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Foram testadas na imunoistoquímica (IHQ) para diarréia viral bovina (BVDV) 654 biópsias de tecidos cutâneos da orelha de bovinos e tecidos de 161 fetos bovinos abortados. Concomitantemente, foram avaliados pela necropsia, histologia e IHQ 19 casos ocorridos entre janeiro de 1996 e dezembro de 2003 e dois casos acompanhados entre janeiro de 2004 e agosto de 2005, remetidos ao Setor de Patologia Veterinária (SPV) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. No total, duas biópsias, seis bovinos e três fetos bovinos abortados apresentaram antígenos do BVDV na IHQ. As lesões macroscópicas desses animais ocorreram principalmente no trato digestivo, como enterite e ulcerações na cavidade oral, gengiva e língua. Atrofia de timo e linfadenomegalia também foram observadas. Histologicamente, hiperplasia linfóide e perda da estrutura folicular nos linfonodos, necrose das placas de Peyer, gliose e neuronofagia (cérebro) e nefrite e degeneração tubular renal foram algumas das lesões observadas. Na IHQ a marcação positiva do antígeno viral foi evidenciada principalmente na pele, cérebro, cerebelo, intestino delgado, linfonodos e baço. A prevalência de casos de BVDV em bovinos representou 23,8% do total de 21 bovinos suspeitos necropsiados entre janeiro de 1996 a agosto de 2005 e 1,86% dos fetos abortados examinados entre junho 1999 e maio 2004 no SPV-UFRGS.

Foram testadas na imunoistoquímica (IHQ) para diarréia viral bovina (BVDV) 654 biópsias de tecidos cutâneos da orelha de bovinos e tecidos de 161 fetos bovinos abortados. Concomitantemente, foram avaliados pela necropsia, histologia e IHQ 19 casos ocorridos entre janeiro de 1996 e dezembro de 2003 e dois casos acompanhados entre janeiro de 2004 e agosto de 2005, remetidos ao Setor de Patologia Veterinária (SPV) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. No total, duas biópsias, seis bovinos e três fetos bovinos abortados apresentaram antígenos do BVDV na IHQ. As lesões macroscópicas desses animais ocorreram principalmente no trato digestivo, como enterite e ulcerações na cavidade oral, gengiva e língua. Atrofia de timo e linfadenomegalia também foram observadas. Histologicamente, hiperplasia linfóide e perda da estrutura folicular nos linfonodos, necrose das placas de Peyer, gliose e neuronofagia (cérebro) e nefrite e degeneração tubular renal foram algumas das lesões observadas. Na IHQ a marcação positiva do antígeno viral foi evidenciada principalmente na pele, cérebro, cerebelo, intestino delgado, linfonodos e baço. A prevalência de casos de BVDV em bovinos representou 23,8% do total de 21 bovinos suspeitos necropsiados entre janeiro de 1996 a agosto de 2005 e 1,86% dos fetos abortados examinados entre junho 1999 e maio 2004 no SPV-UFRGS.

Foram testadas na imunoistoquímica (IHQ) para diarréia viral bovina (BVDV) 654 biópsias de tecidos cutâneos da orelha de bovinos e tecidos de 161 fetos bovinos abortados. Concomitantemente, foram avaliados pela necropsia, histologia e IHQ 19 casos ocorridos entre janeiro de 1996 e dezembro de 2003 e dois casos acompanhados entre janeiro de 2004 e agosto de 2005, remetidos ao Setor de Patologia Veterinária (SPV) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. No total, duas biópsias, seis bovinos e três fetos bovinos abortados apresentaram antígenos do BVDV na IHQ. As lesões macroscópicas desses animais ocorreram principalmente no trato digestivo, como enterite e ulcerações na cavidade oral, gengiva e língua. Atrofia de timo e linfadenomegalia também foram observadas. Histologicamente, hiperplasia linfóide e perda da estrutura folicular nos linfonodos, necrose das placas de Peyer, gliose e neuronofagia (cérebro) e nefrite e degeneração tubular renal foram algumas das lesões observadas. Na IHQ a marcação positiva do antígeno viral foi evidenciada principalmente na pele, cérebro, cerebelo, intestino delgado, linfonodos e baço. A prevalência de casos de BVDV em bovinos representou 23,8% do total de 21 bovinos suspeitos necropsiados entre janeiro de 1996 a agosto de 2005 e 1,86% dos fetos abortados examinados entre junho 1999 e maio 2004 no SPV-UFRGS.

