Intracellular Ca[superscript 2+] is involved in many biological processes in all cells throughout the organism. In non excitable cells, TRPC proteins located at the plasma membrane are calcium channels involved in calcium entry. TRPC6 is particularly studied since its implication in many pathologies, as FSGS, IPAH and some cancers. Its activation and regulation modes and mechanisms are yet fully understood, in spite of the intense research. The purpose of the present study is to investigate the regulation of TRPC6 by phosphorylation. For this, we used metabolic labeling and videomicroscopy techniques in order to evaluate direct TRPC6 phosphorylation and activity. We hence identified a basal as well as a PKC-dependent phosphorylation on TRPC6. PKC is known to modulate the activity of TRPC1, TRPC3, TRPC4 and TRPC5. Recent studies also showed that TRPC6 is inhibited by PKC. Our first study confirms that activation of PKC leads to TRPC6 activity inhibition. When using GF1, a specific PKC inhibitor, calcium entry in TRPC6-expressing cells is potentiated. We moreover show that TRPC6 is phosphorylated following PKC activation. We identify the serine at position 448 as being phosphorylated and responsible for the PKC-mediated inhibition. The S448A mutant of TRPC6 is no longer phosphorylated nor inhibited by PKC. This first study thus demonstrates that PKC-dependent phosphorylation of serine 448 of TRPC6 mediates channel inhibition. In the second study, we investigate the basal phosphorylation of TRPC6, which was observed in the first study. Mass spectrometry analysis identified serine 814 as being potentially phosphorylated, a fact confirmed by metabolic labeling assays performed on the S814A mutant of TRPC6. We show that the S814A mutation does not affect TRPC6 activity. Even though the S814 is in a consensus CK2 phosphorylation sequence, we also show that CK2 is not involved in the phosphorylation or the regulation of TRPC6. These studies thus led to the identification of two new phosphorylations on TRPC6, serine 448 and 814. We also characterized the mechanism by which PKC regulates TRPC6.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le cancer de la prostate évolue progressivement vers l'androgéno-indépendance, stade incurable pour lequel la recherche biomédicale tente de déterminer de nouvelles cibles thérapeutiques. Cette évolution est marquée par une différenciation neuroendocrine des cellules prostatiques qui s'accompagne d'une surexpression de canaux calciques voltage-dépendants de type T (Cav3.2) responsable d'une altération de l'homéostasie calcique intracellulaire. L'objectif de cette thèse était donc de déterminer l'implication des Cav3.2 dans les cellules cancéreuses prostatiques humaines, et notamment dans les cellules neuroendocrines. Nos résultats montrent que, dans ces cellules non-excitables, les Cav3.2 participent à l'homéostasie calcique en permettant une entrée basale de calcium au potentiel de repos sans contribuer à une entrée capacitive de calcium provoquée par la vidange des réserves intracellulaires de calcium. De plus, ces canaux interviennent dans la sécrétion de la Phosphatase Acide Prostatique, un marqueur des cellules épithéliales prostatiques, dans les cellules neuroendocrines. Par ailleurs, nous montrons l'existence d'un couplage fonctionnel entre les Cav3.2 et les canaux de type BK qui constituent les principales conductances potassiques voltage-dépendantes des cellules prostatiques. Enfin, nos travaux mettent en évidence que ce couplage entre ces deux canaux participe à la prolifération cellulaire des cellules cancéreuses prostatiques. En conclusion, ce travail de thèse contribue à élargir les connaissances sur les canaux calciques de type T, Cav3.2 en particulier, et leur rôle au sein des cellules prostatiques cancéreuses humaines / Prostate cancer inevitably evolves towards an incurable androgen-independent stage for which biomedical research attempts to identity new therapeutic targets. This progression is characterized by a neuroendocrine differentiation of prostate cells accompanied by an overexpression of voltage-dependent T-type calcium channels (Cav3.2), responsible for an alteration of intracellular calcium homeostasis. The aim of this PhD thesis was to determine the involvement of Cav3.2 in human prostate cancer cells, mainly in neuroendocrine cells. Our results show that, in these non-excitable cells, Cav3.2 channels participate to basal calcium homeostasis by promoting calcium entry at resting membrane potential without contributing to the capacitative calcium entry triggered by calcium depletion from endoplasmic reticulum stores. ln addition, these channels are involved in the secretion of Prostatic Acid Phosphatase, a marker of prostatic epithelial cells, in neuroendocrine cells. Furthermore, we show that Cav3.2 channels are functionaly coupled to BK channels which constitute the main voltage-dependent potassium conductances in prostate cells. Finally, our work demonstrates that this coupling between both channels regulates prostate cancer cell proliferation. As a conclusion, this work contributes to the understanding of the role of Cav3.2 T-type calcium channels in human prostate cancer cells.

