O fungo filamentoso Bipolaris sorokiniana é um fitopatógeno que causa moléstias em cereais de inverno, tais como a mancha marrom, a ponta preta dos grãos e a podridão comum da raiz. O controle deste fungo é dificultado pelo fato do mesmo apresentar uma ampla variabilidade morfológica, fisiológica e genética. Assim sendo, os objetivos deste trabalho foram estudar a variabilidade fisiológica, genética e virulência de isolados de B. sorokiniana. Foram utilizados 35 isolados de B. sorokiniana e um isolado de B. orizae, provenientes de diferentes regiões geográficas do Brasil e de outros países. Inicialmente foi realizado o agrupamento dos isolados, conforme as características morfológicas e a medida da taxa de crescimento dos mesmos, separando-os em grupos morfológicos. Os isolados foram avaliados quanto à atividade enzimática em meio sólido, a virulência em sementes e plântulas de trigo e perfil de proteínas totais em gel SDS-PAGE. Com os resultados obtidos, cinco grupos morfológicos foram formados, com diferenças na coloração micelial e crescimento. Foram encontradas variações entre os isolados quanto à atividade enzimática, sendo a esterase a enzima que apresentou os mais altos índices de atividade. Os resultados do ensaio de virulência mostraram diferenças na porcentagem de sementes e plântulas infectadas, entre isolados da mesma região geográfica e grupo morfológico. O perfil de proteínas totais apresentou uma variação no número e intensidade das bandas no gel, onde algumas destas podem ser características da espécie. Também foi avaliada a incompatibilidade vegetativa entre os isolados, a influência de diferentes meios de cultivo sobre a incompatibilidade e a análise eletroforética de proteínas totais dos isolados, quando crescidos isoladamente e em reações de incompatibilidade e compatibilidade. Dos 31 cruzamentos de incompatibilidade realizados, 18 mostraram-se totalmente incompatíveis e essas reações apresentaram alterações nos diferentes meios de cultivo utilizados, evidenciando a influência do substrato nesta reação. Alguns isolados quando crescidos em condição de pareamento mostraram bandas mais intensas na eletroforese, sugerindo que algumas proteínas poderiam ser expressas em níveis mais elevados durante o co-cultivo. / Bipolaris sorokiniana is a phytopathogenic fungus that causes diseases in cereal crops, such as leaf spot disease, black point of the grain and common root rot. Because of its high morphological, physiological and genetic variability, the fungus control is a difficult task. The aim of this work was to study the physiological and genetic variability and the virulence of B. sorokiniana isolates. For this, 35 B. sorokiniana and one B. orizae isolates were used, proceeding from different geographic regions in Brazil and other countries. Initially, the isolates were evaluated for their morphological variability, considering mycelia color, sector formation, and growth rate. With this result the isolates were grouped by their morphologic characteristics. Extra-cellular enzymatic activity was analyzed in solid medium for all isolates, pathogenicity in wheat seeds and seedlings and analysis of total proteins by SDS-PAGE was done. Five morphological groups were formed with the results obtained with the morphological and growth characteristics. Variations among the isolates were found for enzymatic activity, and esterase was the enzyme that presented highest activity indices. The results obtained from infection of seeds and seedlings showed that isolates from the same geographic region and morphologic group had different degrees of virulence. The total protein profile presented by the isolates showed a variation in the bands number and intensity, where some of them can be characteristic of the specie. The vegetative incompatibility between the isolates was evaluated and the influences that different media culture in this reaction. The total proteins profile of the isolates was analyzed when the isolates were cultivated separately and in compatibility and incompatibility reactions. Thirty one crossings were realized and 18 out of them showed vegetative incompatibility, and theses reactions had presented alterations with different media culture. This result strongly suggests the influence of the substratum in this reaction. The isolates when pareated shown more intense protein bands in SDS-PAGE, suggesting that some proteins could be expressed in higher levels during co culture of the fungus.