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O presente estudo teve como objetivo induzir a infecção experimental do BVDV-1 em leitões desmamados e avaliar a excreção e possível transmissão do vírus pelas vias lâmina d’água e naso-nasal. Foram conduzidos dois experimentos e uma repetição para cada via de transmissão avaliada. No total foram selecionados 24 leitões, sendo utilizados seis por experimento, divididos em grupos controle (n=2), sentinela (n=2) e infectado (n=2), utilizando isoladores, projetados para estabelecer o contato entre os animais apenas pela via de transmissão em estudo. O grupo infectado recebeu um inóculo contendo BVDV-1, estirpe Singer, enquanto que os grupos controle e sentinela foram inoculados com meio E-MEM. Os animais permaneceram nos isoladores por 25 dias, período em que foram coletadas amostras de suabe nasal diariamente e sangue a cada sete dias. Ao final, os animais foram eutanasiados e necropsiados, sendo realizada coleta de fragmentos de órgãos para histopatologia, imunohistoquímica e RT-PCR. Quando avaliada a via de transmissão lâmina d’água, apenas um animal infectado apresentou excreção de material genômico a partir do 6o dia pós-infecção (dpi), e um animal sentinela apresentou excreção no 20o dpi. Nestes animais, a soroconversão ocorreu no 25o dia apresentando título de anticorpos igual a 20. Um animal infectado não apresentou soroconversão durante o período amostrado, porém houve excreção a partir do 5o dpi. Na repetição do experimento, apenas um animal infectado soroconverteu ao 25o dia, com título de anticorpos de 20, cuja excreção do material genômico foi detectada ao 21o dpi. Nos animais sentinelas, apenas um apresentou excreção no 13o dpi. Em relação ao experimento naso-nasal, os animais infectados apresentaram excreção de material genético a partir do 17o dpi, porém a soroconversão não foi observada em todos os animais. Na repetição do experimento naso-nasal a soroconversão foi detectada em apenas um dos leitões infectados no último dia de experimento, com título de anticorpos de 20. A excreção do material genômico ocorreu nos dois animais infectados, sendo que um animal apresentou excreção a partir do dia 10 e o outro a partir do 18o dpi. Em relação à macroscopia e microscopia, os animais de todos os experimentos não apresentaram lesões significativas. O presente estudo demonstra que os suínos são susceptíveis ao BVDV, possibilitando a excreção e servir como fonte de infecção. Evidenciou-se que a lâmina d’agua pode veicular o BVDV de um suíno infectado para outro, ressaltando a importância e o risco de transmissão. A possibilidade de transmissão do BVDV pela via naso-nasal em leitões não foi provada dentro do período avaliado. / Pestiviruses have significant importance in swine breeding, and pigs can be infected by Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) under natural conditions. The present study aimed to induce the experimental infection of BVDV-1 in weaned piglets and to evaluate the excretion and possible transmission of the virus through the water and naso-nasal routes. Two experiments and one replicate were conducted for each evaluated route of transmission. In total, 24 piglets were selected, and six were used per experiment, divided into control (n = 2), sentinel (n = 2) and infected (n = 2) groups using isolators, designed to establish contact between animals only by Route of study. The infected group received an inoculum containing BVDV-1, Singer strain, while the control and sentinel groups were inoculated with E-MEM medium. The animals remained in the isolators for 25 days, during which samples of nasal swab and blood were collected every seven days. At the end, the animals were euthanized and necropsied, and organ fragments were collected for histopathology, immunohistochemistry and RT-PCR. When the water-borne transmission pathway was evaluated, only one infected animal showed excretion of genomic material from day 6 post-infection (dpi), and one sentinel animal showed excretion at the 20th dpi. In these animals, seroconversion occurred on day 25 with an antibody titer equal to 20. An infected animal did not present seroconversion during the sampled period, but there was excretion from the 5th dpi. In the repeat of the experiment, only one infected animal was seroconverted at day 25, with antibody titer of 20, whose excretion of the genomic material was detected at 21o dpi. In sentinel animals, only one had excretion at the 13th dpi. In relation to the naso-nasal experiment, the infected animals presented excretion of genetic material from the 17th dpi, but seroconversion was not observed in all the animals. In the repetition of the nasonasal experiment, seroconversion was detected in only one of the infected piglets on the last day of the experiment, with an antibody titre of 20. Excretion of the genomic material occurred in the two infected animals, and one animal had excretion from the Day 10 and the other from the 18th dpi. Regarding macroscopy and microscopy, the animals of all experiments did not present significant lesions. The present study demonstrates that pigs are susceptible to BVDV, allowing excretion and serve as a source of infection. It has been shown that the water table can transport BVDV from one infected pig to another, emphasizing the importance and risk of transmission. The possibility of BVDV transmission by the nasal nasal route in piglets has not been proven within the evaluated period. / FAPESP: 2014/13590-3 / FAPESP: 2015/07098-1

