Ces dernières décennies ont mis à jour une implication pathologique nouvelle del’aldostérone, via le récepteur aux minéralocorticoïdes (RM) dans le coeur. L’ensemble desdonnées issues des études expérimentales et des essais cliniques suggère une association délétèreentre l’aldostérone et la survenue d’arythmies. L’utilisation d’antagonistes du RM prévient cesarythmies. Cependant, les voies de signalisations, comme les mécanismes moléculaires soustendantces effets bénéfiques du blocage des RM demeurent incertains. Nous avons accumulésdes preuves d’une modulation de la signalisation calcique dans le cardiomyocyte, et en particulierde l’influx calcique (Ca2+) au travers du canal Ca2+ de type L (LTCC). Celui-Ci pourrait être unecible primaire de l’aldostérone et du RM dans les cardiomyocytes ventriculaires. Toutefois, lesmécanismes par lesquels l’aldostérone et le RM régulent l’expression du LTCC restent à définir.Au cours de ces travaux menés sur cardiomyocytes de rats nouveau-Nés, nous avonsétudiés les évènements moléculaires par lesquels l’aldostérone exerce ses effets sur le CaV1.2,qui correspond à la sous-Unité principale du LTCC formant le pore du canal ; cette protéine estcodée par le CACNA1C. Par microscopie confocale, nous avons suivi en temps réel le traffickingnucléo-Cytoplasmique du RM couplé à la GFP en réponse à l’aldostérone, démontrant ainsi queles RM cardiaques sont fonctionnels. Le traitement durant 24 heures des cardiomyocytes avec del’aldostérone montre une augmentation dose-Dépendante des protéines et de l’ARN messager duCaV1.2. L’utilisation de la technique du gène rapporteur de la luciférase permet l’analyse del’activité du promoteur du CaCNA1C. Celui-Ci montre une activité transcriptionnelle dose ettemps dépendante en réponse à l’aldostérone. De plus, ces effets sont dépendant des RM carinhibés en présence de RU28318, un antagoniste sélectif du RM, ou par l’utilisation de siRNAdirigés contre le RM. L’analyse in silico de la séquence du promoteur du CaCNA1C nous a permisd’identifier cinq séquences putatives correspondant à des éléments de réponse auxglucocorticoïdes (GRE). La mutation du site le plus lointain du site d’initiation de la transcriptionne révèle aucun changement dans les réponses transcriptionnelles induites par un RM humainconstitutivement actif (hMRΔ5,6) ou dans les réponses doses-Dépendantes de l’aldostérone ou dela déxaméthasone, un glucocorticoïde de synthèse. La mutation des trois sites GRE putatifssuivants provoque une diminution des réponses au hMRΔ5,6 comme à l’aldostérone, alors que lesréponses à la déxaméthasone sont soit inchangées, soit augmentées. En contraste, la mutation dusite le plus proximal du promoteur augmente de façon importante l’activité transcriptionnelle dupromoteur en réponse au hMRΔ5,6, à l’aldostérone comme à la déxaméthasone.Ces résultats démontrent que le LTCC cardiaque constitue une cible directe del’aldostérone et du RM, et apportent de nouvelles perspectives quant aux conséquencesmoléculaires et fonctionnelles engendrées par l’activation délétère du système minéralocorticoïdedans la défaillance cardiaque. / During the past decades, major novel pathogenic roles of the steroid hormone,aldosterone, via the Mineralocorticoid Receptor (MR) have been identified in heart. Collectively,experimental studies and clinical trials, suggest a detrimental association between aldosteroneand life threatening arrhythmias that may be prevented by MR blockade. However, the signalingpathways and underlying mechanisms still remain elusive. We have accumulated evidence thatmodulation of Ca2+ signaling, especially Ca2+ influx via L-Type Ca2+ channel (LTCC), might bethe primary aldosterone/MR target in ventricular cardiomyocytes. Yet, the molecularmechanisms by which MR regulates expression of LTCC remain to be defined. Here, weinvestigated, in primary cultures of neonatal rat ventricular myocytes, the molecular eventscritical for aldosterone-Mediated cardiac effects on CaV1.2, the pore-Forming main subunit ofLTCC, which is encoded by the CaCNA1C gene.We showed that cardiac MR are functional as demonstrated by aldosterone-Induced MRnucleocytoplasmic trafficking observed by time-Lapse imaging of transfected GFP-Labeled MRusing confocal microscopy. Aldosterone exposure for 24 hours, induced a dose-Dependentincrease in CaV1.2 expression at both mRNA and protein levels. Analysis of the CaCNA1Cpromoter activity using luciferase reporter assays, revealed a dose- and time-Dependent activationby aldosterone. These effects were inhibited in the presence of either RU28318, a selective MRantagonist, or MR siRNA. In silico analyze enabled us to identify five putative GlucocorticoidResponse Elements (GRE) within the CaCNA1C promoter sequence. The mutation of the mostdistal GRE from Transcription Start Site (TSS) did not altered responses either elicited by theconstitutively active human MR (hMRΔ5,6) or dose-Dependent effects of aldosterone anddexamethasone (a synthetic glucocorticoïd with minimal MR effect). Mutations of the three nextones decreased responses to hMRΔ5,6 and aldosterone, whereas dexamethasone responses wereeither unchanged or increased. In sharp contrast, the mutation of the most proximal GRE fromTSS, increased responses to hMRΔ5,6, aldosterone and dexamethasone.These results provide new insights into the molecular mechanisms associated with cardiacMR activation, and suggest that LTCC is a primary MR target, with subsequent molecular andfunctional consequences that could lead to MR-Related cardiac dysfunction.