La signalisation calcique est un mécanisme physiologique essentiel pour l’homéostasie cellulaire, et en particulier pour les cellules immunitaires telles que les lymphocytes B (LB). Chez l’homme, la caractérisation des molécules impliquées dans la signalisation calcique des LB est encore restreinte. Nous avons donc choisi d’étudier les molécules STIM1, STIM2, Orai1 et TRPC1 afin de rendre compte des modifications de la signalisation calcique observées dans deux modèles physiopathologiques : le Lupus Erythémateux Systémique (LES) et la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC). Pour les LB de LES, par rapport à des LB de témoins, ce travail a permis de montrer que la surexpression de la molécule STIM1 dans les LB de LES, surtout au stade des LB transitionnels, était associée avec un influx constitutif et extracellulaire de calcium et que cet influx était responsable d’une phosphorylation modérée de la MAPK Erk1/2 dans les cellules au repos. Cependant, cet effet positif est contrebalancé par un défaut de l’influx SOCE (strore operated calcium entry) et d’un défaut d’activation de la phosphorylation de la MAPK Erk après stimulation du récepteur à l’antigène des LB (BCR). Les effets positifs et négatifs observés sur la phosphorylation d.Erk1/2 sont directement attribuables au niveau d’expression de STIM1 comme nous l’avons démontré en sur-exprimant STIM1 dans des LB de témoins (vecteur pSTIM1-STIM1) ou en ayant recours à un siRNA spécifique de STIM1 dans les LB de LES. Le défaut d’activité régulatrice des LB de LES sur la prolifération des LT dans un modèle de co-culture autologue LT/LB en présence de CpG (activation du TLR9 des LB), et d’anticorps anti-CD3/CD28 (activation des LT) est levé en inhibant l’expression de STIM1 dans ces cellules ce qui permet de restaurer la production d.IL-10 par les LB de LES et la génération de LT régulateurs. Le défaut d’activation de la voie Erk/DNMT1/méthylation de l’ADN dans les LB de LES semble également contrôlée par le niveau d’expression de la molécule STIM1.Pour les LB CD5+ de LLC, l’analyse des partenaires calciques nous a permis de distinguer deux groupes de patients : un premier groupe qui exprime le complexe membranaire STIM1/TRPC1/Orai1 et un second groupe qui n’exprime qu’Orai1. La présence du complexe membranaire STIM1/TRPC1/Orai1 est associée avec un influx constitutif de calcium, la phosphorylation d’Erk1/2, et un défaut d’activation du signal SOCE après stimulation du BCR. Le rôle de la molécule CD5 sur l’influx constitutif des LLC du groupe I a été démontré en utilisant des siRNA spécifiques pourCD5 et en analysant la lignée B humaine Jok-1 transfectée avec CD5. Enfin, l’utilisation d’un anticorps anti-STIM1 est capable d’induire l’apoptose in vitro des LB de LLC du groupe I, alors que l’anticorps anti-CD20, rituximab, n’est efficace que sur les LLC du groupe II.En conclusion, cette étude ouvre de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques en auto-immunité dans le LES et en cancérologie dans la LLC. / Calcium signaling is a central mechanism for cellular homeostasis, including for immune cells such as B lymphocytes (B cells). In human, the characterization of the molecules involved in B cell calcium signalisation is still limited and we have focused our study on STIM1, STIM2, Orai1 and TRPC1. In order to better understanding the role of these molecules, two pathologies, with known calcium dysregulations, were chosen : Systemic Lupus Erythematosus (SLE) and Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL).For SLE B cells, compared to healthy control (HC) B cells, this work has established that overexpression of the STIM1 molecule characterizes SLE B cells, especially at the transitional B cell stage. STIM1 overexpression in