Publicación a texto completo no autorizado por el autor. / Los ramnolípidos son biosurfactantes producidos por una gran cantidad de microorganismos, estos presentan gran diversidad de aplicaciones, siendo una de sus más importantes aplicaciones es en procesos de biorremediación en áreas contaminadas con hidrocarburos y metales pesados. El presente estudio está enfocado en investigar algunos de los parámetros fermentativos críticos para la producción de ramnolípidos por Pseudomonas aeruginosa 6k-11 usando dos fuentes de nitrógeno orgánica e inorgánica y dos diseños experimentales. El proceso para la producción de ramnolípidos fue optimizado usando un diseño central compuesto y Box Behnken como diseños experimentales y metodología de superficie de respuesta. Los factores tomados en cuenta para su estudio fueron el pH, temperatura, velocidad de agitación y porcentaje de inóculo. La máxima producción para la fuente de nitrógeno orgánica (triptona y urea) fue 23,2 g/L de ramnolípidos después de 168 horas de fermentación con las variables: 170 rpm de velocidad de agitación, 31,9°C de temperatura, 6,8 de pH, 6,8 (v/v) % de inóculo. La máxima producción teniendo como fuente de nitrógeno inorgánico (nitrato de sodio) fue 25,7 g/L de ramnolípidos luego de 168 horas de fermentación con las variables de fermentación: 185,8 rpm de velocidad de agitación, 31,3 °C de temperatura, 6,8 de pH, 7,3% de inóculo. Experimentalmente se confirmó 24,01 ±1,5 g/L y 28,01 ± 2,5 g/L de ramnolípidos para el medio I y II respectivamente. Los resultados de la presente investigación sugieren que la aplicación de la modelización matemática es muy eficaz para determinar las condiciones óptimas de reacción y mejorar el rendimiento de bioprocesos microbianos. / Tesis

Identifica los tipos de RL contenidos en las bandas de un halo revelado en agar CTAB/MB. Desarrolla una técnica para extraer RL a partir del agar CTAB/MB implementando, además, una metodología de superficie de respuesta Box-Behnken que maximizó las separaciones entre las 4 bandas de un patrón de RL producidos por P. aeruginosa 6K-11. Identifica, mediante UPLC-MS/MS, 9 congéneres de RL en la banda 1 (RC8C10, RC10C8, RC10C10, RRC8C10, RRC10C8, RRC10C10, RRC10C12:1, RRC12C10 y RRC10C12), 7 en la banda 2 (RC8C10, RC10C8, RC10C10, RRC8C10, RRC10C8, RRC10C10 y RRC10C12:1), 4 en la banda 3 (RC10C10, RRC8C10, RRC10C8 y RRC10C10) y 3 en la banda 4 (RRC8C10, RRC10C8, RRC10C10). La estructura molecular es probablemente el factor más importante en la migración de los RL puesto que se observa que la relación de la presencia de isómeros se mantiene en las cuatro bandas. Además de existir predominancia de diRL. Concluye que la cantidad y la diversidad de tipos de RL disminuye en la migración de cada banda según su complejidad estructural (cantidad de ramnosas, isomería y masa) lo que comprueba las diferencias en cuanto a composición química y abundancia de los RL que se encuentran dentro de cada banda. / Tesis

El uso de biosurfactantes en biorremediación facilita y acelera la degradación microbiana de hidrocarburos. El método del agar CTAB/MB creado por Siegmund y Wagner para el screening de cepas productoras de ramnolípidos (RL), ha sido ampliamente utilizado sin sufrir mejoras significativas en más de 20 años. Con el fin de optimizar la técnica como método cuantitativo, se hicieron placas con agar CTAB/MB y se probaron diferentes variables, tales como tiempo de incubación, refrigeración, concentración de CTAB, presencia de azul de metileno, diámetro de los pozos y volumen del inóculo. Adicionalmente, se desarrolló un nuevo método para detectar el RL de los halos mediante precipitación con HCl, lo cual permite la observación de un nuevo patrón de halos más fáciles de observar y medir. Este trabajo reafirma que este método no es del todo apropiado para un análisis cuantitativo fino, debido a la dificultad de correlacionar de forma precisa la concentración de RL y el área de los halos formados. La difusión del RL no parece tener un comportamiento simple y existen numerosos factores que afectan la velocidad de migración del RL. A pesar de todo, aún es muy útil para una pre-selección semi-cuantitativa de cepas productoras de RL; si bien no es posible determinar exactamente cuánto RL se ha producido, aún es posible diferenciar cepas con productividad significativamente diferentes bajo condiciones similares. La aplicación de este método y su modificación permitió reducir el número candidatos de 2517 cepas potenciales a tan solo 3 cepas superproductoras (0.12%). Palabras clave: Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB), azul de metileno, Pseudomonas, screening, ramnolípidos, biosurfactantes / Tesis