Les protéines de la membrane plasmique jouent un rôle fondamental dans la détection des informations véhiculées par le milieu extracellulaire et l’adaptation des cellules aux variations de l’environnement. Elles font l’objet d’une régulation fine qui permet de moduler leur présence à la membrane et de contrôler les voies de signalisation en aval. Dans ce contexte, les arrestines qui constituent une superfamille de protéines adaptatrices, se sont imposées comme des régulateurs clés depuis la découverte des β-arrestines et arrestines visuelles, spécifiques des eucaryotes supérieurs, et de leur rôle dans la régulation des récepteurs couplés aux protéines G hétéro-trimériques, jusqu’à l’identification plus récente de nouveaux membres apparentés, présents des mammifères jusqu’aux protistes, et partageant un rôle commun de régulation de cargos membranaires. Ce travail de thèse porte sur la caractérisation fonctionnelle de deux représentants du clan arrestine de l’amibe Dictyostelium discoideum, les protéines AdcB et AdcC. Ces deux protéines partagent une même organisation multimodulaire, spécifique aux Dictyostélides, qui associe au cœur arrestine, un domaine putatif C2 de type calcium-binding et deux modules SAMs, respectivement aux extrémités N- et C-terminales des protéines. Nous avons établi que ces domaines apportent des fonctions spécifiques à ces arrestines en leur conférant la capacité de lier des lipides anioniques in vitro en réponse au calcium à travers leur module C2, et de former des structures homo- et hétéro-oligomériques via leurs domaines SAMs. En dépit de ces similarités, AdcB et AdcC présentent un comportement différent in cellulo dans la mesure où seul AdcC transloque à la membrane plasmique en réponse à une élévation du calcium cytosolique, provoquée par la stimulation des cellules par les chimioattractants AMPc et acide folique ou le calcium lui-même. Ces résultats ont été complétés par une étude phénotypique des mutants invalidés pour ces arrestines et la recherche de partenaires qui ouvrent des pistes pour des études futures. / Integral proteins of the plasma membrane play a major role in the detection of environmental cues and in the adaptation of cells to variations of their environment. Regulatory mechanisms modulate their presence at the cell surface and control the signaling cascades activated in response to their stimulation. In this context, members of the arrestin revealed to be key regulators, since the discovery of β- and visual arrestins and their well-described role in the regulation of G-protein coupled receptors in complex organisms, and the more recent identification of arrestin-related proteins, present from mammals to protists and sharing functions in membrane cargo trafficking. This work aims at the functional characterization of two arrestin-related proteins of the social amoeba Dictyostelium discoideum, the AdcB and AdcC proteins. These two members of the arrestin clan share a similar multimodular organization, specific to Dictyostelids, with a putative N-terminal calcium-binding type C2 domain and two C-terminal SAM domains surrounding the arrestin module. We showed that the C2 domain confers calcium-dependent binding properties to anionic lipids in vitro and that the SAM domains allow the self-association and hetero-interaction of the two proteins in complexes of high molecular weight. Despite these similarities, AdcB and AdcC harbor a distinct behavior in vivo as only AdcC translocates to the plasma membrane in response to an intracellular calcium rise triggered by the chemoattractants acid folic and cAMP or extracellular calcium. In parallel, a phenotypic characterization of adcB and adcC single or double null mutants and a search for partners were conducted, that open new avenues for future research on these adaptor proteins.

