Catharanthus roseus synthétise et accumule de nombreux alcaloïdes indolique monoterpénique (AIMs) dont certains sont utilisés dans des traitements par chimiothérapie. De nombreux travaux sont entrepris au sein de l'EA 2106 "Biomolécules et biotechnologies végétales", afin d'étudier notamment les mécanismes de régulation de la biosynthèse des AIMs d'intérêt. Dans ce cadre, le modèle utilisé est la souche cellulaire C2OD qui nécessite pour sa croissance la présence d'acide 2,4-dichlorophénoxy acétique (2,4-D) qui constitue un signal inhibiteur fort de la biosynthèse des AIMs. Le but de ce travail de thèse a été de caractériser les mécanismes de perception et de transduction du signal induit par le 2,4-D dans les cellules de C. Roseus. Tout d'abord, nous avons montré que le signal 2,4-D est lié à sa nature hormonale. Par ailleurs nous avons étudié le rôle du calcium comme messager secondaire potentiel dans la transduction du signal 2,4-D. Nous avons pu montrer une implication antagoniste des canaux calciques IP3R et RyR dans la régulation de la biosynthèse des AIMs à un niveau transcriptionnel. Enfin, nous avons engagé une étude de la transduction du signal 2,4-D par imagerie SIMS. Nous avons réalisé des images analytiques de la distribution de molécules marquées, comme un activateur du canal RyR marqué par du C et du N et d'un analogue structural et fonctionnel du 2,4-D marqué par deux atomes de brome. Ce travail de thèse a permis une réelle avancée dans la connaissance des mécanismes de régulation du métabolisme des AIMs induit par le 2,4-D qui semble constituer un modèle d'étude original d'un nouveau degré de complexité de la signature calcique cellulaire. / Catharanthus roseus synthesizes and accumulates numerous monoterpenoid indole alkaloids (MIAs) like vinblastine and vincristine, both used in chimiotherapeutic treatment. Numerous works, engaged in "Biomolecules et biotechnologies végétales" research team, study regulation of the biosynthesis of these valuables compounds. For this purpose, the model used is the C2OD strain cell that is dependant of the presence of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), a negative regulator of the MIAs biosynthesis. The aim of this PhD work was to characterize the perception and transduction mechanisms of the regulatory signal leading by 2,4-D. First, we show that the 2,4-D signal is linked to its hormonal nature. Moreover, we studied the role of calcium as a potential secondary messenger in the 2,4-D signal transduction. We show an antagonistic implication of the RyR and IP3R calcium channels in the regulation of the MIAs biosynthesis. Finally, we started a study of the transduction of the 2,4-D by SIMS imagery. We realized analytical images of the distribution of labeled compounds like a RyR activator labeled with C and N and a structural and functional 2,4-D analogue labeled with two bromide. This PhD work allowed significant progresses in the comprehension of the MIAs biosynthesis regulation by 2,4-D that could constitute an original model for studying new level of complexity of the cellular calcium signature.