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) isolates display a high genetic and antigenic variability that can compromise diagnosis and vaccine formulation. This study aimed to characterize at genetic and antigenic levels Brazilian BVDV isolates for potential use in diagnosis and vaccine production, and to characterize field BVDV isolates from Rio Grande do Sul (RS) (2000-2010). Chapter 1 describes the genetic and antigenic characterization of seven cytopathic Brazilian BVDV isolates, to select the most appropriate for use in diagnostic and vaccines. Sequencing and phylogeny identified four isolates of BVDV-1 (57.1%) and three isolates of BVDV-2 genotype (42.8%). The antigenic characterization of these isolates by virus neutralization assay (VN) with homologous and heterologous antisera revealed differences among the viruses of the same genotype, but especially among viruses of different genotypes. Despite the antigenic differences, the neutralizing activity of antisera IBSP-4 and VS26/2 was acceptable against isolates of the same genotype and also against viruses of different genotype. These results qualify these isolates for potential use in vaccine formulations. In parallel, 446 field serum samples were tested against the seven isolates and reference strains. Neutralizing antibodies anti-BVDV were found in 221 (50.3%) samples, and 198 (89.6%) had neutralizing activity against the both genotypes (Singer, BVDV-1 and VS- 253, BVDV-2), 18 (8.1%) serum samples and five (2.2%) neutralized only the standard BVDV-1 and BVDV-2. These results confirm that the antigenic differences between isolates may result in false-negative results, yet might not justify the performance of VN using both BVDV genotypes. Chapter 2 presents a genotypic and antigenic profile of 20 BVDV isolates obtained in RS state, between 2000 and 2010. The isolates were isolated from a variety of clinico-pathological syndromes. Most samples (19 or 95%) belong to biotype non-cytopathic (NCP) and one isolate (5%) had a mixture of viruses NCP and cytopathic (CP). Sequencing and phylogenetic analyses identified nine isolates of BVDV-2 (45%), eight BVDV-1 (40%) and three atypical BVDV isolates. Analysis of reactivity with a panel of 20 monoclonal antibodies (mAbs) revealed a marked variability in the major envelope glycoprotein gp53/E2 among viruses of the same genotype, but especially between different virus genotypes. Virus neutralization assays (VN) with antisera of BVDV-1 and BVDV-2 reference strains against the isolates revealed variable levels of cross-reactivity between viruses of the same genotype, and lack or very low reactivity between viruses of different genotypes. These results indicate the presence of both genotypes of BVDV in the cattle population of RS and confirm the remarkable antigenic diversity of these isolates. / Amostras de campo do vírus da diarréia viral bovina (BVDV) apresentam diferenças genéticas e antigênicas que podem influenciar no diagnóstico e na produção de vacinas. Os objetivos do presente trabalho foram selecionar e caracterizar isolados de BVDV para potencial uso em testes de diagnóstico e vacinas, e caracterizar genética e antigenicamente amostras de BVDV isoladas no Rio Grande do Sul (RS) entre 2000 e 2010. O capítulo 1 relata a caracterização em nível molecular e antigênico de sete isolados citopáticos brasileiros do BVDV. O sequenciamento e análise filogenética identificaram quatro isolados do genótipo BVDV-1 (57,1%) e três isolados do genótipo BVDV-2 (42,8%). A caracterização antigênica dessas amostras por vírus neutralização (VN) com soro homólogo e heterólogo revelou diferenças importantes nos títulos neutralizantes entre os vírus do mesmo genótipo, mas principalmente entre vírus de diferentes genótipos. Apesar dessas diferenças antigênicas, a atividade neutralizante do anti-soro das amostras IBSP-4 e VS26/2 foi aceitável contra amostras do mesmo genótipo e também contra amostras de genótipo diferente. Esses resultados qualificam esses isolados para potencial uso em formulações vacinais. Em paralelo, 446 amostras de soro campo foram testadas por VN frente aos sete isolados e contra cepas padrão de BVDV-1 e 2. Destas, 221 amostras (50,3%) apresentaram anticorpos neutralizantes anti-BVDV, sendo que 198 (89,6%) apresentaram atividade frente às cepas padrões dos dois genótipos (Singer, BVDV-1 e VS-253, BVDV-2). Por outro lado, 18 amostras de soro (8,1%) neutralizaram apenas a cepa de BVDV-1 e 5 (2,2%) a cepa BVDV-2. Apesar das diferenças antigênicas entre os genótipos, esses resultados não indicam a necessidade de testar as amostras de soro para ambos os genótipos, uma vez que o número de amostras de soro que não é detectada por um ou outro genótipo foi pequena. O capítulo 2 apresenta um perfil genotípico e antigênico de 20 amostras do BVDV isoladas no RS, entre 2000 e 2010. As amostras foram isoladas de uma variedade de condições clínicas. A maioria das amostras (19 ou 95%) pertence ao biótipo não-citopático (NCP); e um isolado (5%) apresentou uma