O fungo filamentoso Bipolaris sorokiniana é um fitopatógeno que causa moléstias em cereais de inverno, tais como a mancha marrom, a ponta preta dos grãos e a podridão comum da raiz. O controle deste fungo é dificultado pelo fato do mesmo apresentar uma ampla variabilidade morfológica, fisiológica e genética. Assim sendo, os objetivos deste trabalho foram estudar a variabilidade fisiológica, genética e virulência de isolados de B. sorokiniana. Foram utilizados 35 isolados de B. sorokiniana e um isolado de B. orizae, provenientes de diferentes regiões geográficas do Brasil e de outros países. Inicialmente foi realizado o agrupamento dos isolados, conforme as características morfológicas e a medida da taxa de crescimento dos mesmos, separando-os em grupos morfológicos. Os isolados foram avaliados quanto à atividade enzimática em meio sólido, a virulência em sementes e plântulas de trigo e perfil de proteínas totais em gel SDS-PAGE. Com os resultados obtidos, cinco grupos morfológicos foram formados, com diferenças na coloração micelial e crescimento. Foram encontradas variações entre os isolados quanto à atividade enzimática, sendo a esterase a enzima que apresentou os mais altos índices de atividade. Os resultados do ensaio de virulência mostraram diferenças na porcentagem de sementes e plântulas infectadas, entre isolados da mesma região geográfica e grupo morfológico. O perfil de proteínas totais apresentou uma variação no número e intensidade das bandas no gel, onde algumas destas podem ser características da espécie. Também foi avaliada a incompatibilidade vegetativa entre os isolados, a influência de diferentes meios de cultivo sobre a incompatibilidade e a análise eletroforética de proteínas totais dos isolados, quando crescidos isoladamente e em reações de incompatibilidade e compatibilidade. Dos 31 cruzamentos de incompatibilidade realizados, 18 mostraram-se totalmente incompatíveis e essas reações apresentaram alterações nos diferentes meios de cultivo utilizados, evidenciando a influência do substrato nesta reação. Alguns isolados quando crescidos em condição de pareamento mostraram bandas mais intensas na eletroforese, sugerindo que algumas proteínas poderiam ser expressas em níveis mais elevados durante o co-cultivo. / Bipolaris sorokiniana is a phytopathogenic fungus that causes diseases in cereal crops, such as leaf spot disease, black point of the grain and common root rot. Because of its high morphological, physiological and genetic variability, the fungus control is a difficult task. The aim of this work was to study the physiological and genetic variability and the virulence of B. sorokiniana isolates. For this, 35 B. sorokiniana and one B. orizae isolates were used, proceeding from different geographic regions in Brazil and other countries. Initially, the isolates were evaluated for their morphological variability, considering mycelia color, sector formation, and growth rate. With this result the isolates were grouped by their morphologic characteristics. Extra-cellular enzymatic activity was analyzed in solid medium for all isolates, pathogenicity in wheat seeds and seedlings and analysis of total proteins by SDS-PAGE was done. Five morphological groups were formed with the results obtained with the morphological and growth characteristics. Variations among the isolates were found for enzymatic activity, and esterase was the enzyme that presented highest activity indices. The results obtained from infection of seeds and seedlings showed that isolates from the same geographic region and morphologic group had different degrees of virulence. The total protein profile presented by the isolates showed a variation in the bands number and intensity, where some of them can be characteristic of the specie. The vegetative incompatibility between the isolates was evaluated and the influences that different media culture in this reaction. The total proteins profile of the isolates was analyzed when the isolates were cultivated separately and in compatibility and incompatibility reactions. Thirty one crossings were realized and 18 out of them showed vegetative incompatibility, and theses reactions had presented alterations with different media culture. This result strongly suggests the influence of the substratum in this reaction. The isolates when pareated shown more intense protein bands in SDS-PAGE, suggesting that some proteins could be expressed in higher levels during co culture of the fungus.

O fungo filamentoso Bipolaris sorokiniana é um fitopatógeno que causa moléstias em cereais de inverno, tais como a mancha marrom, a ponta preta dos grãos e a podridão comum da raiz. O controle deste fungo é dificultado pelo fato do mesmo apresentar uma ampla variabilidade morfológica, fisiológica e genética. Assim sendo, os objetivos deste trabalho foram estudar a variabilidade fisiológica, genética e virulência de isolados de B. sorokiniana. Foram utilizados 35 isolados de B. sorokiniana e um isolado de B. orizae, provenientes de diferentes regiões geográficas do Brasil e de outros países. Inicialmente foi realizado o agrupamento dos isolados, conforme as características morfológicas e a medida da taxa de crescimento dos mesmos, separando-os em grupos morfológicos. Os isolados foram avaliados quanto à atividade enzimática em meio sólido, a virulência em sementes e plântulas de trigo e perfil de proteínas totais em gel SDS-PAGE. Com os resultados obtidos, cinco grupos morfológicos foram formados, com diferenças na coloração micelial e crescimento. Foram encontradas variações entre os isolados quanto à atividade enzimática, sendo a esterase a enzima que apresentou os mais altos índices de atividade. Os resultados do ensaio de virulência mostraram diferenças na porcentagem de sementes e plântulas infectadas, entre isolados da mesma região geográfica e grupo morfológico. O perfil de proteínas totais apresentou uma variação no número e intensidade das bandas no gel, onde algumas destas podem ser características da espécie. Também foi avaliada a incompatibilidade vegetativa entre os isolados, a influência de diferentes meios de cultivo sobre a incompatibilidade e a análise eletroforética de proteínas totais dos isolados, quando crescidos isoladamente e em reações de incompatibilidade e compatibilidade. Dos 31 cruzamentos de incompatibilidade realizados, 18 mostraram-se totalmente incompatíveis e essas reações apresentaram alterações nos diferentes meios de cultivo utilizados, evidenciando a influência do substrato nesta reação. Alguns isolados quando crescidos em condição de pareamento mostraram bandas mais intensas na eletroforese, sugerindo que algumas proteínas poderiam ser expressas em níveis mais elevados durante o co-cultivo. / Bipolaris sorokiniana is a phytopathogenic fungus that causes diseases in cereal crops, such as leaf spot disease, black point of the grain and common root rot. Because of its high morphological, physiological and genetic variability, the fungus control is a difficult task. The aim of this work was to study the physiological and genetic variability and the virulence of B. sorokiniana isolates. For this, 35 B. sorokiniana and one B. orizae isolates were used, proceeding from different geographic regions in Brazil and other countries. Initially, the isolates were evaluated for their morphological variability, considering mycelia color, sector formation, and growth rate. With this result the isolates were grouped by their morphologic characteristics. Extra-cellular enzymatic activity was analyzed in solid medium for all isolates, pathogenicity in wheat seeds and seedlings and analysis of total proteins by SDS-PAGE was done. Five morphological groups were formed with the results obtained with the morphological and growth characteristics. Variations among the isolates were found for enzymatic activity, and esterase was the enzyme that presented highest activity indices. The results obtained from infection of seeds and seedlings showed that isolates from the same geographic region and morphologic group had different degrees of virulence. The total protein profile presented by the isolates showed a variation in the bands number and intensity, where some of them can be characteristic of the specie. The vegetative incompatibility between the isolates was evaluated and the influences that different media culture in this reaction. The total proteins profile of the isolates was analyzed when the isolates were cultivated separately and in compatibility and incompatibility reactions. Thirty one crossings were realized and 18 out of them showed vegetative incompatibility, and theses reactions had presented alterations with different media culture. This result strongly suggests the influence of the substratum in this reaction. The isolates when pareated shown more intense protein bands in SDS-PAGE, suggesting that some proteins could be expressed in higher levels during co culture of the fungus.