La structure de l’épiderme est le résultat de la régulation de l’équilibre entre la prolifération, la migration et la différenciation des kératinocytes. Le calcium est un second messager contrôlant ces mécanismes. Parmi les différents acteurs de l’homéostasie calcique, les canaux ioniques jouent un rôle majeur. Ainsi, l’identification de ces canaux et des mécanismes par lesquels ils régulent la différenciation, la prolifération et la migration des kératinocytes est primordiale pour une meilleure compréhension de la physiologie de la peau humaine. Mes travaux se sont donc focalisés sur l’implication de ces canaux calciques dans les mécanismes impliqués dans le développement de l’épiderme. Les résultats ainsi obtenus ont pu mettre en évidence que la présence du canal TRPV6 à la membrane des kératinocytes est importante pour leur différenciation et qu’elle pouvait être régulée par un mécanisme de translocation à la membrane plasmique. Ces travaux montrent également, pour la première fois, que le canal Orai1 est exprimé dans les kératinocytes de l’épiderme humain et qu’il participe au courant calcique de type SOC. Le canal Orai1 n’est pas nécessaire à l’induction de la différenciation mais il est principalement impliqué dans la prolifération et la migration des kératinocytes des cellules de la couche basale de l’épiderme. L’implication d’Orai1 dans la migration des kératinocytes est liée à son rôle dans la dynamique des adhésions focales passant par l’activation de la protéine kinase FAK. / Structure of epidermis is the result of a fine regulated balance between proliferation, differentiation and migration of keratinocytes. Calcium is a second messenger controlling these mechanisms. Among the different players in calcium homeostasis, ionic channels play a major role. The study of these channels and the mechanisms by which they regulate the differentiation, the proliferation and the migration of keratinocytes is therefore crucial in the understanding of skin physiology. This study is focused on these different Ca2+ channels and their implication in the development of the epidermis. The results obtained have shown that TRPV6 plasma membrane expression in keratinocytes is important for differentiation and that it could be regulated by its translocation to the plasma membrane. These results also showed, for the first time, that Orai1 channels are expressed in human epidermis keratinocytes and are involved in SOC current. Also, Orai1 is not necessary for the induction of differentiation, but is mostly implicated in proliferation and migration of non-differentiated keratinocytes, like the cells in the basal layer of epidermis. Orai1 is, in fact, involved in the dynamic of the formation and the turnover of focal adhesions through activation of the protein kinase FAK. Finally, preliminary results have shown that Ca2+-induced differentiation of keratinocytes induces several phases of cytosolic Ca2+ concentration variations involving TRPV6 and Orai1 channels in different ways.

Les facteurs environnementaux appelés « perturbateurs endocriniens (PE) » semblent avoir un rôle dans le développement et la progression des cancers de la prostate (PCa). Il est bien établi que l'homéostasie calcique et l'activité des canaux ioniques sont impliquées dans la cancérogénèse prostatique et il est possible que ces PE favorisent la cancérogénèse en modulant la signalisation calcique. Dans ce contexte, nous avons étudié l’effet du bisphénol A (BPA) et du Triclosan (TCS) sur la signalisation calcique des cellules cancéreuses prostatiques humaines. Nous avons ainsi montré que le BPA pouvait induire la migration des cellules cancéreuses épithéliales prostatiques, par le biais de la modulation de l'expression des canaux ioniques impliqués dans le phénomène de Store-Operated Calcium Entry, dont le canal calcique Orai1. Au niveau des cellules épithéliales cancéreuses, nous avons aussi mis en évidence un remodelage de l'expression des canaux ioniques et une résistance à l'apoptose de ces cellules sous l’effet du TCS. Ensuite, nous avons montré dans les cellules stromales de PCa que le TCS induisait une entrée de calcium importante via le canal TRPA1, ce canal étant préférentiellement exprimé dans les cellules stromales de PCa. Par ailleurs, l'augmentation de calcium induite par le TCS est corrélée avec une sécrétion plus importante de VEGF, un facteur mitogène qui pourrait favoriser la croissance des cellules épithéliales ou endothéliales. Ces résultats pourraient permettre d’envisager de nouvelles thérapies ou thérapies complémentaires ciblant les canaux et de mettre en place des mesures préventives dans le traitement des PCa qui prennent en compte l'impact de ces PE. / Environmental factors called "endocrine disruptors (ED)" appear to have a potential role in the development and progression of cancer of the prostate (PCa). It is well established that calcium homeostasis and the activity of ion channels are involved in prostate carcinogenesis and it is possible that these ED promote carcinogenesis by modulating the calcium signalling. In this context, we studied the effect of bisphenol A (BPA) and Triclosan (TCS) on calcium signaling in human PCa cells. We have thus shown that BPA could induce the migration of prostate epithelial cancer cells through the modulation of ion channels expression which are involved in the phenomenon of Store-Operated Calcium Entry, including the calcium channel Orai1. At the level of cancer epithelial cells, we have also highlighted a remodeling of ion channels expression and a resistance to apoptosis of these cells under the influence of TCS. Then, we showed in stromal cells of human PCa that TCS induces an important calcium entry through the TRPA1 channel, this channel being preferentially expressed in stromal cells of PCa. Moreover, the TCS-induced calcium increase is correlated with a greater secretion of VEGF, a mitogenic factor that could promote the growth of epithelial or endothelial cells. These results allow to consider new therapies or complementary therapies targeting ion channels, and/or to implement preventive measures in the treatment of PCa taking into account the impact of these PE.