SLE B cells was associated with a constitutive extracellular calcium influx that in turn contributes to the moderate phosphorylation of the MAPK Erk1/2. However, this positive effect is counterbalanced by a defective strore operated calcium entry (SOCE), and a defective Erk phosphorylation after B cell receptor (BCR) activation. The positive and negative effects on the MAPK Erk1/2 in SLE B cells are directly linked to level of STIM1 as demonstrated in HC B cells transfected with a STIM1 vector (pSTIM1-STIM1), or by using a specific siRNA to STIM1 (siSTIM1) in SLE B cells.The incapacity of SLE B cells to regulate T cell proliferation in an autologous co-culture T/B cell model is reversed by using siSTIM1 in SLE B cells. In this model, using siSTIM1 in SLE B cells also restores the production of IL-10 by B cells, and the generation of regulatory T cells. The defective Erk/DNMT1/DNA methylation pathway in SLE B cells is suspected to be under the control of STIM1 overexpression.For CD5+ CLL B cells, analysis of calcium partners has enabled us to distinguish two groups of patients: one group that expresses at the plasma membrane the complex STIM1/TRPC1/Orai1 and a second group that expresses onlyOrai1. The presence of the membrane complex STIM1/TRPC1/Orai1 in CLL group I is associated with a constitutive extracellular calcium influx, the basal phosphorylation of Erk1/2, and a defaut to mobilize SOCE upon BCR engagement. In the CLL group I patients, a role of CD5 on the constitutive extracellular calcium influx was shown using siRNA specific to CD5 and using the transfected CD5 expressing B cell line Jok-1. Finally, the in vitro use of an anti-STIM1 antibody is able to induce apoptosis in CLL B cells from group I patients, while the anti-CD20 antibody (rituxan) was only effective in the CLL B cells from group II patients.In conclusion, this study opens new diagnostic and therapeutic perspectives in autoimmunity and in cancer.

Le paracétamol est l'antalgique le plus consommé au monde et pourtant son mécanisme d'action n'est toujours pas élucidé. Longtemps reconnu comme un produit proche des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) son profil est aujourd'hui reconsidéré grâce aux travaux effectués depuis une dizaine d'années. Il est désormais admis que le paracétamol est un antalgique d'action prioritairement cérébrale et l'impact sur les cyclo-oxygénases, cibles traditionnelles des AINS, ne représente plus la base de son mécanisme d'action. Nos travaux de thèse montrent que l'action antalgique du paracétamol est perdue chez des animaux dont le canal Cav3.2 a été invalidé, ceci dans divers contextes expérimentaux. Ainsi ces canaux semblent être indispensables à l'effet antalgique du paracétamol. Nous avons également démontré le site de cette implication. En effet, seuls les canaux Cav3.2 cérébraux sont impliqués dans l'effet du paracétamol, ce qui rejoint les résultats précédents qui présentent le paracétamol comme un antalgique d'action centrale. Au niveau cérébral nous avons aussi démontré que les canaux Cav3.2 agissaient de concert avec deux acteurs primordiaux pour l'effet du paracétamol : l'AM404, son métabolite actif et les récepteurs TRPV1. La finalité de cette relation est l'inhibition des canaux Cav3.2 qui induit l'effet antalgique du paracétamol. Parallèlement, nous avons démontré pour la première fois que l'inhibition des canaux Cav3.2 cérébraux induisait une antalgie. Ceci confirme l'implication tonique de ces canaux supra-spinaux dans la perception douloureuse. Enfin, nous avons également démontré que les canaux Cav3.2 étaient fortement impliqués dans la douleur de type inflammatoire et, de manière plus surprenante et intéressante, dans les processus inflammatoires associés (développement