As actinobactérias endofíticas estão presentes nos tecidos das plantas e, por meio da produção de metabólitos ativos, às protegem e auxiliam em condições de estresse. Esses microrganismos tem sido amplamente estudados no controle de doenças fitopatogênicas, como a mancha marrom causada por Bipolaris sorokiniana. Este fungo é o agente causal da podridão comum da raiz, manchas foliares, morte de plântulas e ponto preto das sementes de trigo e cevada, causando redução significativa na produtividade. Neste contexto, os objetivos do presente estudo foram avaliar a virulência de isolados de B. sorokiniana e a atividade antifúngica de actinobactérias contra este fitopatógeno. Os antagonistas com elevada atividade contra o fitopatógeno foram caracterizados quanto à produção enzimática, fisiologia, condições de crescimento e produção de metabólitos, bem como sequenciamento do 16S rRNA para identificação dos antagonistas. A caracterização parcial dos metabólitos foi realizada por meio de sistemas de Cromatografia de Camada delgada (CCD) contendo diferentes solventes. Os resultados mostraram que os isolados de B. sorokiniana apresentaram elevada virulência às plântulas e sementes de trigo, sendo que a maior agressividade foi relatada à semente. Por outro lado, 69,6% das actinobactérias apresentaram elevada atividade antifúngica contra isolados de B. sorokiniana em meio sólido, e 17% a mantiveram em cultura submersa. A maior produção ocorreu a 30°C após 72h de incubação, para a maioria dos isolados. A detecção da produção de catalase, amilase, pectinase, lipase e esterase foi observada para a maioria das actinobactérias (100, 95,6, 91,30, 95,6, 100%, respectivamente). Enquanto que a degradação de caseína, carboximetilcelulose e gelatina foi realizada por 60,8, 34,78 e 47,82% dos isolados, respectivamente. Os isolados 6(2), 6(4), 16(3) e R18(6), selecionados devido à elevada atividade antifúngica e enzimática, apresentaram reação positiva para produção de compostos voláteis, quitinase e glucanase, sideróforos, fixação de nitrogêno, AIA e colonização de raizes. Somente isolado R18(6) não apresentou capacidade de solubilizar fosfatos. A caracterização molecular determinou que estes isolados pertencem ao gênero Streptomyces. Os metabólitos produzidos pelo isolado R18(6) foram mais estáveis a mudanças de temperatura e pH, bem como para a ação das proteases e EDTA, quando comparado aos demais. Os solventes acetato de etila e hexano foram mais eficientes na extração de metabólitos do extrato bruto, porém a melhor separação de metabólitos em CCD foi obtida com misturas de solventes. / Endophitic actinobacterias are present in plant tissues and by means of active metabolites they protect and help them in stress conditions. These microorganisms have been widely used in the control of phytopathogenic diseases, such as the spot blotch caused by Bipolaris sorokiniana. This fungus is a causal agent of common root rot, leaf spots, death of seedlings and black point of the seeds of wheat and barley, causing significant reduction in productivity. In this context, the aim of this study was to evaluate the virulence of the B. sorokiniana isolates and the antifungal activity of actinobacterias against this phytopathogen. The antagonists with the higher activity against the phytopatogen were characterize taking in consideration their physiology, enzyme production, growth conditions and metabolites production and 16S rRNA sequencing for identification of the antagonists. Partial characterization (nós não purificamos) of the metabolites was performed using thin layer chromatography (TLC) systems containing different solvents. The results showed that the isolates of B. sorokiniana have a high virulence on wheat seed and seedlings, however the greater aggressiveness was observed to seed. On the other hand, 69.6% of actinomycetes showed high antifungal activity against of B. sorokiniana isolates on solid medium, and 17% maintained this behavior in submerged culture. The highest yield happened, for most isolates, when grown at 30°C with agitation after 72h of incubation. The detection of catalase, starch, pectin, lipase and esterase production was observed for most of the actinomycetes (100, 95.6, 91.30, 95.6, 100%, respectively). While the hydrolysis of casein, carboxymethylcellulase and gelatin was performed by 60.8, 34.78 and 47.82% of the isolates, respectively. Isolates 6(2), 6(4), 16(3) e R18(6), selected due to the high antifungal and enzyme activity, showed a positive reaction for the production of volatile compounds, chitinase and glucanase, siderophores, nitrogen fixation, AIA and colonization of the roots. Only the isolated R18(6) showed no ability to solubilize phosphates. Molecular characterization of the isolates determined that they belong to the genus Streptomyces. The metabolites produced by isolate R18 (6) were more stable to temperature and pH changes, as well to the action of proteases and EDTA, when compared to the others. The solvents ethyl acetate and hexane were more efficient for the extraction of the metabolites from the crude extract, however a better separation of the metabolites in the TLC was obtained with mixture of solvents.