Des études récentes montrent que l'homéostasie calcique intracellulaire, ainsi que l'expression et l'activité de canaux ioniques jouent un rôle essentiel dans le contrôle de la prolifération cellulaire aussi bien dans un contexte physiologique que dans certains cancers. Cependant, aucune approche proposant les canaux ioniques comme cible thérapeutique n'est actuellement envisagée dans le cadre des traitements des cancers de la prostate. Dans ce travail nous avons mis en évidence l'expression, la fonctionnalité et l'implication des canaux potassiques calcium-activés (IKca1) dans la prolifération des lignées cellulaires cancéreuses de la prostate humaine. Ces études ont également montré que l'activation du canal lKca1 favorise l'entrée de calcium via un canal calcique de la famille des TRP, le canal TRPV6, impliqué dans l'entrée passive de calcium dans les cellules cancéreuses prostatiques. De plus, par des études de co-immunoprécipitations, nous avons montré que le canal IKca1 et le canal calcique TRPV6 sont associés formant ainsi un complexe moléculaire fonctionnel permettant l'entrée de calcium et la prolifération des cellules cancéreuses prostatiques humaines. Par ailleurs, une suppression du canal IKcat induit la différenciation neuroendocrine des cellules cancéreuses prostatiques humaines. Ceci suggère un rôle essentiel joué par le canal IKca1 pour favoriser la croissance ou induire la différenciation cellulaire. Nos études ont également mis en évidence une surexpression de l'ARNm et de la protéine d'IKca1 dans les tissus prostatiques atteints d'un cancer de la prostate humaine. Ces données permettraient de proposer ces canaux ioniques comme marqueurs de cancer et/ou comme cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement des cancers de la prostate humaine. / Recent studies show that the intracellular calcium homeostasis, as well as expression and the activity of ionic channels play an essential role in the control of cell proliferation as weIl in a physiological context as in certain cancers. However, no approaches offering ionic channels as therapeutic target is nowadays envisaged as part of the treatments of the cancers of the prostate. ln the present work, we showed the expression, functionality and involvement of calcium-activated potassium channels (IKCa1) in the proliferation of the human prostate cancer cells. These studies also showed that the activation of the IKca1 channel favours the calcium entry via a member of the TRP family of calcium channels, TRPV6, in the prostate cancer cells. Besides, by studies of co-immunoprécipitations, we showed that the IKca1 potassium channel and the TRPV6 calcium channel form a functional molecular complex allowing the calcium entry and the proliferation of the prostate cancer cells. Moreover, a down-regulation of the 1Kca1 channel leads to the neuroendocrine differentiation of the human prostate cancer cells. This suggests an essential role played by the 1Kca1 channel to favour growth or lead to cell differentiation. Our immunohistotluorescence studies also showed an overexpression of IKca1 mRNA and protein in human prostate cancer compared to non-tumor tissues. These data would allow to propose these ion channels as markers and/or as potential therapeutic targets in the treatment of the human prostate cancers.

