A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia bastante difundida mundialmente. O Brasil, em 2015, foi responsável por aproximadamente 67% dos embriões bovinos produzidos in vitro no mundo (PERRY, 2014). Embora essa tecnologia seja bastante utilizada, é de grande interesse para o mercado desenvolver estratégias que levem ao maior aproveitamento dos oócitos obtidos e compreender os mecanismos, dentro do ambiente folicular, que determinam a competência oocitária. O microambiente folicular é fundamental para o crescimento e a aquisição da competência oocitária, tornando o oócito apto a desenvolver-se e manter o embrião até a transição materno embrionária. Para tanto, os componentes foliculares - células da granulosa, células do cumulus, oócito e líquido folicular - precisam trabalhar em unidade, visto que possuem uma relação de interdependência. Dentro dos mecanismos de comunicação existentes no ambiente folicular estão as vesículas secretadas por células, chamadas vesículas extracelulares, que foram descritas no líquido folicular, contendo material bioativo como proteínas, lipídios e RNAs, incluindo os microRNAs. Contudo, os componentes do ambiente folicular podem refletir na qualidade do oócito que será produzido e a hipótese geral deste trabalho é de que os miRNAs presentes no ambiente folicular regulam vias de sinalização importantes para o desenvolvimento oocitário e que os miRNAs e ou RNAs mensageiros presentes nas células foliculares podem ser explorados como importantes ferramentas para o diagnóstico da qualidade oocitária. O primeiro estudo determinou perfis transcricionais de miRNAs em células da granulosa, em complexos cumulus-oócito e em vesículas extracelulares derivadas destas células e também do fluido folicular. Além de conhecer a origem e o papel dos miRNAs no ambiente folicular, estes perfis de expressão indicaram a regulação no ambiente folicular da via de sinalização da PI3K-Akt. No segundo estudo, componentes desta via de sinalização foram então determinados em células foliculares associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Os resultados demonstram que a ativação da via PI3K-Akt em células foliculares correlaciona-se à maior competência oocitária; de modo oposto, a menor atividade desta via nas células foliculares está relacionada à reduzida competência oocitária. Nos estudos três e quatro, um conjunto de experimentos foram realizados para determinar o perfil de microRNAs e RNAs mensageiros em células do cumulus associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Buscou-se esclarecer alguns dos mecanismos responsáveis pela melhor qualidade oocitária e levar a identificação de biomarcadores de qualidade oocitária permitindo o avanço e o desenvolvimento de novas ferramentas para intensificar a produção in vitro de embriões bovinos. Por fim, estes resultados demonstram respostas integradas entre oócitos e células foliculares durante o desenvolvimento folicular e o processo de aquisição de competência oocitária e identificaram marcadores de qualidade oocitária. / In vitro embryo production of is a widespread biotechnology worldwide. In 2015 Brazil was responsible for approximately 67% of bovine embryos produced in vitro in the world (PERRY, 2014). Although widely used, to develop strategies that lead to better use of oocytes and understand the mechanisms (in follicular microenvironment) that determine oocyte competence is of great interest to national market. The follicular microenvironment is fundamental for oocyte growth and acquisition of competence, making the oocyte able to develop and maintain the embryo until the embryonic maternal transition. For this end, the follicular components - granulosa cells, cumulus cells, oocytes and follicular fluid - need to work in unity, since they have arelation of interdependence. Within the mechanisms of communication existing within the follicular environment are vesicles secreted by cells, called extracellular vesicles, which were described in follicular fluid, containing bioactive material such as proteins, lipids and RNAs, including microRNAs. The components of follicular environment may reflect the quality of the oocyte that will be produced and the general hypothesis of this work is that the miRNAs present in the follicular environment regulate signaling pathways important for oocyte development and that the miRNAs and/or messenger RNAs present in the follicular cells can be explored as important tools for the diagnosis of oocyte quality. The first study determined profiles of miRNAs in granulosa cells, cumulus-oocyte complexes and extracellular vesicles derived from these cells and also in follicular fluid. In addition, by knowing the origin and role of miRNAs in the follicular environment, the expression profiles indicated the PI3K-Akt signaling pathway regulation in the follicular environment. In the second study, components of this signaling pathway were then determined in follicular cells associated with oocytes of high or low developmental competence. The results demonstrated that the activation of the PI3K-Akt pathway in follicular cells correlates with increased oocyte competence; conversely, the lower activity of this pathway in follicular cells is related to reduced oocyte competence. In studies three and four, experiments were performed to determine the profile of microRNAs and messenger RNAs in cumulus cells associated with oocytes of high or low developmental competence. Aiming to clarify some of the mechanisms responsible for the best oocyte quality that lead to the identification of oocyte quality biomarkers, allows the advancement and development of new tools to intensify the in vitro production of bovine embryos. Finally, results obtained demonstrate integrated responses between oocytes and follicular cells during follicular development and give new insights to the study of oocyte competence acquisition process and identified oocyte quality markers.