oedémateux et production des médiateurs pro-inflammatoires). En conformité avec ces résultats, nous avons démontré que l'éthosuximide (un bloqueur des canaux Cav3.2) était efficace dans le traitement des douleurs inflammatoires et de l'inflammation ainsi que sur leurs comorbidités associées (anxiété et dépression). En conclusion, la confirmation de l'implication des canaux Cav3.2 dans l'effet du paracétamol et dans la douleur inflammatoire ouvre une voie nouvelle dans la compréhension du mécanisme d'action de cet antalgique et dans la conception et le développement de nouveaux antalgiques, ciblant ces canaux. Cette perspective est renforcée par les démonstrations déjà faites du rôle de ces canaux dans la physiopathologie des douleurs neuropathiques. De plus et de façon intéressante, l'éthosuximide, un antiépileptique utilisé chez l'homme et inhibiteur des canaux Cav3, permet d'envisager la réalisation d'une étude clinique pilote sur l'évaluation de son effet antalgique. Nous proposons le protocole de cette étude, preuve de concept, réalisée dans un premier temps chez des patients atteints de douleurs neuropathiques. / Acetaminophen is the most analgesic consumed worldwide, but its mechanism of action is still not understood. Long recognized as non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), its profile is now reconsidered thanks to the work done over the last ten years. It is now accepted that acetaminophen is an analgesic with a central action and the impact on cyclooxygenase, traditional targets of NSAIDs, is no longer the basis of its mechanism of action. This work show that the analgesic effect of acetaminophen is lost in animals whose Cav3.2 channel has been invalidated, this in various experimental contexts. Thus, these channels appear to be essential for the analgesic effect of acetaminophen. We also demonstrated the nature of that involvement. Indeed, only the brain Cav3.2 channels are involved in the effect of acetaminophen, which joined the previous results showing that acetaminophen is a centrally acting analgesic. In the brain, we also demonstrated that Cav3.2 channels acting in concert with two crucial actors to the effect of acetaminophen: AM404, its active metabolite, and TRPV1 receptors. The purpose of this relationship is the inhibition of Cav3.2 channels that induces analgesic effect of acetaminophen. In parallel, we have demonstrated for the first time that inhibition of brain Cav3.2 channels induced analgesia. This confirms the tonic involvement of these channels in supraspinal pain perception. Finally, we also demonstrated that Cav3.2 channels were heavily involved in the inflammatory pain and, more surprising and interesting, in inflammatory processes associated (edema development and production of pro-inflammatory mediators). Related to these results, we demonstrated that ethosuximide (a Cav3.2 channel blocker) was effective in the treatment of inflammatory pain and inflammation as well as their associated comorbidities (anxiety and depression). In conclusion, the confirmation of the interaction of Cav3.2 channels in the effect of acetaminophen and pain perception opens a new path in understanding the mechanism of action of acetaminophen and in the design and development of new analgesics targeting Cav3.2 channels. This perspective is reinforced by the demonstrations previously done of the role of these channels in the pathophysiology of neuropathic pain. More and interestingly, ethosuximide, an antiepileptic drug used in humans and Cav3 channels inhibitor, allows to consider the realization of a pilot clinical study on the evaluation its antalgic effect. We propose the protocol of this study, proof of concept, performed in a first time in patients of neuropathic pain.