Bipolaris sorokiniana é um fungo fitopatogênico de gramíneas, sendo mais importante nas culturas de trigo e de cevada, ocasionando moléstias como a podridão comum da raiz, carvão do nó, ponta preta dos grãos e mancha marrom. No Brasil esse fitopatógeno encontra-se disseminado em todas as regiões tritícolas. O uso de sementes sadias ou tratadas adequadamente com fungicidas é de grande importância para o controle do fungo. O diagnóstico é dificultado pela grande variabilidade fisiológica e morfológica que o patógeno apresenta. O presente estudo teve por objetivos examinar a presença de polimorfismos intra-específicos das regiões do espaço transcrito interno (Spacer Transcribed Internal-ITS) do DNA ribossomal de isolados de B. sorokiniana e relacionar os padrões de polimorfismos com a região geográfica de origem dos isolados e com os diferentes tipos de hospedeiros. As regiões ITS1 e ITS2 do rDNA de 50 isolados de B. sorokiniana do Brasil e de outros países, um isolado de B. oryzae e seis de Drechslera teres foram amplificadas com oligonucleotídeos iniciadores universais ITS5-ITS2 e ITS3-ITS4. Os produtos da amplificação foram clivados com 18 endonucleases de restrição selecionadas e os polimorfismos foram analisados em gel não desnaturante de poliacrilamida 8%. A análise dos produtos de amplificação revelou a presença de dois fragmentos para ambas as regiões ITS em todos os isolados. Dois isolados de B. sorokiniana apresentaram variabilidade intra-específica de ITS com um terceiro fragmento nesta região. A partir da análise dos dendrogramas da clivagem das regiões ITS, verificou-se que os isolados do Brasil e de outros países formaram grupos intra-específicos e grupos interespecíficos. B.oryzae agrupou-se com até 75% de similaridade na análise da região ITS1 e 72,7% na região ITS2 com isolados de B. sorokiniana. Um isolados de D. Teres apresentou índice de similaridade de ITS1 de 75% com amostras de B. sorokiniana isoladas de trigo. Em todos os dendrogramas analisados não foi possível agrupar os isolados por região geográfica ou por tipo de hospedeiro. / Bipolaris sorokiniana is a worldwide pathogen of many cereal grasses. It is the most important causal agent of common root rot, leaf spot disease, seedling blight and black point of wheat and barley. In Brazil this fungus is disseminated in all wheat producing regions. Since this fungus is a seed borne pathogen, it is a very important to use in plantation seeds free of the fungus or seeds properly treated with fungicide. Diagnose of the phytopathogen is a difficult task because its high morphological and physiological variability. The purpose of this study was to examine the intra-specific polymorphism of internally transcribed spacer (ITS) region in the ribosomal DNA (DNAr) of Bipolaris sorokiniana isolates and to determine if there is some relationship among the isolates and their geographic origin or host. DNAr from 50 B. sorokiniana isolates, from Brazil and other countries, one B. oryzae and six Drechslera teres were used for the amplification of the ITS region using the universal primers ITS5-ITS2 and ITS3-ITS4. The amplification products were digested with 18 selected restriction endonucleases and the polymorphism was analyzed in 8% no denaturing polyacrylamide gel. The results of the amplification products showed two fragments for each ITS regions in all isolates. Two B. sorokiniana isolates presented an intra-specific variability with a third fragment for the ITS1 region. The dendrogram analyses of the polymorphism's, generated with the digestions of ITS region, from isolates of Brazil and from the other countries showed an intra and inter-specific groups. B. oryzae showed 75% of similarity with some B. sorokiniana isolates in the polymorphism analysis of ITS1 region and 72, 7% of in the ITS2 region. In the same way in the ITS1 region, one D. teres isolate presented 75% of similarity for B. sorokiniana isolated from wheat. In all the dendrograms analysis there was not possibility to group the isolates accordingly to their geographic origin or host type.