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A competência meiótica nos oócitos foi verificada pela extrusão do 1º corpúsculo polar (CP) após 40 h de MIV. Os oócitos foram divididos em 3 grupos para PIVE: grupo controle (FIV), ativação partenogenética utilizando 5 μM de ionomicina em associação com 2 mM de 6-DMAP ou em associação com 50 μM de roscovitina. Para a FIV, os espermatozóides obtidos do coágulo seminal, foram diluídos em água de coco em pó (ACP-118®) e submetidos ao resfriamento para serem levados posteriormente ao cultivo in vitro com os oócitos. O aumento no tempo da MIV e a presença de várias células do cumulus associadas aos oócitos proporcionaram maior expansão das células do cumulus, pois somente os CCO intactos alcançaram a expansão total em 40 h de MIV (p < 0,005). A presença das células do cumulus nos oócitos (PCC e CCO intactos) maturados in vitro por 40 h promoveu a competência meiótica (metáfase II) significamente mais elevada que os OD (p < 0,005). Após 6 h de resfriamento em ACP-118® e separação pelo método do swin-up, os espermatozóides utilizados na FIV possuíam 80% de motilidade e vigor 4. O tratamento com ionomicina/roscovitina promoveu a extrusão do 2º CP e formação pronuclear e com ionomicina/6-DMAP formou pronúcleos, sem extrusão do 2º CP. O protocolo utilizando a ionomicina/6-DMAP e da FIV originou as primeiras divisões embrionárias, observada pela taxa de clivagem. Os resultados encontrados sugerem que em C. apella a presença e a expansão total das células do cumulus estão relacionadas com a competência oocitária. A utilização dos oócitos maturados in vitro e dos espermatozóides diluídos e resfriados em ACP-118® promoveu a PIVE por diferentes métodos nesta espécie. / The objective of this study was to evaluate in vitro maturation (IVM) of oocytes in C. apella, reporting with cumulus expansion and promoting in vitro embryo development, by means of the parthenogenetic activation and in vitro fertilization (IVF). Oocytes were recovered by antral follicles aspiration measuring 2-9 mm of diameter and had been classified in denuded oocyte (DO), poor cumulus cells (PCC) and intact cumulus-oophorus complex (intact COC). At the 0, 36 and 40 h of IVM culture, the degree of cumulus expansion was assessed and classified into five categories. Development competence oocytes were verified which includes abstriction of the first polar body after 40 h IVM. Oocytes were divided in three groups: control group (IVF); parthenogenetic activation using 5 μM of ionomycin in association with 2 mM of 6-DMAP; or with 50 μM of roscovitine. Seminal coagulum was liquefied in coconut water solution (ACP-118®) and submitted to the cooling to be taken later IVF culture. The increase in the time of the IVM and the presence of some cumulus cells associates with oocytes had provided greater cumulus expansion, therefore the intact CCO had only reached the total expansion in 40 h after IVM (p < 0.005). The presence of the cumulus cells in the in vitro matured oocytes (intact COC and PCC) for 40 h promoted meiotic competence more than DO (p < 0.005). After 6 h of cooling in ACP-118® and separation for SWIN-UP method, the spermatozoa used in the IVF obtained 80% motility and vigor 4. Exposure of oocytes to ionomycin/roscovitine induced the resumption of meiosis with extruded the second polar body and formed pronuclei. In contrast, oocytes activated with ionomycin/6-DMAP induced pronuclear formation without extrude a second polar body. IVF and ionomycin/6-DMAP treatments produced embryos that reached the cleavage stage. Our results suggest that the presence and the full cumulus expansion are correlate with the acquisition of meiotic and development competence in C. apella. Oocytes matured in vitro and the spermatozoa diluted and cooled in ACP-118® produced embryos in this specie.

A Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP) representa um dos distúrbios endócrinos reprodutivos mais comuns em mulheres em idade reprodutiva. As mulheres com SOP normalmente respondem bem ao tratamento de reprodução assistida (TRAs), mas frequentemente apresentam oócitos de baixa qualidade e capacidade reprodutiva, a qual está correlacionado com a interação do oócito com as células do cumulus. A baixa qualidade oocitária pode estar relacionada a perda de estabilidade genômica do oócito, ou até mesmo das células do cumulus, o que pode levar a uma redução gradativa da fertilidade feminina. Os telômeros e a atividade da telomerase possuem um papel fundamental na manutenção da estabilidade genômica e são considerados importantes marcadores de viabilidade celular, podendo ser um indicativo da qualidade oocitária. O objetivo do estudo foi avaliar o comprimento do telômero e atividade da telomerase nas células do cumulus de mulheres com SOP. Neste estudo prospectivo caso-controle foram incluídas 110 voluntárias, sendo 43 mulheres com SOP e 67 controles no período de Setembro de 2015 a Junho de 2017. Foram avaliados os dados como idade, Índice de massa corporal (IMC), hormônio luteinizante (LH), hormônio folículo estimulante (FSH), globulina de ligação de hormônios sexuais (SHBG), prolactina, estradiol, insulina, testosterona total, androstenediona, índice de androgênio livre (FAI), homocisteína e proteína c-reativa. Foi avaliado o comprimento do telômero nas células do cumulus de oócitos imaturos (CCI), nas células do cumulus de oócitos maduros (CCM), nos oócitos imaturos no estágio de vesícula germinativa (VG), nos oócitos imaturos em metáfase I (MI) e nos leucócitos pelo método quantitativo da reação em cadeia da polimerase (qPCR). A atividade da telomerase das CCI, CCM, dos oócitos VG e MI foram avaliadas pelo Kit TRAPeze® XL. A análise estatística foi determinada pelo teste Mann-Whitney, regressão linear múltipla e correlação de Spearman. Os resultados foram que as variáveis IMC (p=0,001), LH (p=0,015), estradiol (p=0,004), insulina (p=0,002), testosterona (p<0,0001), androstenediona (p=0,001), FAI (p<0,0001) e proteína c-reativa (p=0,003) foram maiores no grupo SOP. FSH (p=0,0002) foi menor no grupo SOP. A prolactina e a homocisteína não diferiram entre os grupos. O comprimento do telômero nas CCI não diferiu entre os grupos SOP e controle (1,60±0,56 vs 1,58±0,33; p=0,649, respectivamente), bem como o comprimento do telômero nas CCM não diferiu entre os grupos SOP e controle (1,61±0,47 vs 1,70±0,43; p=0,378, respectivamente). Entretanto, nos leucócitos o comprimento do telômero foi menor no grupo SOP (p=0,025). A atividade da telomerase nas CCI foi maior no grupo SOP do que no grupo controle (1,62±1,49 vs 0,30±0,42; p=0,003, respectivamente) e a atividade da telomerase nas CCM também foi maior no grupo SOP do que no grupo controle (1,39±1,63 vs 0,55±0,84; p=0,022, respectivamente). O comprimento do telômero e a atividade da telomerase nos oócitos VG e MI não diferiu entre os grupos. Uma correlação positiva foi observada entre a atividade da telomerase e o comprimento do telômero nas CCI no grupo controle (p=0,051). O grupo SOP apresentou uma correlação positiva entre a atividade da telomerase e o comprimento do telômero, porém nas CCM (p=0,048). Foi observada uma correlação positiva do comprimento do telômero entre as células (leucócitos, CCI e CCM) em ambos os grupos. Os dados sugerem que a SOP parece não afetar o comprimento do telômero nas CCI e CCM, apenas nos leucócitos. Por