mistura de vírus NCP e citopáticos (CP). O sequenciamento e a análise filogenética permitiram identificar nove isolados de BVDV-2 (45%), oito isolados de BVDV-1 (40%) e três isolados BVDV atípicos. Análise de reatividade com um painel de 20 anticorpos monoclonais (AcMs) contra a glicoproteína principal do envelope gp53/E2 revelou uma variabilidade marcante nesta glicoproteína, entre vírus do mesmo genótipo, e sobretudo, entre vírus de genótipos diferentes. Testes de VN com anti-soro de cepas de referência de BVDV-1 e BVDV-2 frente às amostras isoladas revelaram níveis variáveis de reatividade cruzada entre vírus do mesmo genótipo, e reatividade ausente ou muito baixa entre vírus de genótipos diferentes. Esses resultados indicam a presença de ambos os genótipos do BVDV na população do RS, e confirmam a marcante variabilidade antigênica desses isolados.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The success of control/eradication programs of bovine viral diarrhea virus (BVDV) infection necessarily includes the identification and elimination of persistently infected (PI) animals. Since these animals continuously shed virus, the prevalence and titers of antibodies in herds with PI animals are often high. Hence, bulk milk and serum samples were subjected to two serological tests in order to establish the most appropriate for herd screening. For this, 767 samples of bulk milk and 701 serum samples were analyzed by a commercial ELISA kit and by virus-neutralization test (VNT). The toxic effects of milk for cell cultures on VNT was abolished by increasing the final volume of medium during the incubation. Among the tested milk samples, 177 and 139 were positive in VNT and ELISA, respectively. Thus, the VNT showed a sensitivity (Se) of 76.8% and a specificity (Sp) of 99.5%. The Kappa index (k) was 0.82, demonstrating an excellent agreement between the two techniques. The analysis of the correlation coefficient between the absorbance values in ELISA (OD) and antibody titers in positive samples in VNT showed a moderate positivity (r = 0.57) with p<0.05. In serum samples, 442 and 602 were positive in ELISA and VNT, respectively. This resulted in a VNT sensitivity (Se) of 92.7% and specificity (Sp) of 27.1%, with (k) of 0.23, reflecting a weak agreement between the two techniques. The correlation coefficient between OD and antibody titers showed a moderate positivity (r = 0.54) with p<0.05. Testing of both milk and serum revealed a considerable number of samples with high VN titers and low ODs. On the other side, many samples with low VN titers showed high ODs in the ELISA. Based on the above mentioned results, and assuming that the presence of PI animals usually results in VN titers ≥ 80, we conclude that the VNT is more appropriate to conduct herd screening in bulk milk when the objective is to detect herds with high titers of neutralizing antibodies, potentially harboring PI animals. / O sucesso nas estratégias de controle e erradicação do vírus da diarréia viral bovina (BVDV), passa pela identificação e eliminação dos animais persistentemente infectados (PI). Como esses animais excretam continuamente o vírus, a prevalência e os títulos de anticorpos nos rebanhos que os possuem são geralmente altos. Por isso, amostras de tanques coletivos de leite são frequentemente utilizadas na triagem de rebanhos. No presente trabalho, amostras coletivas de leite e amostras de soro foram submetidas a duas técnicas sorológicas, a fim de estabelecer a mais adequada para esta finalidade. Para tal, 767 amostras coletivas de leite e 701 amostras de soro bovino foram testadas com um kit ELISA indireto (teste padrão) e pela técnica de vírus-neutralização (VNT). Devido aos efeitos tóxicos do leite sobre o cultivo celular, a VNT foi adaptada, o que consistiu no aumento do volume final na etapa de incubação com os cultivos celulares. No teste do leite, foram positivas 177 e 139 amostras, no ELISA e na VNT, respectivamente. Com isso, a VNT adaptada apresentou uma sensibilidade (Se) de 76,8% e uma especificidade (Sp) de 99,5%. O índice Kappa (k) foi de 0,82, demonstrando uma ótima concordância entre as duas técnicas. A análise do coeficiente de correlação entre os valores de absorbância no ELISA (OD) e os títulos de anticorpos na VNT nas amostras positivas, demonstrou uma correlação moderada positiva (r = 0,57) com p<0,05. No teste do soro, foram positivas 442 e 602 amostras no ELISA (teste padrão) e na VNT, respectivamente. Observou-se uma (Se) de 92,7% e (Sp) de 27,1%, com (k) de 0,23, demonstrando uma fraca concordância entre as duas técnicas. O coeficiente de correlação entre OD e os títulos de anticorpos demonstrou uma correlação moderada positiva (r = 0,54) com p<0,05. Observaram-se nos testes do leite e do soro, várias amostras com títulos altos na VNT apresentando ODs baixas a medianas. Por outro lado, várias amostras com títulos neutralizantes baixos apresentaram ODs altas. Baseado nos resultados, e partindo do pressuposto que a presença de animais PI reflete-se em títulos neutralizantes geralmente ≥ 80, conclui-se que a VNT é mais adequada para a realização de triagem em amostras coletivas de leite quando objetiva-se detectar rebanhos com altos títulos de anticorpos neutralizantes, possíveis portadores de animais PI.

