos c?nceres en los a?os 50. Estas investigaciones incluyen la clasificaci?n de microorganismos como productores de esta enzima, la mejora de los medios de cultivo para optimizar la producci?n, y la b?squeda de una metodolog?a para purificarla desde el extracto celular. Estos temas de investigaci?n han ganado inter?s en Brasil debido a que el proveedor de este f?rmaco detuvo sus servicios. La L-asparaginasa presenta una alta demanda para tratar la leucemia linfobl?stica aguda y por lo tanto debe ahora producirse en Brasil. Este estudio se llev? a cabo utilizando una cepa Penicillium sp. T8.3 cuyo objetivo fue optimizar la producci?n de la enzima mediante ajustes en las condiciones de cultivo usando glicerol y L-asparagina (como fuentes de carbono y de nitr?geno, respectivamente) y pH como las tres variables de entrada. Los experimentos fueron desarrollados utilizando herramientas de estad?stica multivariable como un planeamiento factorial y un dise?o de compuesto central para obtener un modelo matem?tico emp?rico. Se analizaron la concentraci?n de amoniaco y la actividad enzim?tica en los procesos biotecnol?gicos. La actividad enzim?tica fue determinada en una reacci?n a 37 ?C y pH 7.0, condiciones similares al medio fisiol?gico. Todos los datos estad?sticos fueron obtenidos del programa Statistica 7.0 ?. Se obtuvo una actividad m?xima de 12.7 U en proceso biotecnol?gico estacionario en un medio ajustado con 15.5 g.L-1 de glicerol, 5.6 g.L-1 de L-asparagina y pH 4.8. Este ajuste de las condiciones de cultivo logr? aumentar la producci?n en m?s de 30 veces, bien como alcanzar una actividad enzim?tica superior a la mayor?a de los relatos de literatura que tratan de la producci?n de la enzima de hongos. El modelo estad?stico predijo la producci?n enzim?tica en 77% de acierto, mostrando su validez experimental y el potencial de la cepa T8.3 para la producci?n de la L-asparaginasa eucariota.
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