outro lado, uma maior atividade da telomerase nas CCI e CCM pode ser necessária para a manutenção do comprimento telomérico à nível reprodutivo nas mulheres com SOP. / Polycystic Ovarian Syndrome (PCOS) represents one of the most common reproductive endocrine disorders in women of reproductive age. Women with PCOS, despite responding well to Assisted Reproduction Treatments (ART), the oocytes usually have low quality and reproductive capacity, which is correlated to oocyte interaction with cumulus cells. The low oocyte quality may be related to loss of genomic stability of oocytes, or even cumulus cells, and may lead to a reduction of female fertility. The telomere length and telomerase activity play a fundamental role in maintaining genomic stability, which is considered an important molecular marker of cell viability, whose alterations are related to apoptosis and/or senescence, maybe also an indicative of oocyte quality. The aim of the study was to evaluate the telomere length and telomerase activity in cumulus cells of women with PCOS. In this prospective case-control study, 110 volunteers were included, 43 women with PCOS and 67 controls from September 2015 to June 2017. Data were evaluated as age, body mass index (BMI), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), sex hormone binding globulin (SHBG), prolactin, estradiol, insulin, total testosterone, androstenedione, index of free androgen (FAI), homocysteine and c-reactive protein. Telomere length in cumulus cells from immature (ICC) and mature (MCC) oocytes, leukocytes and immature oocytes in the germinal vesicle stage (VG) and in metaphase I (MI) were evaluated by quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR). Telomerase activity of ICC, MCC, VG and IM oocytes were evaluated by TRAPeze® XL Kit. Statistical analyses were determined by the MannWhitney test, multiple linear regression and Spearman\'s correlation. The results were that the variables BMI (p=.001), LH (p=.015), estradiol (p=.004), insulin (p=.002), testosterone (p<.0001), androstenedione (p=.001), FAI (p<.0001) and c-reactive protein (p=.003) was increased in PCOS group. FSH (p=.0002) was smaller in PCOS group. Prolactin and homocysteine were not different between the groups. The telomeres length in ICC did not differ between PCOS and control groups (1.60±0.56 vs 1.58±0.33; p=.649, respectively). The telomeres length in MCC did not differ between PCOS and control groups (1.61±0.47 vs 1.70±0.43; p=.378, respectively). However, in leukocytes reduced telomeres were observed in the PCOS (p=.025), respectively. The telomerase activity in ICC was higher in the PCOS group than in the control group (1.62±1.49 vs 0.30±0.42; p=.003, respectively) and the telomerase activity in MCC was higher in the PCOS group than in the control group (1.39±1.63 vs 0.55±0.84; p=.022, respectively). The telomere length and telomerase activity in VG and MI oocytes did not differ between groups. A positive correlation between telomerase activity and telomere length in the ICC was observed in control group (p=.051). PCOS also presented a positive correlation between telomerase activity and telomere length in MCC (p=.048). Telomere length of leukocytes, ICC and MCC were a positive correlated in both groups. The data suggest that PCOS does not appear to affect telomere length in ICC and MCC, only in leukocytes. On the other hand, a greater activity of telomerase in CCI and CCM may be necessary for the maintenance of telomere length at the reproductive level in women with PCOS.