Bipolaris sorokiniana é um fungo fitopatogênico de gramíneas, sendo mais importante nas culturas de trigo e de cevada, ocasionando moléstias como a podridão comum da raiz, carvão do nó, ponta preta dos grãos e mancha marrom. No Brasil esse fitopatógeno encontra-se disseminado em todas as regiões tritícolas. O uso de sementes sadias ou tratadas adequadamente com fungicidas é de grande importância para o controle do fungo. O diagnóstico é dificultado pela grande variabilidade fisiológica e morfológica que o patógeno apresenta. O presente estudo teve por objetivos examinar a presença de polimorfismos intra-específicos das regiões do espaço transcrito interno (Spacer Transcribed Internal-ITS) do DNA ribossomal de isolados de B. sorokiniana e relacionar os padrões de polimorfismos com a região geográfica de origem dos isolados e com os diferentes tipos de hospedeiros. As regiões ITS1 e ITS2 do rDNA de 50 isolados de B. sorokiniana do Brasil e de outros países, um isolado de B. oryzae e seis de Drechslera teres foram amplificadas com oligonucleotídeos iniciadores universais ITS5-ITS2 e ITS3-ITS4. Os produtos da amplificação foram clivados com 18 endonucleases de restrição selecionadas e os polimorfismos foram analisados em gel não desnaturante de poliacrilamida 8%. A análise dos produtos de amplificação revelou a presença de dois fragmentos para ambas as regiões ITS em todos os isolados. Dois isolados de B. sorokiniana apresentaram variabilidade intra-específica de ITS com um terceiro fragmento nesta região. A partir da análise dos dendrogramas da clivagem das regiões ITS, verificou-se que os isolados do Brasil e de outros países formaram grupos intra-específicos e grupos interespecíficos. B.oryzae agrupou-se com até 75% de similaridade na análise da região ITS1 e 72,7% na região ITS2 com isolados de B. sorokiniana. Um isolados de D. Teres apresentou índice de similaridade de ITS1 de 75% com amostras de B. sorokiniana isoladas de trigo. Em todos os dendrogramas analisados não foi possível agrupar os isolados por região geográfica ou por tipo de hospedeiro. / Bipolaris sorokiniana is a worldwide pathogen of many cereal grasses. It is the most important causal agent of common root rot, leaf spot disease, seedling blight and black point of wheat and barley. In Brazil this fungus is disseminated in all wheat producing regions. Since this fungus is a seed borne pathogen, it is a very important to use in plantation seeds free of the fungus or seeds properly treated with fungicide. Diagnose of the phytopathogen is a difficult task because its high morphological and physiological variability. The purpose of this study was to examine the intra-specific polymorphism of internally transcribed spacer (ITS) region in the ribosomal DNA (DNAr) of Bipolaris sorokiniana isolates and to determine if there is some relationship among the isolates and their geographic origin or host. DNAr from 50 B. sorokiniana isolates, from Brazil and other countries, one B. oryzae and six Drechslera teres were used for the amplification of the ITS region using the universal primers ITS5-ITS2 and ITS3-ITS4. The amplification products were digested with 18 selected restriction endonucleases and the polymorphism was analyzed in 8% no denaturing polyacrylamide gel. The results of the amplification products showed two fragments for each ITS regions in all isolates. Two B. sorokiniana isolates presented an intra-specific variability with a third fragment for the ITS1 region. The dendrogram analyses of the polymorphism's, generated with the digestions of ITS region, from isolates of Brazil and from the other countries showed an intra and inter-specific groups. B. oryzae showed 75% of similarity with some B. sorokiniana isolates in the polymorphism analysis of ITS1 region and 72, 7% of in the ITS2 region. In the same way in the ITS1 region, one D. teres isolate presented 75% of similarity for B. sorokiniana isolated from wheat. In all the dendrograms analysis there was not possibility to group the isolates accordingly to their geographic origin or host type.