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um Pestivirus, pertencente à família Flaviviridae, o qual é dividido em dois genótipos ou espécies (BVDV-1 e BVDV-2), e em pelo menos 20 subgenótipos de BVDV-1 (1a-1t) e três de BVDV-2 (2a-2c). O BVDV também pode ser classificado em biótipos [citopático(cp) e não-citopático (ncp)]. As perdas reprodutivas podem ser a consequência econômica mais importante da infecção. A infecção persistente (PI) pode ocorrer quando há uma infecção entre os 42 e 125 dias de gestação, e se o feto sobreviver, o bezerro será imunotolerante ao vírus e como resultado pode desenvolver doença das mucosas (DM). O objetivo desse estudo é descrever um surto de infecção por BVDV-1d em bezerros de corte que apresentaram lesões de DM atípica, abordando aspectos clínicos, epidemiológicos, virológicos e patológicos. O surto ocorreu em uma propriedade rural de bovinos de corte Angus localizada em Glorinha, Rio Grande do Sul, Brasil. Em um intervalo de 15 dias, 11 de 164 bezerros apresentaram sinais clínicos de anorexia, sialorreia acentuada, perda de peso e andar rígido com claudicação, progredindo para decúbito e morte em um curso clínico de sete dias. Todos esses 11 bezerros apresentavam em mucosa oral e nasal, região interdigital de membros torácicos e pélvicos extensas áreas de ulceração. Três bezerros foram necropsiados: úlceras orais e nasais foram observadas, frequentemente envolvendo gengiva, palato duro, palato mole e plano nasal; ulcerações lineares multifocais na língua, esôfago e rúmen; e também ulcerações multifocais arredondadas no abomaso. Além disso, o bezerro #2 exibiu na pele de regiões ventrais do corpo espessamento difuso com formação crostosa acentuada, ocasionalmente áreas de ulceração. Microscopicamente, as lesões ulcerativas em mucosas e pele consistiam em necrose superficial, com numerosas células apoptóticas, células epiteliais vacuolizadas e hiperqueratose paraqueratótica difusa acentuada. O exame imuno-histoquímico (IHQ) da pele dos três bezerros evidenciou acentuada imunomarcação no citoplasma de células epiteliais, enquanto na mucosa oral evidenciou moderada a acentuada imunomarcação. Todos os 11 bezerros mortos foram positivos no RT-PCR para detecção do Pestivirus, assim como outros 11 bezerros vivos (de 387 animais restantes no rebanho). Após quatro semanas, os exames de RT-PCR e IHQ dos 11 bezerros vivos foram repetidos com resultados positivos, comprovando o status de animais PI. O sequenciamento de partes do genoma determinou que todos animais haviam sido infectados por um BVDV- 1 do subgenótipo “d”. BVDV cp foi isolado das amostras de 8 bezerros mortos; enquanto apenas BVDV ncp foi isolado de amostras dos 11 bezerros vivos. Os achados patológicos, moleculares e virológicos permitiram concluir que esse foi um surto de DM atípico em bezerros causado por BVDV-1d com lesões restritas ao trato alimentar superior e pele. Como as características epidemiológicas e clínicas de doenças vesiculares podem ser muito similares ao observado, recomenda-se que os testes diagnósticos específicos para BVDV (histopatologia, IHQ e RT-PCR) sejam empregados rotineiramente na necropsia em surtos com lesões atípicas similares em bovinos. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is a Pestivirus, belonging to the Flaviviridae family, also divided in two genotypes or species (BVDV-1 and BVDV-2), and in at least 20 subgenotypes of BVDV-1 (1a-1t) and three of BVDV-2 (2a-2c). BVDV can also be classified into biotypes (cytopathic and noncytopathic). Reproductive losses may be the most economically important consequence of the infection. Persistent infection (PI) may occur when there is an infection between 42 and 125 days of gestation, and if the fetus survives, the calf will be immunotolerant to the virus and a possible outcome is mucosal disease (DM). The aim of this study is to describe an outbreak of BVDV-1d infection in calves of a beef herd cattle that presented atypical DM lesions, with a clinical, epidemiological, virological and pathological approach. The outbreak occurred in a beef Angus cattle farm located in Glorinha, Rio Grande do Sul state, Brazil. Within 15 days, 11 of 164 calves presented clinical signs of anorexia, severe sialorrhoea, weight loss and stiff gait with lameness, progressing to recumbency, and death in a clinical course of seven days. All these 11 calves presented in oral and nasal mucosa, interdigital region of thoracic and pelvic limbs extensive areas of ulceration. Three calves were necropsied: oral and nasal ulcers were observed, often involving gingiva, hard palate, soft palate and nasal planum; multifocal linear ulcerations in tongue, esophagus and rumen; and also rounded multifocal ulcerations in the