Les cellules cancéreuses acquièrent lors de la cancérogenèse des caractéristiques telles qu’une insensibilité aux signaux antiprolifératifs, une résistance à l‘apoptose et au stress réticulaire, l’acquisition d’un pouvoir invasif. De nombreux travaux montrent l’implication du calcium dans ces différentes caractéristiques. Selon des données récentes, les canaux de la famille TRP (Transient Receptor Potential) sont des acteurs clefs dans l'homéostasie calcique. Plusieurs travaux ont montré que les changements d’expression de certains canaux TRP pouvaient contribuer à la cancérisation, entre autres TRPV6 et TRPV2 dans les cancers de prostate et de vessie. Nous montrons ici que la vitamine D3, étudiée depuis longtemps dans le cadre de thérapie anticancéreuse pour ses pouvoirs anti-prolifératifs, peut aussi stimuler la prolifération des cellules prostatiques cancéreuses, en augmentant l’expression de TRPV6 et le Ca2+ entrant par ce canal. Ainsi, nos résultats remettent en cause l’utilisation de la vitamine D3 en thérapie. Nous montrons également que l’adrénomédulline (AM), connue pour être impliquée dans la progression tumorale vers les métastases, stimule la migration et l’invasion des cellules cancéreuses prostatiques et urothéliales. Cet effet nécessite la présence du canal TRPV2; l’AM agit en induisant la translocation à la membrane plasmique du canal TRPV2 et de ce fait en augmentant la [Ca2+]i. Enfin, nous mettons en évidence que dans des conditions de stress réticulaire dans les cellules prostatiques cancéreuses, le translocon est le canal de fuite calcique majoritaire du réticulum endoplasmique menant à la vidange des stocks réticulaires et à la mort cellulaire. / Cancer cells acquire during carcinogenesis some characteristics such as insensitivity to the antiproliferative signals, resistance to apoptosis and reticular stress, the acquisition of invasive capacity. Numerous studies show involvement of calcium (Ca2+) in these different characteristics. According to recent data, the TRP channels (Transient Receptor Potential) are key players in calcium homeostasis. Several recent works have shown that changes of expression of some TRP channels could contribute to carcinogenesis, among other TRPV6 and TRPV2 in prostate and bladder cancers. Here we show that vitamin D3, studied for many years in cancer therapy for its anti-proliferative capacity, could also stimulates prostate cancer cells proliferation, this effect being associated with overexpression of TRPV6 and the subsequent increase in the Ca2+ entering through this channel. Thus, our results challenge the use of vitamin D3 in prostate cancer therapy. We also show that adrenomedullin (AM), known to be involved in tumor progression to metastasis, stimulates migration and invasion of prostate and urothelial cancer cells. This effect requires the presence of TRPV2; AM acts by inducing TRPV2 translocation to plasmamembrane and the subsequent increase of [Ca2+]i. Finally, we highlight that under conditions of reticular stress in prostate cancer cells, the translocon represents the endoplasmic reticulum calcium leak channel leading to the emptying of reticular stocks and cell death.

Dans les cardiomyocytes, la concentration intracellulaire de Ca2+ doit être finement régulée pour maintenir l’homéostasie calcique. La protéine Stromal interaction molecule 1 (STIM1), qui joue un rôle important dans le maintien des niveaux intracellulaires de Ca2+ des cellules non excitables en opérant l’entrée capacitative de Ca2+ (SOCE), est aussi présente dans les cardiomyocytes. Plusieurs études démontrent que STIM1 et le SOCE jouent un rôle important dans le développement de l’hypertrophie des cardiomyocytes. De plus, récemment, un nouveau rôle de STIM1 a commencé à émerger. STIM1 pourrait moduler l’expression de certains canaux calciques à la membrane plasmique en régulant leur trafic intracellulaire. Le but de l’étude était d’identifier des partenaires d’interaction de STIM1 dans l’optique de révéler le mécanisme par lequel STIM1 induit l’internalisation d’un canal calcique voltage-dépendant. Les protéines recueillies par le pull-down à partir des lysats de coeurs de rats avec une colonne d’affinité composée du domaine ERM de STIM1, ont été analysées en spectrométrie de masse. La protéine Muscle related coiled-coil (MURC), une protéine de la famille des Cavin, a été retenue comme partenaire d’interaction potentiel de STIM1. Comme elle est exprimée dans les cardiomyocytes et dans les cellules musculaires squelettiques, qui sont des cellules où la régulation de la signalisation calcique est primordiale pour le bon fonctionnement des