A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento. / The present Tesis aimed: (1) to determine an efficient method of genetic transformation by particle bombardment to obtain transgenic plants of Brazilian barley cultivars and (2) to identify a gene coding for chitinase that could confer resistance to barley against the pathogen Bipolaris sorokiniana. Calli cultures derived from immature scutella of Brazilian barley cultivars MN-599 e MN-698 (American Beverage Company, AMBEV) were bombarded with tungsten particles and analyzed for gusA reporter gene expression by GUS histochemical assay, embryogenic structures induction and plant regeneration. Physical and biological biolistic conditions analyzed included two promoter regions regulating the gusA gene, two particle bombardment devices, different helium pressures, distances between target tissues and the initial position of particles, number of shots and use of osmotic pre- and post-treatment of tissues. In the present work there were observed high numbers of blue spots per callus, embryogenic calli and somatic embryos induction with a frequency until 58.3% and the regeneration of 60 plants, being 43 from bombarded calli. The best conditions were obtained with the employment of the Adh promoter and its first intron (pNGI plasmid), Particle Inflow Gun (PIG) device, 14.8 cm of distance, 2 shots per plate and osmotic treatment of tissues with 0.2 M mannitol and 0.2 M sorbitol during 4-5 hours prior to and 17-19 hours after bombardments. Leaves from 3 out of 43 regenerated plants showed positive GUS activity in histochemical assays. The use of primers defined from chitinase genes described in literature resulted in the amplification of two fragments with approximately 700 and 500 bp from genomic DNA of MN-599 e MN-698 barley cultivars and one fragment, with approximately 500 bp, from Trichoderma sp. strain A4c genomic DNA. These fragments were purified from agarose gel and manual and automatically sequenced. Fragments of 700 and 500 bp from cv. MN-599 were identified as chitinase genes of barley and fragment of 500 bp Trichoderma sp. A4c presented no homology with chitinase sequences deposited in the EMBL/GenBank. The use of new primers representing conserved chitinase sequences of Metarhizium anisopliae resulted in the amplification of three fragments from genomic DNA of Trichoderma sp. strain A4b. These fragments should be purified and sequenced

La production céréalière, plus particulièrement le blé et l'orge, subit des pertes importantes de rendement occasionnées par la fonte des semis et les pourritures racinaires. Deux champignons sont majoritairement responsables de ces maladies chez le blé et l'orge : Fusarium graminearum et Bipolaris sorokiniana. L'utilisation des ultrasons comme une alternative « verte » aux fongicides pourrait permettre une culture biologique et minimiser les pertes économiques. L'objectif principal de ce projet consistait à établir les paramètres optimaux (puissance des ultrasons, présence d'éthanol, débit d'oxygène et temps de traitement) afin de réduire la contamination par B. sorokiniana des grains de blé et d'orge sous un seuil de 30 % tout en conservant la germination supérieure au seuil de 85 %. L'ensemble du projet de recherche exploratoire a permis de vérifier l'efficacité de traitements novateurs pour le blé contaminé. Le traitement de ces lots de grains sous forme sèche a révélé un maintien de la germination pour tous les types de traitement (ultrasons 30 W, oxygène en bullage dans l'éthanol et les deux techniques combinées) ainsi qu'une réduction significative du taux de contamination par B. sorokiniana (en moyenne en dessous de 15 %). Pour l'orge, ces traitements semblables ont permis le maintien de la germination ainsi qu'une faible diminution de la contamination par B. sorokiniana. Cette nuance peut être expliquée par la morphologie différente des deux grains. Une réelle avancée dans le domaine du traitement des grains sous forme sèche peut être mise en évidence pour sa rapidité de traitement. Il restera à vérifier l'efficacité du traitement sur d'autres lots et sur des quantités plus importantes pour vérifier la mise à l'échelle du dispositif (supérieure à 100 g). Pour l'avenir, une étude se basant sur le microcalorimétrie sera préconisée pour étudier les prémisses de la germination des grains traités.

La fonte des semis et la pourriture des racines font partie des maladies céréalières des grandes cultures au Québec. Elles sont causées par deux agents pathogènes, le Fusarium graminearum et le Bipolaris sorokiniana contaminant la semence céréalière, en particulier le blé et l’orge, ce qui entraîne à la fois une baisse de la levée et un rendement moins élevé. Des agriculteurs biologiques tentent de trouver un traitement de semences sans fongicide afin de lutter contre ces champignons, qui sont néfastes pour l’agriculture céréalière. Notre projet a comme objectif d’utiliser l’action oxydative de l’oxygène ou l’ozone humidifié pour engendrer un stress oxydatif afin de diminuer l’impact des deux agents pathogènes responsables de cette maladie, le F. graminearum et le B. sorokiniana, tout en préservant le pouvoir germinatif de ces semences. La dose en agent oxydant, le débit des gaz oxydants (ozone et /ou oxygène) ainsi que le temps d’exposition constituent les paramètres clés à optimiser pour ce traitement oxydatif et la cinétique de germination des graines céréalières traitées. Un tel traitement semblait prometteur pour la semence de blé. Il l’était toutefois un peu moins pour la semence d’orge en raison de son enveloppe assez rigide qui a rendu difficile la pénétration de l’ozone et l’oxygène. Pour remédier à ce problème, nous avons fait des tests préliminaires sur l’orge en utilisant la sonication par ultrasons comme prétraitement de l’orge avant le traitement oxydatif. Les résultats obtenus suggèrent qu’un tel traitement est prometteuret non négligeable afin d’optimiser notre traitement oxydatif et de permettre par la suite de réduire les agents responsables de la maladie sans nuire à la qualité des semences de céréales. Ce point a été abordé dans nos travaux par un test préliminaire sur l’orge, et cette approche s’annonce très prometteuse pour nos recherches futures. / Seedling blight and root rot are part of cereal diseases of field crops in Quebec. They are caused by two pathogens, Fusarium graminearum and Bipolaris sorokiniana, which contaminate the seed grain, especially wheat and barley, which causes both decreased, lift and lower performance. Organic farmers are trying to find a seed without fungicide treatment to fight against these fungi, which are harmful to cereal farming. Our project has as goal to use the oxidative action of oxygen or ozone moistened to cause oxidative stress in order to reduce the impact of the two pathogens responsible for this disease, F. graminearum and B. sorokiniana, while preserving the germinability of the seeds. The dose in oxidizing agent, the flow of oxidizing gases (ozone and/or oxygen) and the time of exposure are key parameters to optimize for this oxidative treatment and germination kinetics treated cereal seed. Such treatment looked promising for the seed of wheat. It was however a little less for the seed of barley because it’s fairly rigid envelope which made difficult the penetration of ozone and oxygen. To remedy this problem, we have preliminary tests on barley using sonication ultrasonic as pre-treatment of barley oxidative pre-treatment. The results suggest that, such treatment is promising and significant in order to optimize our oxidative treatment and subsequently, reduce the causative agents of disease without harming the quality of cereal seed. This point has been addressed in our work by a preliminary test on barley, and this approach looks very promising for our future research.