Dans le cervelet, l’interaction entre l’activité des fibres parallèles (FPs) et celle de la fibre grimpante (FG), les deux principaux inputs excitateurs des neurones de Purkinje (NPs), engendre des signaux calciques supra-linéaires procurant des informations sur leur activité concomitante. Ce phénomène déclenche des mécanismes synaptiques qui induisent la dépression à court- ou à long-terme des synapses FP-NPs. L’activation des FPs génère des signaux calciques locaux confinés aux épines activées tandis que l’activation de la FG génère une dépolarisation qui se propage passivement dans les dendrites. Cette dépolarisation transitoire qui n’est pas locale joue un rôle important dans la régulation de la signalisation locale des FPs et leur plasticité. L’étude menée durant ma thèse s’est focalisée sur deux principaux points : les canaux dendritiques des NPs activés par la dépolarisation transitoire générée par l’activation de la FG et les mécanismes responsables de la génération des signaux dendritiques supra-linéaires associés à l’activité concomitante des FPs et de la FG. Les résultats reportés ici ont été obtenus en utilisant des méthodes optiques récemment développés.Nous avons caractérisé le comportement des canaux ioniques dendritiques qui sont activés par la dépolarisation dendritique générés par l’activation de la FG. Nous avons découvert que deux différents groupes de canaux ioniques sont sélectivement activés selon le potentiel membranaire initial. En effet, quand les dendrites sont hyperpolarisées, les CF-EPSPs activent principalement des canaux calciques voltage-dépendant (CCVDs) de type T, des canaux SK et des canaux potassiques voltage-dépendant (CPVDs) de type A. Ces derniers maintiennent le potentiel membranaire en dessous de ~0 mV. En revanche, quand les dendrites sont dépolarisées, les CCVDs de type T et les CPVDs de type A s’inactivent complètement et les CF-EPSPs activent des CCVDs de type P/Q, des CPVDs et des canaux BK. L’activation de cet ensemble de canaux déclenche des spikes calciques. Notamment, nous avons établi l’importance des CPVDs de type A dans le control du deuxième ensemble de canaux. En effet, ils limitent l’activation des CCVDs de type P/Q et les canaux potassiques associés empêchant le déclenchement des spikes calciques.Nous avons démontré que l’activation occurrente de la FG et des FPs induit deux différents types de signaux calciques supra-linéaires. L’induction de l’un ou de l’autre dépend du temps entre l’activation des deux inputs, qui est aussi un principal déterminant des mécanismes impliqués dans la génération des ces signaux calciques. Nous avons trouvé que quand les CF-EPSPs se produisent à de courts délais après la fin du burst des FPs, les signaux calciques supra-linéaires associés sont indépendant de l’activation des mGluR1 et sont générés par l’effet combiné de deux mécanismes : l’augmentation du flux calcique via les CCVD de type P/Q activés par la dépolarisation membranaire médiée par l’activation de FPs inactivant les CPVDs de type A; et la saturation transitoire des buffers calciques endogènes durant le burst des PF-EPSPs amplifiant les concentrations du Ca2+ libre. Quand les CF-EPSPs se produisent à de longs délais après la fin du burst des PF-EPSPs, les signaux calciques supra-linéaires associés dépendent de l’activation des mGluR1 et n’impliquent aucun des mécanismes précédents. Dans ce cas, nous avons démontré que les signaux calciques supra-linéaires sont corrélés avec l’augmentation du flux calcique via les conductances cationiques associées à l’activation des mGluR1.Les résultats reportés ici ont avancé notre compréhension sur la génération des signaux calciques supra-linéaires associés à l’activité concomitante des PFs et de la FGs ainsi les mécanismes qui y sont impliqués. Néanmoins, nous n’avons pas pu procurer une réponse définitive sur la nature du flux calcique médiant les signaux calciques supra-linéaires dépendant de l’activation des mGluR1s. / In the cerebellum, the interplay between PFs and CF inputs generates supralinear Ca2+ signals that provide the information on their concomitant occurrance. These phenomena trigger both short- and long-term depression at PF-PN synapses associated with motor learning and coordination, i.e. the primary functions of the cerebellum. While activation of PFs elicits local Ca2+ transients that are confined to activated spines, the activation of the CF generates a large depolarization that spreads passively into the dendrites. The CF-mediated transient dendritic depolarization, not localized, plays a fundamental role in dendritic integration and in regulating local PF signals and their plasticity at distal sites. The study carried out in my thesis addressed two crucial questions of this problem: the dendritic ion channels activated by the CF-mediated dendritic depolarization at different initial Vm and the mechanisms underlying dendritic supralinear Ca2+ signals associated with concomitant PF and CF activity. The results reported here were obtained using recent optical methods of Vm imaging and ultrafast Ca2+ imaging with low affinity Ca2+ and high affinity Ca2+ indicators combined with pharmacological analysis.During the first part of my work, I characterized the behavior of the dendritic Ca2+ and K+ channels activated by CF-EPSPs at different initial dendritic Vm, using optical measurements of Vm and Ca2+ transients. We found that two