tissus et qu’elle semble interagir avec STIM1, qui est un acteur important de la signalisation calcique, notre objectif s’est élargi et nous avons investigué sur l’implication de MURC dans la signalisation calcique en général. Nous avons donc confirmé par co-immunoprécipitation que le domaine ERM de STIM1 interagissait avec MURC. Puis, par des essais d’imagerie calcique, nous avons démontré que la surexpression de MURC pouvait provoquer différentes réponses dans différents types cellulaires en fonction de l’activation de la mobilisation calcique. En effet, nous avons observé une augmentation du SOCE qui est indépendante de la voie RhoA/ROCK dans les cellules HEK293T, une diminution de l’entrée de calcium médiée par un récepteur (ROCE) qui est pourrait être dépendante de la voie RhoA/ROCK dans les cellules T6.11 et une diminution de l’activation de RhoA de façon dépendante de l’activation du SOCE dans les cardiomyocytes HL-1. Nous avons aussi montré que MURC pouvait interagir à la membrane plasmique avec les protéines Orai1, qui sont les protéines formant les canaux CRAC (Ca2+ release-activated Ca2+) du SOCE et ce de façon dépendante de l’activation de STIM1. Enfin, les résultats de cette étude suggèrent que MURC est un partenaire d’interaction de STIM1 impliqué dans la signalisation calcique. En effet, MURC peut moduler l’activation de RhoA, ce qui pourrait induire l’internalisation de canaux calciques. De plus, son interaction avec STIM1 et Orai1 pourrait notamment faire un pont facilitant l’interaction entre STIM1 et Orai1 ce qui aurait pour effet d’augmenter le SOCE et possiblement contribuer à augmenter l’hypertrophie des cardiomyocytes.

Le développement tumoral requiert des « caractéristiques » moléculaires bien identifiées. En ce qui concerne le cancer de la prostate, il est bien connu qu’il se caractérise par une grande hétérogénéité avec en particulier un nombre important de cellules en quiescence ce qui se traduit notamment par une prolifération certes aberrante mais très lente associé à une résistance à l’apoptose induite par des chimiothérapies. En conséquence, une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires à l’origine du phénomène de résistance à l’apoptose et de la dérégulation de la prolifération est nécessaire. Dans ce contexte, nous avons mis en évidence le rôle déterminant des protéines ORAI1 et ORAI3 dans un remodelage de l’homéostasie calcique qui participe à l’émergence d’un phénotype cancéreux plus agressif. Nous avons découvert le mécanisme à l’origine de la formation d’un canal constitué des protéines ORAI1 et ORAI3 permis par : (1) la surexpression de la protéine ORAI3 et (2) des perturbations du microenvironnement tumoral au cours de la progression tumorale. En parallèle nous avons étudié les mécanismes d’action d’une nouvelle pro-drogue très prometteuse en cours d’évaluation clinique, le G-202® (Genspera, USA), et qui permet de cibler l’hétérogénéité tumorale. Nous avons mis en évidence un mécanisme de résistance au G-202® utilisé seul in vitro et in vivo sur des modèles murins (Brevet en cours de dépôt) et deuxièmement d’élaborer un nouveau type de thérapies combinées et ciblées augmentant considérablement l’efficacité de nombreux traitements chimiothérapeutiques actuels sur des cellules résistantes. / Tumor development requires clearly identified molecular "hallmarks". With regard to prostate cancer, it is well known that it is characterized by a heterogeneous phenotype with a large number of quiescent cells which results in a very slow but aberrant proliferation associated with a resistance to apoptosis induced by chemotherapy. Accordingly, a better understanding of the molecular mechanisms underlying resistance to the phenomenon of apoptosis and deregulation of proliferation is needed. In this context, we have highlighted the key role of ORAI1 and ORAI3 proteins in remodeling of calcium homeostasis involved in the emergence of a more aggressive cancer phenotype. We have discovered the mechanism behind the formation of a channel forming by ORAI1 and ORAI3 proteins permit by : (1) the overexpression of ORAI3 protein and (2) perturbation of the tumor microenvironment during tumor progression. In parallel we studied the mechanisms of action of a very promising new pro-drug undergoing clinical trial, the G-202® (Genspera, USA), which allows the targeting of tumor heterogeneity. We have identified a mechanism of resistance to G-202® alone in vitro and in vivo mouse models (patent pending) and secondly we have developed a new type of combined and target therapies increasing the efficiency of many current chemotherapeutic treatments.