As actinobactérias endofíticas estão presentes nos tecidos das plantas e, por meio da produção de metabólitos ativos, às protegem e auxiliam em condições de estresse. Esses microrganismos tem sido amplamente estudados no controle de doenças fitopatogênicas, como a mancha marrom causada por Bipolaris sorokiniana. Este fungo é o agente causal da podridão comum da raiz, manchas foliares, morte de plântulas e ponto preto das sementes de trigo e cevada, causando redução significativa na produtividade. Neste contexto, os objetivos do presente estudo foram avaliar a virulência de isolados de B. sorokiniana e a atividade antifúngica de actinobactérias contra este fitopatógeno. Os antagonistas com elevada atividade contra o fitopatógeno foram caracterizados quanto à produção enzimática, fisiologia, condições de crescimento e produção de metabólitos, bem como sequenciamento do 16S rRNA para identificação dos antagonistas. A caracterização parcial dos metabólitos foi realizada por meio de sistemas de Cromatografia de Camada delgada (CCD) contendo diferentes solventes. Os resultados mostraram que os isolados de B. sorokiniana apresentaram elevada virulência às plântulas e sementes de trigo, sendo que a maior agressividade foi relatada à semente. Por outro lado, 69,6% das actinobactérias apresentaram elevada atividade antifúngica contra isolados de B. sorokiniana em meio sólido, e 17% a mantiveram em cultura submersa. A maior produção ocorreu a 30°C após 72h de incubação, para a maioria dos isolados. A detecção da produção de catalase, amilase, pectinase, lipase e esterase foi observada para a maioria das actinobactérias (100, 95,6, 91,30, 95,6, 100%, respectivamente). Enquanto que a degradação de caseína, carboximetilcelulose e gelatina foi realizada por 60,8, 34,78 e 47,82% dos isolados, respectivamente. Os isolados 6(2), 6(4), 16(3) e R18(6), selecionados devido à elevada atividade antifúngica e enzimática, apresentaram reação positiva para produção de compostos voláteis, quitinase e glucanase, sideróforos, fixação de nitrogêno, AIA e colonização de raizes. Somente isolado R18(6) não apresentou capacidade de solubilizar fosfatos. A caracterização molecular determinou que estes isolados pertencem ao gênero Streptomyces. Os metabólitos produzidos pelo isolado R18(6) foram mais estáveis a mudanças de temperatura e pH, bem como para a ação das proteases e EDTA, quando comparado aos demais. Os solventes acetato de etila e hexano foram mais eficientes na extração de metabólitos do extrato bruto, porém a melhor separação de metabólitos em CCD foi obtida com misturas de solventes. / Endophitic actinobacterias are present in plant tissues and by means of active metabolites they protect and help them in stress conditions. These microorganisms have been widely used in the control of phytopathogenic diseases, such as the spot blotch caused by Bipolaris sorokiniana. This fungus is a causal agent of common root rot, leaf spots, death of seedlings and black point of the seeds of wheat and barley, causing significant reduction in productivity. In this context, the aim of this study was to evaluate the virulence of the B. sorokiniana isolates and the antifungal activity of actinobacterias against this phytopathogen. The antagonists with the higher activity against the phytopatogen were characterize taking in consideration their physiology, enzyme production, growth conditions and metabolites production and 16S rRNA sequencing for identification of the antagonists. Partial characterization (nós não purificamos) of the metabolites was performed using thin layer chromatography (TLC) systems containing different solvents. The results showed that the isolates of B. sorokiniana have a high virulence on wheat seed and seedlings, however the greater aggressiveness was observed to seed. On the other hand, 69.6% of actinomycetes showed high antifungal activity against of B. sorokiniana isolates on solid medium, and 17% maintained this behavior in submerged culture. The highest yield happened, for most isolates, when grown at 30°C with agitation after 72h of incubation. The detection of catalase, starch, pectin, lipase and esterase production was observed for most of the actinomycetes (100, 95.6, 91.30, 95.6, 100%, respectively). While the hydrolysis of casein, carboxymethylcellulase and gelatin was performed by 60.8, 34.78 and 47.82% of the isolates, respectively. Isolates 6(2), 6(4), 16(3) e R18(6), selected due to the high antifungal and enzyme activity, showed a positive reaction for the production of volatile compounds, chitinase and glucanase, siderophores, nitrogen fixation, AIA and colonization of the roots. Only the isolated R18(6) showed no ability to solubilize phosphates. Molecular characterization of the isolates determined that they belong to the genus Streptomyces. The metabolites produced by isolate R18 (6) were more stable to temperature and pH changes, as well to the action of proteases and EDTA, when compared to the others. The solvents ethyl acetate and hexane were more efficient for the extraction of the metabolites from the crude extract, however a better separation of the metabolites in the TLC was obtained with mixture of solvents.