A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia bastante difundida mundialmente. O Brasil, em 2015, foi responsável por aproximadamente 67% dos embriões bovinos produzidos in vitro no mundo (PERRY, 2014). Embora essa tecnologia seja bastante utilizada, é de grande interesse para o mercado desenvolver estratégias que levem ao maior aproveitamento dos oócitos obtidos e compreender os mecanismos, dentro do ambiente folicular, que determinam a competência oocitária. O microambiente folicular é fundamental para o crescimento e a aquisição da competência oocitária, tornando o oócito apto a desenvolver-se e manter o embrião até a transição materno embrionária. Para tanto, os componentes foliculares - células da granulosa, células do cumulus, oócito e líquido folicular - precisam trabalhar em unidade, visto que possuem uma relação de interdependência. Dentro dos mecanismos de comunicação existentes no ambiente folicular estão as vesículas secretadas por células, chamadas vesículas extracelulares, que foram descritas no líquido folicular, contendo material bioativo como proteínas, lipídios e RNAs, incluindo os microRNAs. Contudo, os componentes do ambiente folicular podem refletir na qualidade do oócito que será produzido e a hipótese geral deste trabalho é de que os miRNAs presentes no ambiente folicular regulam vias de sinalização importantes para o desenvolvimento oocitário e que os miRNAs e ou RNAs mensageiros presentes nas células foliculares podem ser explorados como importantes ferramentas para o diagnóstico da qualidade oocitária. O primeiro estudo determinou perfis transcricionais de miRNAs em células da granulosa, em complexos cumulus-oócito e em vesículas extracelulares derivadas destas células e também do fluido folicular. Além de conhecer a origem e o papel dos miRNAs no ambiente folicular, estes perfis de expressão indicaram a regulação no ambiente folicular da via de sinalização da PI3K-Akt. No segundo estudo, componentes desta via de sinalização foram então determinados em células foliculares associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Os resultados demonstram que a ativação da via PI3K-Akt em células foliculares correlaciona-se à maior competência oocitária; de modo oposto, a menor atividade desta via nas células foliculares está relacionada à reduzida competência oocitária. Nos estudos três e quatro, um conjunto de experimentos foram realizados para determinar o perfil de microRNAs e RNAs mensageiros em células do cumulus associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Buscou-se esclarecer alguns dos mecanismos responsáveis pela melhor qualidade oocitária e levar a identificação de biomarcadores de qualidade oocitária permitindo o avanço e o desenvolvimento de novas ferramentas para intensificar a produção in vitro de embriões bovinos. Por fim, estes resultados demonstram respostas integradas entre oócitos e células foliculares durante o desenvolvimento folicular e o processo de aquisição de competência oocitária e identificaram marcadores de qualidade oocitária. / In vitro embryo production of is a widespread biotechnology worldwide. In 2015 Brazil was responsible for approximately 67% of bovine embryos produced in vitro in the world (PERRY, 2014). Although widely used, to develop strategies that lead to better use of oocytes and understand the mechanisms (in follicular microenvironment) that determine oocyte competence is of great interest to national market. The follicular microenvironment is fundamental for oocyte growth and acquisition of competence, making the oocyte able to develop and maintain the embryo until the embryonic maternal transition. For this end, the follicular components - granulosa cells, cumulus cells, oocytes and follicular fluid - need to work in unity, since they have arelation of interdependence. Within the mechanisms of communication existing within the follicular environment are vesicles secreted by cells, called extracellular vesicles, which were described in follicular fluid, containing bioactive material such as proteins, lipids and RNAs, including microRNAs. The components of follicular environment may reflect the quality of the oocyte that will be produced and the general hypothesis of this work is that the miRNAs present in the follicular environment regulate signaling pathways important for oocyte development and that the miRNAs and/or messenger RNAs present in the follicular cells can be explored as important tools for the diagnosis of oocyte quality. The first study determined profiles of miRNAs in granulosa cells, cumulus-oocyte complexes and extracellular vesicles derived from these cells and also in follicular fluid. In addition, by knowing the origin and role of miRNAs in the follicular environment, the expression profiles indicated the PI3K-Akt signaling pathway regulation in the follicular environment. In the second study, components of this signaling pathway were then determined in follicular cells associated with oocytes of high or low developmental competence. The results demonstrated that the activation of the PI3K-Akt pathway in follicular cells correlates with increased oocyte competence; conversely, the lower activity of this pathway in follicular cells is related to reduced oocyte competence. In studies three and four, experiments were performed to determine the profile of microRNAs and messenger RNAs in cumulus cells associated with oocytes of high or low developmental competence. Aiming to clarify some of the mechanisms responsible for the best oocyte quality that lead to the identification of oocyte quality biomarkers, allows the advancement and development of new tools to intensify the in vitro production of bovine embryos. Finally, results obtained demonstrate integrated responses between oocytes and follicular cells during follicular development and give new insights to the study of oocyte competence acquisition process and identified oocyte quality markers.