La tumeur maligne primitive du foie la plus fréquente est le carcinome hépatocellulaire. Le développement des cellules tumorales hépatiques dépend d'un influx calcique dont la base moléculaire, dans le foie, est constituée de TRPC6, des STIM1 et 2, et de Orai1. Nous avons recherché si le développement de ces tumeurs était accompagné d'un changement du profil d'expression de ces protéines. Nous avons montré que le canal TRPC6 est absent des hépatocytes humains sains mais fortement exprimé dans les tumeurs hépatiques, les foyers d'expression de TRPC6 étant visibles uniquement dans les zones tumorales du foie. Le niveau d'expression de TRPC6 dépend de certains facteurs de croissance et cette expression est directement corrélée à l'amplitude de l'entrée de calcium et à la prolifération cellulaire des hépatomes humains. STIM1 et Orai1 sont aussi impliqués dans cette relation, l'inhibition de l'expression de TRPC6, STIM1 ou Orai1 entraînant une baisse de l'expression des cyclines D1 dans ces cellules. Inversement, le blocage du cycle cellulaire va entraîner, de manière réversible (<4heures), une importante réduction de l'entrée de calcium. Les cultures primaires d'hépatocytes humains nous ont permis de confirmer ces résultats, démontrant ainsi la relation étroite entre entrée calcique et prolifération cellulaire. Nos derniers résultats ont montré que la base moléculaire de cette entrée dépend du type cellulaire utilisé mais que Orai1 en est la pièce centrale. Ce travail de thèse a permis d'élargir les connaissances sur la composition du complexe moléculaire formant l'entrée calcique directement impliquée dans la prolifération cellulaire et le développement de tumeurs hépatiques. / Hepatocellular carcinoma is the most frequent primary liver tumor. Tumoral cell proliferation depends on calcium influx which molecular basis in human liver is formed of TRPC6, STIM1 and 2, and Orai1. We have investigated whether tumors' development in human livers was accompanied by a change in the pattern of expression of these proteins. We have shown that TRPC6 channel is absent in healthy human hepatocytes but strongly expressed in human liver tumors, and TRPC6 expression is only detectable in the tumor zones. TRPC6 expression level depends on growth factors, and this expression is directly correlated with the amplitude of the calcium entry and cell proliferation of human hepatoma cell line. STIM1 and Orai1 also play a major role in this process and inhibition of the expression of TRPC6, STIM1 or Orai1 causes a decrease in cyclin D1 expression in human hepatoma cell line. Conversely, cell cycle block results in a large decrease in calcium influx that quickly reversed in less than 4 hours after cell cycle release. Primary cultures of human hepatocytes allowed us to confirm these results, emphasizing the tight relation between calcium influx and cell proliferation. Our recent data strongly suggested that the molecular basis of this calcium entry varies from one cell type to another, with Orai1 as the core of this plasma membrane complex. In conclusion, this thesis has expanded the knowledge about the actors of calcium entry and their role in the proliferation of both liver cells and liver cancer development

Les variations de la concentration cytosolique de Ca[indice supérieur 2+] contrôlent divers processus biologiques tel la contraction, la division cellulaire et la transactivation de gènes. Chez les cellules non excitables, la stimulation de certains GPCRs (G protein coupled receptor) ou récepteurs tyrosine kinase mène à l'activation d'une phospholipase C qui produit de l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP[indice inférieur 3]). L'IP[indice inférieur 3] active un récepteur-canal au niveau du réticulum endoplasmique (RE) et permet une relâche de Ca[indice supérieur 2+] du RE. Il existe trois isoformes distinctes d'IP[indice inférieur 3]R (IP[indice inférieur 3]R-1 à -3) différemment exprimées dans les tissus. Dans ces travaux, nous avons étudié un mode de régulation de l'IP[indice inférieur 3]R-2 par la PKC, une kinase elle-même activée lors de la réponse calcique. Nous avons aussi