different sets of ion channels are selectively activated at different states. When the dendrite is hyperpolarized, CF-EPSPs mainly activate T-type voltage-gated Ca2+ channels (VGCCs), SK channels and A-type voltage-gated Ca2+ channels (VGKCs) that limit the transient Vm below ~0 mV. When in contrast the dendrite is depolarized, T-type VGCCs and A-type VGKCs are inactivated and CF-EPSPs activate P/Q-type VGCCs, high-voltage activated VGKCs and BK channels, initiating Ca2+ spikes. We demonstrated that A-type VGKCs play a crucial role in controlling the second set of channels. Indeed, these channels limit the activation of P/Q-type VGCCs and associated K+ channels, preventing Ca2+ spikes.During the second part of my work, we demonstrated that the concomitant activation of PF and CF triggers two different types of supralinear Ca2+ signals. The activation of one or the other path depends on the delay between the activation of the two inputs which is the crucial discriminator of the mechanisms involved in the generation of supralinear Ca2+ signals. We found that when CF-EPSPs occur near the end of a burst of PFs, the associated supralinear Ca2+ transients are independent of the activation of mGluR1 and are produced by a combined effect of two mechanisms: the increased Ca2+ influx through P/Q-type VGCCs enabled by PF-depolarization inactivating A-type VGKCs; and the transient saturation of endogenous Ca2+ buffers during the PF-EPSP burst amplifying free Ca2+ concentration. When CF-EPSPs occur at longer delays after the end of the PF burst, the associated supralinear Ca2+ transients are mGluR1-dependent and do not involve the mechanisms underlying the generation of mGluR1-independent supralinear Ca2+ transients. Instead, an entirely different mechanism is recruited. We found that, the supralinear Ca2+ transients were correlated with an increase in mGluR1-dependent Ca2+ influx via the slow mGluR1-activated cation conductance.The results reported here advance our understanding of the generation of supralinear Ca2+ transients associated with the concomitant PF and CF activity with respect to the potential molecular mechanisms that are involved. Nevertheless, we were not able to provide a definitive answer on the nature of the Ca2+ influx mediating mGluR1-depedent supralinear Ca2+ signals. This issue must be further explored in future experiments.

L'endothélium constitue un véritable organe qui sécrète de nombreuses substances vasoactives régissant des fonctions cardiovasculaires vitales telles que le tonus et la croissance vasculaires. Ce tissu requiert la polyvalence de la signalisation calcique puisque plusieurs de ses fonctions dépendent de la modulation de la concentration intracellulaire de Ca[indice supérieur 2+].L'un des moyens utilisés par les cellules endothéliales pour assurer une réponse calcique efficace et spécifique est la propagation des signaux sous forme de vagues. Dans ce travail, nous avons décortiqué les mécanismes de mobilisation du Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire menant à la propagation de vagues de Ca[indice supérieur 2+]. Nous avons recueilli des données qui aideront à mieux comprendre à la fois l'organisation et la propagation de vagues de Ca[indice supérieur 2+] dans les cellules endothéliales d'aorte de boeuf (BAEC). Nous montrons par vidéomicroscopie, que la stimulation des BAEC avec l'ATP ou avec la bradykinine (BIC) induit une réponse calcique oscillatoire finement régulée dans le temps et dans l'espace. En fait, le Ca[indice supérieur 2+] se propage d'une extrémité à l'autre de la cellule sous la forme d'une vague qui se produit en présence ou en absence de Ca[indice supérieur 2+] extracellulaire. Bien que les vagues de Ca[indice supérieur 2+] soient initiées à un endroit très précis près de la membrane plasmique, les cavéoles ne sont pas essentielles à leur propagation dans les BAEC, contrairement à ce qui a été observé dans certains autres types cellulaires. Toutefois, la dépolymérisation des microfilaments avec la latrunculine B et des microtubules avec la colchicine empêche la propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+]. Dans ces conditions, les BAEC présentent plutôt une augmentation calcique uniforme dans toute la cellule. Ces résultats suggèrent que, dans les BAEC, les cavéoles ne sont pas impliquées dans l'organisation de la réponse calcique sous forme de vague, mais que l'organisation du cytosquelette est essentielle. Nous montrons aussi que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] est constante d'un bout à l'autre d'une BAEC, ce qui est incompatible avec un mécanisme impliquant uniquement la diffusion de l'IP[indice inférieur 3] ou du Ca[indice supérieur 2+]. Nous montrons également que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] dépend de l'intensité de la stimulation et aussi de l'état fonctionnel de l'IP[indice inférieur 3]R qui peut être modulé par des kinases endogènes comme la PKA, la PKC et mTOR. Enfin, nous montrons que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] n'est pas directement reliée à l'amplitude de la relâche de Ca[indice supérieur 2+]. La vitesse de propagation des vagues de Ca[indice supérieur 2+] est un paramètre relativement nouveau dans le domaine de la signalisation calcique intracellulaire. Il reste à définir jusqu'à quel point ce paramètre peut être utile dans l'interprétation des différentes activités cellulaires.