Los biotensioactivos son compuestos producidos por microorganismos que poseen actividad superficial, baja toxicidad, carácter biodegradable y efectividad a temperaturas y valores de pH extremos. Los ramnolípidos, son un tipo de biotensioactivos con interesantes actividades biológicas, que parecen estar relacionadas con su interacción con las membranas. En esta tesis doctoral se estudia la interacción de la fracción dirramnolipídica purificada de cultivos de Pseudomonas aeruginosa con membranas modelo y membranas biológicas, la interacción con albúmina de suero bovino, utilizada como proteína modelo, y por último, se evalúa el papel de este biotensioactivo en la estabilización de liposomas sensibles a pH y su aplicación en la introducción de compuestos en células animales. Para el desarrollo de este trabajo de investigación se han utilizado técnicas como calorimetría, FT-IR, difracción de rayos X, dispersión de luz dinámica y microscopía electrónica. / Rhamnolipids are bacterial biosurfactants produced by Pseudomonas spp. These compounds have been shown to present several interesting biological activities. It has been suggested that the interaction with the membrane could be the ultimate responsible for these actions. This thesis presents a detailed molecular level study of the dirhamnolipid interactions with artificial phospholipids membranes and biological membranas, and the dirhamnolipid interactions with bovine serum albumin, used as a general globular protein model. Furthemore, this work includes the characterization of phosphatidylethanolamine/diRL pH-sensitive liposomes described as efficient systems for cytoplasmic delivery of foreign compounds into living cells. It has been employed a number of physical techniques such as calorimetry, FTIR, small angle X-ray (SAX) diffraction and dynamic light scattering.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Caracteriza los genes asociados a la producción de ramnolípidos en 61 cepas bacterianas provenientes de la colección del Laboratorio de Microbiología y Biotecnología Microbiana de la Univerdiad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM). Estas cepas han sido aisladas de diferentes ambientes contaminados con crudo de petróleo y fueron clasificados como superproductores de ramnolípidos (n=21), productores de ramnolípidos (n=20) y no productoras de ramnolípidos (n=20). La identificación molecular de los microorganismos usando el gen 16s rRNA estuvo precedida por la identificación bioquímica de las 61 cepas seleccionadas utilizando el sistema API 20 NE. Los cebadores para la detección de los genes rhl fueron diseñados por el Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad Autónoma de México (UNAM). Se utilizó PCR y el software FinchTV para el secuenciamiento de la región génica rhlABR y el programa MUSCLE para el análisis bioinformático. Cuatro especies fueron seleccionadas: P.aeruginosa T2K2, P. aeruginosa III T1P2, P. aeruginosa 6K-11, P. aeruginosa ATCC 9027; y fueron comparadas molecularmente con P. aeruginosa PAO1. Se encontró que el 71,4 % y el 90,0% de las cepas superproductoras de ramnolípidos y de las cepas productoras de ramnolípidos, fueron identificadas como Pseudomonas aeruginosa, especies como Burkholderia cepacia, Pseudomonas fluorescens, Aeromonas hydrophila y Chryseobacterium indologenes, fueron también identificadas. Del mismo modo, 55,0% de microorganismos no productores también fueron caracterizadas como P.aeruginosa. x Las regiones génicas rhlAB, rhlC y rhlR presentadas en las cepas superproductoras y productoras de ramnolípidos y las secuencias de todas las cepas mostraron el mismo patrón entre ellas y el estandar P. aeruginosa PAO1. Los resultados muestran que los genes estudiados en las cepas seleccionadas son sinónimos con sus homólogos en la cepa estándar P. aeruginosa PAO1, de modo que las diferencias genotípicas que expliquen la sobreproducción de ramnolípido deberan hallarse en otros marcadores moleculares no cubiertos en este estudio. / Tesis