vérifié l'implication de chaque isoforme d'IP[indice inférieur 3]R dans l'activité transcriptionnelle des facteurs de transcription sensibles au Ca[indice supérieur 2+] NFAT et CREB.Les cellules AR4-2J expriment principalement l'IP[indice inférieur 3]R-2 (86%), ce qui en fait un bon modèle d'étude pour les mécanismes de régulation de l'IP[indice inférieur 3]R-2. Dans la première étude, nous avons vérifié si la PKC influençait l'activité calcique de l'IP[indice inférieur 3]R-2. D'abord, nous avons montré que l'IP[indice inférieur 3]R-2 est majoritairement exprimé dans les cellules AR4-2J. Nous avons montré par phosphorylation in vitro et in cellulo que l'IP[indice inférieur 3]R-2 est phosphorylé par la PKC. Nous avons montré que le traitement par la PKC réduit la réponse calcique induite par l'IP[indice inférieur 3] sur des cellules perméabilisées. Finalement, nous avons démontré que la réponse calcique induite par le CCh ou l'EGF sur des cellules entières était réduite avec l'activation de la PKC. Ces résultats indiquent que l'IP[indice inférieur 3]R-2 est une autre cible de la PKC permettant de contrôler l'intensité de la réponse calcique. Dans la deuxième étude l'objectif était de déterminer l'implication des isoformes d'IP[indice inférieur 3]R sur l'activité des facteurs de transcription sensibles au Ca[indice supérieur 2+] NFAT et CREB. Par l'approche des gènes rapporteurs de l'activité de NFAT ou CREB, nous avons montré que NFAT était activé par la voie de la calcineurine et que CREB par les voies de CamKII et de la calcineurine dans les cellules HEK 293A. Nous avons démontré que l'invalidation de l'IP[indice inférieur 3]R-2 diminuait la réponse calcique induite par le CCh et que la costimulation avec le VIP pouvait la restaurer. Nous avons montré que l'activité transcriptionnelle de NFAT était affectée, contrairement à celle de CREB, par l'invalidation de l'IP[indice inférieur 3]R-2. Finalement, nous avons montré que l'IP[indice inférieur 3]R-2, et aussi l'IP[indice inférieur 3]R-1, semblent jouer un rôle secondaire, différent de celui de transporteur de Ca[indice supérieur 2+], dans le mécanisme d'activation de NFAT. Ces résultats laissent envisager que l'IP[indice inférieur 3]R serait impliqué dans la formation d'un complexe protéique facilitant l'activation de NFAT.

Résumé : La variation de la [Ca2+] intracellulaire participe à nombreux de processus biologiques. Les cellules eucaryotes expriment à la membrane plasmique une variété de canaux par lesquelles le calcium peut entrer. Dans les cellules non excitables, deux mécanismes principaux permettent l'entrée calcique; l'entrée capacitative de Ca2+ via Orai1 (SOCE) et l'entrée calcique activé par un récepteur (ROCE). Plusieurs protéines clés sont impliquées dans la régulation de ces voies d'entrée calcique, ainsi que dans l'homéostasie calcique. TRPC6 est un canal calcique impliquée dans l'entrée calcique dans les cellules à la suite d’une stimulation d’un récepteur hormonal. TRPC6 transloque à la membrane cellulaire et il y demeure jusqu'à ce que le stimulus soit retiré. Les mécanismes qui régulent le trafic et l'activation de TRPC6 sont cependant encore peu connus. Des découvertes récentes ont démontré qu'il y a un rôle potentiel de Rho kinase dans l'activité de TRPC6. Rho kinase est activée par la petite protéine G RhoA qui peut être activée par les protéines G hétérotrimériques Gα12 et Gα13. En plus de Gα12 et Gα13, les protéines de désensibilisation des GPCR β -arrestin 1 et / ou β-arrestin 2 peuvent aussi activer RhoA. Le but de notre étude est d'examiner la participation des protéines Gα12/13 et β-arrestin 1/ β-arrestin 2 dans l'activation de TRPC6 et de la protéine Orai1. Nous avons utilisé des ARN interférant (siRNA) spécifiques pour induire une réduction de l'expression de Gα12/13 ou β-arrestin 1/β-arrestin 2. La conséquence sur l’entrée de Ca2+ dans les cellules a été ensuite déterminée par imagerie calcique en temps réel suite à une stimulation par la vasopressine (AVP), thapsigargin ou carbachol. Nous avons donc identifié que dans des cellules A7r5, une lignée cellulaire de musculaires lisses vasculaires