Les neurones GABAergiques sont une composante majeure des réseaux neuronaux corticaux. Au cours du développement, les neurones GABAergiques pionniers générés aux stades les plus précoces de l’embryogénèse forment une sous-population de neurones « hubs ». Cependant, leurs propriétés et leurs fonctions à l'âge adulte restent inconnus. En combinant différentes techniques, nous montrons que ces neurones pionniers ont également une fonction « hub » dans la région CA1 en développement in vitro et qu’ils maintiennent une forte connectivité fonctionnelle pendant les périodes de veille calme chez la souris adulte in vivo. Ces neurones, peu actifs de façon spontanée chez l’adulte, sont préférentiellement recrutés pendant les activités calciques synchrones souvent associées aux oscillations de type « SWRs ». Ceci est compatible avec leur faible excitabilité intrinsèque, révélée par des enregistrements en courant-imposé. L’étude des connexions synaptiques afférentes des neurones pionniers de CA1 adulte, par optogénétique, révèle un schéma de connectivité remarquable avec des entrées synaptiques GABAergiques issues du septum et la quasi-absence d’entrées thalamiques. Localement, ces neurones reçoivent moins de courants postsynaptiques GABAergiques, témoignant d’une intégration différentielle dans le réseau GABAergique inhibiteur. Enfin, nous montrons qu’une majorité significative de ces neurones pionniers appartiennent à la famille des neurones à projection longue distance. En conclusion, nous montrons que les neurones GABAergiques pionniers sont prédéterminés à occuper une place remarquable dans l’organisation fonctionnelle et structurale de l’hippocampe tout au long de leur vie. / The remarkable diversity of cortical GABAergic neurons is rooted, at least in part, in their embryonic origins. Adding to the spatial control of interneuron specification is a temporal schedule that has significant impact on their fate. In the CA3 region of the hippocampus, GABAergic cells born the earliest (ebGABA) form a sparse subpopulation acting as ‘hubs’ during development and surviving until adulthood. However, their properties and function in adulthood remain elusive. Using a combination of techniques, we demonstrate that ebGABA neurons also operate as “hubs” in the developing CA1 region in vitro and that they seem to maintain such remarkable functional connectivity into adulthood as observed during quiet rest in vivo. EbGABA display a lower spontaneous activity rate, as expected from their lower intrinsic excitability and are preferentially recruited during the synchronous calcium events previously shown to be associated with SWRs. EbGABA also display a remarkable synaptic connectivity scheme as they receive long-range GABAergic septal inputs but are almost excluded from thalamic afferents. Locally, they receive fewer spontaneous inhibitory postsynaptic currents, indicating a particular integration into local GABAergic circuits. Moreover, using combinatorial immunohistochemistry, we have shown that a majority of these ebGABA neurons are long-range projection GABAergic neurons. We conclude that, ebGABA cells are predetermined to become exceptional nodes in the functional and structural organization of the hippocampus, throughout their lifetime.