Bipolaris sorokiniana é um fungo fitopatogênico de gramíneas, sendo mais importante nas culturas de trigo e de cevada, ocasionando moléstias como a podridão comum da raiz, carvão do nó, ponta preta dos grãos e mancha marrom. No Brasil esse fitopatógeno encontra-se disseminado em todas as regiões tritícolas. O uso de sementes sadias ou tratadas adequadamente com fungicidas é de grande importância para o controle do fungo. O diagnóstico é dificultado pela grande variabilidade fisiológica e morfológica que o patógeno apresenta. O presente estudo teve por objetivos examinar a presença de polimorfismos intra-específicos das regiões do espaço transcrito interno (Spacer Transcribed Internal-ITS) do DNA ribossomal de isolados de B. sorokiniana e relacionar os padrões de polimorfismos com a região geográfica de origem dos isolados e com os diferentes tipos de hospedeiros. As regiões ITS1 e ITS2 do rDNA de 50 isolados de B. sorokiniana do Brasil e de outros países, um isolado de B. oryzae e seis de Drechslera teres foram amplificadas com oligonucleotídeos iniciadores universais ITS5-ITS2 e ITS3-ITS4. Os produtos da amplificação foram clivados com 18 endonucleases de restrição selecionadas e os polimorfismos foram analisados em gel não desnaturante de poliacrilamida 8%. A análise dos produtos de amplificação revelou a presença de dois fragmentos para ambas as regiões ITS em todos os isolados. Dois isolados de B. sorokiniana apresentaram variabilidade intra-específica de ITS com um terceiro fragmento nesta região. A partir da análise dos dendrogramas da clivagem das regiões ITS, verificou-se que os isolados do Brasil e de outros países formaram grupos intra-específicos e grupos interespecíficos. B.oryzae agrupou-se com até 75% de similaridade na análise da região ITS1 e 72,7% na região ITS2 com isolados de B. sorokiniana. Um isolados de D. Teres apresentou índice de similaridade de ITS1 de 75% com amostras de B. sorokiniana isoladas de trigo. Em todos os dendrogramas analisados não foi possível agrupar os isolados por região geográfica ou por tipo de hospedeiro. / Bipolaris sorokiniana is a worldwide pathogen of many cereal grasses. It is the most important causal agent of common root rot, leaf spot disease, seedling blight and black point of wheat and barley. In Brazil this fungus is disseminated in all wheat producing regions. Since this fungus is a seed borne pathogen, it is a very important to use in plantation seeds free of the fungus or seeds properly treated with fungicide. Diagnose of the phytopathogen is a difficult task because its high morphological and physiological variability. The purpose of this study was to examine the intra-specific polymorphism of internally transcribed spacer (ITS) region in the ribosomal DNA (DNAr) of Bipolaris sorokiniana isolates and to determine if there is some relationship among the isolates and their geographic origin or host. DNAr from 50 B. sorokiniana isolates, from Brazil and other countries, one B. oryzae and six Drechslera teres were used for the amplification of the ITS region using the universal primers ITS5-ITS2 and ITS3-ITS4. The amplification products were digested with 18 selected restriction endonucleases and the polymorphism was analyzed in 8% no denaturing polyacrylamide gel. The results of the amplification products showed two fragments for each ITS regions in all isolates. Two B. sorokiniana isolates presented an intra-specific variability with a third fragment for the ITS1 region. The dendrogram analyses of the polymorphism's, generated with the digestions of ITS region, from isolates of Brazil and from the other countries showed an intra and inter-specific groups. B. oryzae showed 75% of similarity with some B. sorokiniana isolates in the polymorphism analysis of ITS1 region and 72, 7% of in the ITS2 region. In the same way in the ITS1 region, one D. teres isolate presented 75% of similarity for B. sorokiniana isolated from wheat. In all the dendrograms analysis there was not possibility to group the isolates accordingly to their geographic origin or host type.

As actinobactérias endofíticas estão presentes nos tecidos das plantas e, por meio da produção de metabólitos ativos, às protegem e auxiliam em condições de estresse. Esses microrganismos tem sido amplamente estudados no controle de doenças fitopatogênicas, como a mancha marrom causada por Bipolaris sorokiniana. Este fungo é o agente causal da podridão comum da raiz, manchas foliares, morte de plântulas e ponto preto das sementes de trigo e cevada, causando redução significativa na produtividade. Neste contexto, os objetivos do presente estudo foram avaliar a virulência de isolados de B. sorokiniana e a atividade antifúngica de actinobactérias contra este fitopatógeno. Os antagonistas com elevada atividade contra o fitopatógeno foram caracterizados quanto à produção enzimática, fisiologia, condições de crescimento e produção de metabólitos, bem como sequenciamento do 16S rRNA para identificação dos antagonistas. A caracterização parcial dos metabólitos foi realizada por meio de sistemas de Cromatografia de Camada delgada (CCD) contendo diferentes solventes. Os resultados mostraram que os isolados de B. sorokiniana apresentaram elevada virulência às plântulas e sementes de trigo, sendo que a maior agressividade foi relatada à semente. Por outro lado, 69,6% das actinobactérias apresentaram elevada atividade antifúngica contra isolados de B. sorokiniana em meio sólido, e 17% a mantiveram em cultura submersa. A maior produção ocorreu a 30°C após 72h de incubação, para a maioria dos isolados. A detecção da produção de catalase, amilase, pectinase, lipase e esterase foi observada para a maioria das actinobactérias (100, 95,6, 91,30, 95,6, 100%, respectivamente). Enquanto que a degradação de caseína, carboximetilcelulose e gelatina foi realizada por 60,8, 34,78 e 47,82% dos isolados, respectivamente. Os isolados 6(2), 6(4), 16(3) e R18(6), selecionados devido à elevada atividade antifúngica e enzimática, apresentaram reação positiva para produção de compostos voláteis, quitinase e glucanase, sideróforos, fixação de nitrogêno, AIA e colonização de raizes. Somente isolado R18(6) não apresentou capacidade de solubilizar fosfatos. A caracterização molecular determinou que estes isolados pertencem ao gênero Streptomyces. Os metabólitos produzidos pelo isolado R18(6) foram mais estáveis a mudanças de temperatura e pH, bem como para a ação das proteases e EDTA, quando comparado aos demais. Os solventes acetato de etila e hexano foram mais eficientes na extração de metabólitos do extrato bruto, porém a melhor separação de metabólitos em CCD foi