abomasum. In addition, calf #2 showed diffuse thickening of the skin with severe crust formation, occasionally ulceration, in ventral body regions. Microscopically, ulcerative lesions observed in mucosas and cutaneous lesions consisted of superficial necrosis, with numerous apoptotic cells, vacuolation of epithelial cells and severe diffuse parakeratotic hyperkeratosis. Immunohistochemistry (IHC) of skin of the three calves showed severe immunostaining in the cytoplasm of epithelial cells, while oral mucosa showed moderate to severe immunostaining. All 11 dead calves were positive in RT-PCR for detection of Pestivirus along with other 11 live calves (from 387 remaining animals from herd). After four week, RT-PCR and IHC of these 11 live animals were repeated with positive results, which prove the PI status of these animals. All animals were infected by BVDV-1 of subgenotype ”d” according to parts of the genome of the virus that were sequenced.. Cytopathic BVDV was isolated from samples of 8 dead calves; only non-cytophatic BVDV were isolated from samples of 11 live animals. Pathological, molecular and virological findings allowed us to conclude that this was an outbreak of atypical DM in calves caused by BVDV-1d with lesions restricted to the upper alimentary system and skin. Since epidemiological and clinical features of vesicular diseases may be very similar to what was observed, it is recommended that BVDV diagnostic tests (histopathology, IHC and RT-PCR) should be routinely included in the necropsy workup in outbreaks with similar atypical lesions in cattle.

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um Pestivirus, pertencente à família Flaviviridae, o qual é dividido em dois genótipos ou espécies (BVDV-1 e BVDV-2), e em pelo menos 20 subgenótipos de BVDV-1 (1a-1t) e três de BVDV-2 (2a-2c). O BVDV também pode ser classificado em biótipos [citopático(cp) e não-citopático (ncp)]. As perdas reprodutivas podem ser a consequência econômica mais importante da infecção. A infecção persistente (PI) pode ocorrer quando há uma infecção entre os 42 e 125 dias de gestação, e se o feto sobreviver, o bezerro será imunotolerante ao vírus e como resultado pode desenvolver doença das mucosas (DM). O objetivo desse estudo é descrever um surto de infecção por BVDV-1d em bezerros de corte que apresentaram lesões de DM atípica, abordando aspectos clínicos, epidemiológicos, virológicos e patológicos. O surto ocorreu em uma propriedade rural de bovinos de corte Angus localizada em Glorinha, Rio Grande do Sul, Brasil. Em um intervalo de 15 dias, 11 de 164 bezerros apresentaram sinais clínicos de anorexia, sialorreia acentuada, perda de peso e andar rígido com claudicação, progredindo para decúbito e morte em um curso clínico de sete dias. Todos esses 11 bezerros apresentavam em mucosa oral e nasal, região interdigital de membros torácicos e pélvicos extensas áreas de ulceração. Três bezerros foram necropsiados: úlceras orais e nasais foram observadas, frequentemente envolvendo gengiva, palato duro, palato mole e plano nasal; ulcerações lineares multifocais na língua, esôfago e rúmen; e também ulcerações multifocais arredondadas no abomaso. Além disso, o bezerro #2 exibiu na pele de regiões ventrais do corpo espessamento difuso com formação crostosa acentuada, ocasionalmente áreas de ulceração. Microscopicamente, as lesões ulcerativas em mucosas e pele consistiam em necrose superficial, com numerosas células apoptóticas, células epiteliais vacuolizadas e hiperqueratose paraqueratótica difusa acentuada. O exame imuno-histoquímico (IHQ) da pele dos três bezerros evidenciou acentuada imunomarcação no citoplasma de células epiteliais, enquanto na mucosa oral evidenciou moderada a acentuada imunomarcação. Todos os 11 bezerros mortos foram positivos no RT-PCR para detecção do Pestivirus, assim como outros 11 bezerros vivos (de 387 animais restantes no rebanho). Após quatro semanas, os exames de RT-PCR e IHQ dos 11 bezerros vivos foram repetidos com resultados positivos, comprovando o status de animais PI. O sequenciamento de partes do genoma determinou que todos animais haviam sido infectados por um BVDV- 1 do subgenótipo “d”. BVDV cp foi isolado das amostras de 8 bezerros mortos; enquanto apenas BVDV ncp foi isolado de amostras dos 11 bezerros vivos. Os achados patológicos, moleculares e virológicos permitiram concluir que esse foi um surto de DM atípico em bezerros causado por BVDV-1d com lesões restritas ao trato alimentar superior e pele. Como as características epidemiológicas e clínicas de doenças vesiculares podem ser muito similares ao observado, recomenda-se que os testes diagnósticos específicos para BVDV (histopatologia, IHQ e RT-PCR) sejam empregados rotineiramente na necropsia em surtos com lesões atípicas similares em bovinos. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is a Pestivirus, belonging to the Flaviviridae family, also divided in two genotypes or species (BVDV-1 and BVDV-2), and in at least 20 subgenotypes of BVDV-1 (1a-1t) and three of BVDV-2 (2a-2c). BVDV can also be classified into biotypes (cytopathic and noncytopathic). Reproductive losses may be the most economically important consequence of the infection. Persistent infection (PI) may occur when there is an infection between 42 and 125 days of gestation, and if the fetus survives, the calf will be immunotolerant to the virus and a possible outcome is mucosal disease (DM). The aim of this study is to describe an outbreak of BVDV-1d infection in calves of a beef herd cattle that presented atypical DM lesions, with a clinical, epidemiological, virological and pathological approach. The outbreak occurred in a beef Angus cattle farm located in Glorinha, Rio Grande do Sul state, Brazil. Within 15 days, 11 of 164 calves presented clinical signs of anorexia, severe sialorrhoea, weight loss and stiff gait with lameness, progressing to recumbency, and death in a clinical course of seven days. All these 11 calves presented in oral and nasal mucosa, interdigital region of thoracic and pelvic limbs extensive areas of ulceration. Three calves were necropsied: oral and nasal ulcers were observed, often involving gingiva, hard palate, soft palate and nasal planum; multifocal linear ulcerations in tongue, esophagus and rumen; and also rounded multifocal ulcerations in the abomasum. In addition, calf #2 showed diffuse thickening of the skin with severe crust formation, occasionally ulceration, in ventral body regions. Microscopically, ulcerative lesions observed in mucosas and cutaneous lesions consisted of superficial necrosis, with numerous apoptotic cells, vacuolation of epithelial cells and severe diffuse parakeratotic hyperkeratosis. Immunohistochemistry (IHC) of skin of the three calves showed severe immunostaining in the cytoplasm of epithelial cells, while oral mucosa showed moderate to severe immunostaining. All 11 dead calves were positive in RT-PCR for detection of Pestivirus along with other 11 live calves (from 387 remaining animals from herd). After four week, RT-PCR and IHC of these 11 live animals were repeated with positive results, which prove the PI status of these animals. All animals were infected by BVDV-1 of subgenotype ”d” according to parts of the genome of the virus that were sequenced.. Cytopathic BVDV was isolated from samples of 8 dead calves; only non-cytophatic BVDV were isolated from samples of 11 live animals. Pathological, molecular and virological findings allowed us to conclude that this was an outbreak of atypical DM in calves caused by BVDV-1d with lesions restricted to the upper alimentary system and skin. Since epidemiological and clinical features of vesicular diseases may be very similar to what was observed, it is recommended that BVDV diagnostic tests (histopathology, IHC and RT-PCR) should be routinely included in the necropsy workup in outbreaks with similar atypical lesions in cattle.

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um Pestivirus, pertencente à família Flaviviridae, o qual é dividido em dois genótipos ou espécies (BVDV-1 e BVDV-2), e em pelo menos 20 subgenótipos de BVDV-1 (1a-1t) e três de BVDV-2 (2a-2c). O BVDV também pode ser classificado em biótipos [citopático(cp) e não-citopático (ncp)]. As perdas reprodutivas podem ser a consequência econômica mais importante da infecção. A infecção persistente (PI) pode ocorrer quando há uma infecção entre os 42 e 125 dias de gestação, e se o feto sobreviver, o bezerro será imunotolerante ao vírus e como resultado pode desenvolver doença das mucosas (DM). O objetivo desse estudo é descrever um surto de infecção por BVDV-1d em bezerros de corte que apresentaram lesões de DM atípica, abordando aspectos clínicos, epidemiológicos, virológicos e patológicos. O surto ocorreu em uma propriedade rural de bovinos de corte Angus localizada em Glorinha, Rio Grande do Sul, Brasil. Em um intervalo de 15 dias, 11 de 164 bezerros apresentaram sinais clínicos de anorexia, sialorreia acentuada, perda de peso e andar rígido com claudicação, progredindo para decúbito e morte em um curso clínico de sete dias. Todos esses 11 bezerros apresentavam em mucosa oral e nasal, região interdigital de membros torácicos e pélvicos extensas áreas de ulceração. Três bezerros foram necropsiados: úlceras orais e nasais foram observadas, frequentemente envolvendo gengiva, palato duro, palato mole e plano nasal; ulcerações lineares multifocais na língua, esôfago e rúmen; e também ulcerações multifocais arredondadas