Le rôle de la composante vasculaire est de plus en plus évoqué dans la pathogénie des atteintes mnésiques et des démences (vasculaire ou Alzheimer). Dans ce contexte, nous avons étudié les aspects épidémiologiques, physiopathologiques, génétiques et thérapeutiques de la relation entre les troubles cognitifs et l'hypertension artérielle ou les marqueurs du vieillissement artériel chez des sujets âgés de 60 à 85 ans hypertendus présentant une plainte mnésique subjective (ADELAHYDE) et chez des sujets institutionnalisés âgés de plus de 80 ans suivis sur un an (PARTAGE), ainsi que dans une population âgée de plus de 60 ans, en bon état général, sans démence et ayant bénéficié d'un bilan systématique de santé (Bilan Senior). Nos résultats portant sur ces 3 populations indiquent clairement que chez le sujet âgé, l'évaluation des marqueurs du vieillissement artériel permet de définir les sujets à plus haut risque de déclin cognitif, alors que la valeur prédictive de la pression artérielle (PA) sur le déclin cognitif ne semble pas être significative. Nous avons également montré que chez les personnes âgées hypertendues traitées de l'étude ADELAHYDE, l'utilisation d'antagonistes calciques était associée à de meilleures performances cognitives, indépendamment du niveau de la PA et de l'état vasculaire. Ceci suggère un effet protecteur spécifique de cette classe pharmacologique sur le déclin cognitif. Par ailleurs, nous n'avons pas pu identifier de facteur génétique associé aux fonctions cognitives. / The role of the vascular alterations in the pathogenesis of cognitive impairment and dementia (vascular or Alzheimer) is increasingly recognized. In this context, we studied the epidemiological, physiological, genetic and therapeutic aspects of the relationship between high blood pressure, markers of arterial aging and cognitive impairment in elderly (aged 60-85 years) hypertensive patients with subjective memory complaints (ADELAHYDE study) and in institutionalized elderly subjects (aged >= 80 years) during one year follow-up (PARTAGE study), as well as in an elderly population (aged >= 60 years) with good general health and without dementia (Senior examination study). Our results on these three populations show that markers of arterial aging identified subjects at higher risk for cognitive decline, while blood pressure alone did not appear to have a significant predictive value. We also showed that in elderly hypertensive patients (ADELAHYDE study), treatment with calcium-channel blockers was associated with better cognitive performance, independently of blood pressure level and macrovascular or microvascular alteratios. This suggests a specific neuroprotective effect of channel blockers class in the elderly population. Lastly, we could not identify genetic factors associated with cognitive function.

Caenorhabditis elegans est un organisme modèle bien adapté à l'analyse du fonctionnement de son réseau de neurones, de l'intégration des informations sensorielles qu'il reçoit à l'élaboration d'une réponse comportementale. Au cours de cette thèse, je me suis intéressée à l'étude de quelques paramètres cellulaires, moléculaires et environnementaux de la stratégie locomotrice de ce nématode. J'ai développé une méthode originale d'analyse quantitative de l'alternance des phases d'activité de C. elegans en présence de bactéries. J'ai montré que la phase inactive est induite par la perception interne de bactéries nutritives alors que la phase active est favorisée par la perception chemosensorielle. Ce comportement bimodal est aussi contrôlé par la concentration en nourriture de l'environnement et est modulé par son état de satiété. On observe en effet une transition d'un état constamment actif à un comportement majoritairement inactif en une décade de concentrations en bactéries. J'ai également montré que ce comportement est régulé par les voies de signalisation de la sérotonine, de l'insuline et des TGF-beta. J'ai par ailleurs développé un nouveau système d'imagerie permettant l'enregistrement simultané de l'activité calcique de neurones uniques et du comportement de vers se déplaçant librement en conditions standard de laboratoire. J'ai pu montrer que les mouvements de recul spontanés de C. elegans reflètent précisément l'activité calcique des neurones de commande AVA. Par ailleurs, j'ai pu détecter des pics d'activité calcique spontanés des neurones mécanosensoriels PLM lors du déplacement libre du ver corrélés à de courtes phases d'accélération de l'animal.