obtida com misturas de solventes. / Endophitic actinobacterias are present in plant tissues and by means of active metabolites they protect and help them in stress conditions. These microorganisms have been widely used in the control of phytopathogenic diseases, such as the spot blotch caused by Bipolaris sorokiniana. This fungus is a causal agent of common root rot, leaf spots, death of seedlings and black point of the seeds of wheat and barley, causing significant reduction in productivity. In this context, the aim of this study was to evaluate the virulence of the B. sorokiniana isolates and the antifungal activity of actinobacterias against this phytopathogen. The antagonists with the higher activity against the phytopatogen were characterize taking in consideration their physiology, enzyme production, growth conditions and metabolites production and 16S rRNA sequencing for identification of the antagonists. Partial characterization (nós não purificamos) of the metabolites was performed using thin layer chromatography (TLC) systems containing different solvents. The results showed that the isolates of B. sorokiniana have a high virulence on wheat seed and seedlings, however the greater aggressiveness was observed to seed. On the other hand, 69.6% of actinomycetes showed high antifungal activity against of B. sorokiniana isolates on solid medium, and 17% maintained this behavior in submerged culture. The highest yield happened, for most isolates, when grown at 30°C with agitation after 72h of incubation. The detection of catalase, starch, pectin, lipase and esterase production was observed for most of the actinomycetes (100, 95.6, 91.30, 95.6, 100%, respectively). While the hydrolysis of casein, carboxymethylcellulase and gelatin was performed by 60.8, 34.78 and 47.82% of the isolates, respectively. Isolates 6(2), 6(4), 16(3) e R18(6), selected due to the high antifungal and enzyme activity, showed a positive reaction for the production of volatile compounds, chitinase and glucanase, siderophores, nitrogen fixation, AIA and colonization of the roots. Only the isolated R18(6) showed no ability to solubilize phosphates. Molecular characterization of the isolates determined that they belong to the genus Streptomyces. The metabolites produced by isolate R18 (6) were more stable to temperature and pH changes, as well to the action of proteases and EDTA, when compared to the others. The solvents ethyl acetate and hexane were more efficient for the extraction of the metabolites from the crude extract, however a better separation of the metabolites in the TLC was obtained with mixture of solvents.

Mancha marrom ou Helmintosporiose é uma das principais doenças do trigo, causada pelo fitopatógeno Bipolaris sorokiniana, sendo responsável por grandes perdas econômicas no cultivo do trigo no mundo inteiro. Este fungo apresenta uma grande diversidade morfológica, fisiológica e genética. Com objetivo de caracterizar a diversidade molecular de amostras monospóricas de B. sorokiniana isolados de sementes do Brasil e outros países, foram utilizados 60 isolados monospóricos tendo o DNA genômico desses isolados sido submetidos à amplificação por PCR. Foram utilizados 12 oligonucleotídeos iniciadores universais construídos a partir de sequências repetidas do genoma do arroz (URP). Os perfis gerados foram analisados pelo método de médias aritméticas não ponderadas (UPGMA). O método PCR – URP permitiu obter informações importantes sobre o perfil genético das culturas monospóricas mostrando distinções entre os três conídios isolados oriundos da mesma cepa polispórica. Os oligonucleotídeos URP-30F, URP-6R, URP-17R e URP-38Famplificaram com um elevado índice de isolados. Em contra partida, os oligonucleotideos URP-13R, URP- 25F e URP-32F apresentaram um perfil de amplificação menor entre os isolados do fitopatógeno. O número total de fragmentos gerados com cada um dos oligonucleotídeos variou entre 41 e 77 fragmentos. Os oligonucleotídeos URP-17R, URP-30F, URP-32F e URP-6R apresentaram maior índice de fragmentos polimórficos. Os isolados apresentaram uma grande diversidade intra-especifíca entre os oligonucleotideos iniciadores URP e entre os conídios monospóricos. A análise forneceu informações relevantes sobre a variabilidade genética e a relação entre os isolados de B. sorokiniana. / Leaf spot disease or helmintosporiosis is one of the most important diseases of wheat cultures caused by the phytopathogem Bipolaris sorokiniana. It is responsible for great economic loss of wheat cultivation worldwide. This fungus presents a great morphologic, physiologic and genetic diversity. The aim of this study was to characterize the molecular diversity of B. sorokiniana monosporic isolates isolated from seeds from Brazil and other countries. For this purpose 60 monosporic isolates were used. The genomic DNA of this isolates were submitted to PCR amplification using 12 universal primers built from repeated sequences of rice genome (URP). The analysis of the amplification profile were calculated by Unweighted Pair Group Arithmetic Mean (UPMGA) Method. The PCR-URP method provided important information about the genetic profile to the monosporic culture, showing distinctions between the three spore isolates of the same polysporic strain. The primers URP-30F, URP-6R, URP-17R and URP-38F were able to amplify a higher percentage of the isolates been the more efficient in the study of this phytopathogen. However, the primers URP-13R and URP-32F have shown a lower amplification profile between the B. sorokiniana isolates. The number of fragments that resulted from the amplification of each primer had varied between 41 and 77 fragments. The primers URP-17R, URP-30F, URP-32F and URP-6R generated a higher number of polymorphic fragments with the isolates. The analysis provided relevant information about the variability and genetic relationship between B. sorokiniana isolates.