où le canal TRPC6 exprimé de manière endogène, la diminution de l’expression des protéines Gα12 ou Gα13 ne semble pas modifier l’entrée Ca2+ induit par l’AVP par rapport aux cellules témoins. D'autre part, la diminution de l’expression β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 dans des cellules HEK 293 ainsi que des cellules HEK 293 exprimant de façon stable TRPC6 (cellules T6.11) ont augmenté l’entrée de Ca2+ induite par thapsigargin, un activateur pharmacologique de SOCE. Des études de co-immunoprécipitation démontrent une interaction entre la β-arrestin 1 et STIM1, alors qu'aucune interaction n'a été observée entre les β-arrestin 1 et Orai1. Nous avons de plus montré à l'aide d'analyse en microscopie confocale que la diminution de l’expression β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 n’influence pas la quantité d’Orai1 à la périphérie cellulaire. Cependant, des résultats préliminaires indiquent que la diminution de l’expression β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 augmente la quantité de STIM1-YFP dans l'espace intracellulaire et diminue sa quantité à la périphérie cellulaire. En conclusion, nous avons montré que les β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 sont impliquées dans l'entrée capacitative de Ca2+ (SOCE) et contrôlent la quantité de STIM1 dans le réticulum endoplasmique. / Abstract : In an organism, intracellular [Ca2+] takes part in many biological processes. Eukaryotic cells express a variety of channels in the plasma membrane through which calcium can enter. In non-excitable cells, two main mechanisms allow calcium entry; the store-operated calcium entry via Orai1 (SOCE) and receptor-operated calcium entry (ROCE). Several key proteins are involved in the regulation of these calcium entry pathways as well as in calcium homeostasis. TRPC6 is a calcium channel implied in calcium entrance into the cells following hormonal stimulation and translocates to the plasma membrane. TRPC6 channel appear to the plasma membrane until the stimulus is present. Although, the mechanisms that regulate the trafficking and activation of TRPC6 are still little known. Recent findings have demonstrated that there is a potential role of Rho kinase in activity of TRPC6. Rho kinase is activated by the small G protein RhoA that itself can be activated by the heterotrimeric G proteins Gα12 and Gα13. In addition to Gα12 and Gα13 proteins, cytosolic GPCR desensitizing proteins β-arrestin 1 and/or β-arrestin 2 could also activate RhoA. The purpose of our study is to investigate the involvement of the proteins Gα12/13 and β-arrestin 1/β-arrestin 2 in the activation of TRPC6 and Orai1 protein. We used siRNA specific to Gα12/13 or β-arrestin 1/β-arrestin 2 to knockdown their endogenous expression. Then, calcium imaging in real time was performed in order to see the quantity of calcium entered into the cell following stimulation by vasopressin (AVP), thapsigargin, or carbachol. We hence identified that in A7r5 cell, vascular smooth muscle cell where TRPC6 channel expressed endogenously; reduced expression of Gα12 or Gα13 proteins does not seem to modify the AVP-induced Ca2+ entry compared to control cells. On the other hand, calcium imaging experiment in knocked down β-arrestin 1 or β-arrestin 2 in HEK 293 cells as well as HEK 293 cells stably transfected with TRPC6 (T6.11 cells) resulted in an increased thapsigargin-induced calcium entry. The co-immunoprecipitation studies demonstrate an interaction between β-arrestin 1 and STIM1, a calcium sensor in SOCE influx, while no interaction was observed between β-arrestin 1 and Orai1.We moreover showed by confocal microscopy that reduced expression of β-arrestin 1/ β-arrestin 2 does not influence the quantity of Orai1 at the cell periphery. Preliminary results showed that reduced expression of β-arrestin 1 or β-arrestin 2 increases the quantity of STIM1-YFP in the intracellular space and less it’s in peri-membrane space. In conclusion, we showed that β-arrestin 1 or β-arrestin 2 are involved in the store-operated calcium entry (SOCE) and control the quantity of STIM1 in the endoplasmic reticulum.