no abomaso. Além disso, o bezerro #2 exibiu na pele de regiões ventrais do corpo espessamento difuso com formação crostosa acentuada, ocasionalmente áreas de ulceração. Microscopicamente, as lesões ulcerativas em mucosas e pele consistiam em necrose superficial, com numerosas células apoptóticas, células epiteliais vacuolizadas e hiperqueratose paraqueratótica difusa acentuada. O exame imuno-histoquímico (IHQ) da pele dos três bezerros evidenciou acentuada imunomarcação no citoplasma de células epiteliais, enquanto na mucosa oral evidenciou moderada a acentuada imunomarcação. Todos os 11 bezerros mortos foram positivos no RT-PCR para detecção do Pestivirus, assim como outros 11 bezerros vivos (de 387 animais restantes no rebanho). Após quatro semanas, os exames de RT-PCR e IHQ dos 11 bezerros vivos foram repetidos com resultados positivos, comprovando o status de animais PI. O sequenciamento de partes do genoma determinou que todos animais haviam sido infectados por um BVDV- 1 do subgenótipo “d”. BVDV cp foi isolado das amostras de 8 bezerros mortos; enquanto apenas BVDV ncp foi isolado de amostras dos 11 bezerros vivos. Os achados patológicos, moleculares e virológicos permitiram concluir que esse foi um surto de DM atípico em bezerros causado por BVDV-1d com lesões restritas ao trato alimentar superior e pele. Como as características epidemiológicas e clínicas de doenças vesiculares podem ser muito similares ao observado, recomenda-se que os testes diagnósticos específicos para BVDV (histopatologia, IHQ e RT-PCR) sejam empregados rotineiramente na necropsia em surtos com lesões atípicas similares em bovinos. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is a Pestivirus, belonging to the Flaviviridae family, also divided in two genotypes or species (BVDV-1 and BVDV-2), and in at least 20 subgenotypes of BVDV-1 (1a-1t) and three of BVDV-2 (2a-2c). BVDV can also be classified into biotypes (cytopathic and noncytopathic). Reproductive losses may be the most economically important consequence of the infection. Persistent infection (PI) may occur when there is an infection between 42 and 125 days of gestation, and if the fetus survives, the calf will be immunotolerant to the virus and a possible outcome is mucosal disease (DM). The aim of this study is to describe an outbreak of BVDV-1d infection in calves of a beef herd cattle that presented atypical DM lesions, with a clinical, epidemiological, virological and pathological approach. The outbreak occurred in a beef Angus cattle farm located in Glorinha, Rio Grande do Sul state, Brazil. Within 15 days, 11 of 164 calves presented clinical signs of anorexia, severe sialorrhoea, weight loss and stiff gait with lameness, progressing to recumbency, and death in a clinical course of seven days. All these 11 calves presented in oral and nasal mucosa, interdigital region of thoracic and pelvic limbs extensive areas of ulceration. Three calves were necropsied: oral and nasal ulcers were observed, often involving gingiva, hard palate, soft palate and nasal planum; multifocal linear ulcerations in tongue, esophagus and rumen; and also rounded multifocal ulcerations in the abomasum. In addition, calf #2 showed diffuse thickening of the skin with severe crust formation, occasionally ulceration, in ventral body regions. Microscopically, ulcerative lesions observed in mucosas and cutaneous lesions consisted of superficial necrosis, with numerous apoptotic cells, vacuolation of epithelial cells and severe diffuse parakeratotic hyperkeratosis. Immunohistochemistry (IHC) of skin of the three calves showed severe immunostaining in the cytoplasm of epithelial cells, while oral mucosa showed moderate to severe immunostaining. All 11 dead calves were positive in RT-PCR for detection of Pestivirus along with other 11 live calves (from 387 remaining animals from herd). After four week, RT-PCR and IHC of these 11 live animals were repeated with positive results, which prove the PI status of these animals. All animals were infected by BVDV-1 of subgenotype ”d” according to parts of the genome of the virus that were sequenced.. Cytopathic BVDV was isolated from samples of 8 dead calves; only non-cytophatic BVDV were isolated from samples of 11 live animals. Pathological, molecular and virological findings allowed us to conclude that this was an outbreak of atypical DM in calves caused by BVDV-1d with lesions restricted to the upper alimentary system and skin. Since epidemiological and clinical features of vesicular diseases may be very similar to what was observed, it is recommended that BVDV diagnostic tests (histopathology, IHC and RT-PCR) should be routinely included in the necropsy workup in outbreaks with similar atypical lesions in cattle.