On assiste à un essor spectaculaire des méthodes optiques pour suivre l’activité de populations neuronales in vivo. Ceci a permis de mettre en évidence des motifs remarquables d’organisation fonctionnelle à l’échelle mésoscopique impliqués dans de nombreuses fonctions cérébrales physiopathologiques. Cette thèse vise à mettre en place les outils permettant de disséquer les circuits sous-tendant ces motifs remarquables selon une approche expérimentale basée uniquement sur la microscopie optique. Plus particulièrement, ces outils ont été optimisés pour décrire la région CA1 de l’hippocampe adulte et le « barrel cortex » au cours du développement. En effet, deux motifs remarquables ont récemment été mis en évidence dans ces structures, les assemblées neuronales de CA1 adulte impliquées d’une part dans des processus de mémorisation et les neurones Hubs du cortex en développement et d’autre part participant au développement postnatal des circuits neuronaux. Dans ce contexte, nous avons développé un nouveau paradigme expérimental combinant imagerie calcique biphotonique in vivo, photostimulation par illumination holographique et analyse mathématique. Nous avons optimisé le choix et la co-expression de la sonde calcique et de l’opsine dans nos conditions expérimentales, et calibré leur utilisation dans les neurones de différentes structures cérébrales. De plus, nous avons conçu et assemblé un nouveau microscope à deux voies d’excitation, une pour l’imagerie calcique et l’autre pour la photostimulation holographique in vivo. Cette nouvelle approche expérimentale est en cours de validation sur les neurones Hubs à forte connectivité du « barrel cortex » en développement. / Over The last five years we have observed a huge improvement of optical methods to monitor the activity of neuronal populations in vivo. With these new approaches, remarkable patterns of functional organization at the mesoscopic scale that are involved in many pathophysiological brain functions were highlighted. This thesis aims to develop tools allowing us to dissect the circuits underlying these remarkable patterns according to an experimental approach based on all optical microscopy. These tools have been optimized to describe the functional organization of CA1 neurons in the adult hippocampus as well as in the barrel cortex during development. Two remarkable patterns have recently been identified in these structures, first, adult CA1 neural assemblies involved in memory processes and second, Hub cortical neurons that shape neuronal circuit during development. We have developed a new experimental paradigm combining in vivo two photon calcium imaging, holography photostimulation and mathematical analysis. We optimized the choice and co-expression of calcium probe (GCaMP6s) and opsin (Chronos and ChR2H134R) in our experimental conditions and calibrated their use in neurons of different brain structures. In addition, we designed and assembled a new two-path excitation microscope, one for calcium imaging and the other for in vivo holography photostimulation. This new experimental approach is being validated on Hub neurons with high connectivity in the developing barrel cortex.

La fibrilline-1, composant majeur des microfibrilles et second composant majeur des fibres élastiques, est une glycoprotéine dont la mutation du gène chez l'humain est responsable du syndrome de Marfan, caractérisé par des anévrismes et des dissections aortiques. Dans ce travail de thèse, nous avons étudié d'une part le rôle de la fibrilline-1 dans la physiologie des cellules endothéliales vasculaires humaines et d'autre part la conséquence du déficit quantitatif de la fibrilline-1 sur la structure et la fonction du système cardiovasculaire au cours du vieillissement chez la souris. Le fragment de fibrilline-1 "PF14" induit une signalisation calcique via les intégrines α5β1 et αvβ3, l'activation de la phospholipase C et la mobilisation des réserves intracellulaires de calcium, ainsi que la prolifération et la migration des cellules endothéliales humaines. La déficience quantitative sévère ou totale de la fibrilline-1 entraîne une létalité chez la souris dans les deux semaines après la naissance alors que celle, partielle, due à la délétion hétérozygote hypomorphique des exons 19 à 24 du gène de la fibrilline-1 (délétion mgΔ) n'affecte pas la longévité des souris. Les souris Fbn-1+/mgΔ présentent une hypertrophie cardiaque et une hypotension ainsi que des anévrismes aortiques qui deviennent plus fréquents avec l'âge. La paroi aortique de ces souris présente des altérations structurales (fragmentations des lames élastiques), biomécaniques (l'augmentation de la rigidité) et de la vasomotricité, qui s'accentuent avec l'âge. Nos résultats suggèrent que la déficience quantitative de la fibrilline-1 pourrait altérer la signalisation que cette protéine déclenche normalement dans les cellules endothéliales dès la phase de morphogénèse artérielle, et induire en conséquence une pathologie anévrismale de la paroi aortique au cours du vieillissement. Les effets opposés des déficiences quantitatives en fibrilline-1 et en élastine sur la fonction vasculaire suggèrent des rôles opposés pour ces deux composants majeurs des fibres élastiques. Ce travail permet par ailleurs de valider les souris Fbn-1+/mgΔ, tant sur le plan structural que fonctionnel, comme modèle du syndrome de Marfan.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La formation de métastases est la cause majeure des décès par cancer. Le développement de métastases est consécutif à une série d‟événements complexes tels que la migration, l‟invasion et la prolifération cellulaire. Le canal potassique SK3 (membre de la famille des SKCa) régule la migration des cellules cancéreuses du sein et favorise le développement de métastases osseuses. Le but du projet était d‟identifier et de caractériser les voies d‟entrées calciques associées à la migration cellulaire dépendante du canal SK3 dans différents cancers (sein, colon et prostate). Nous avons pu mettre en évidence que les canaux Ca2+qui étaient associés au canal SK3 variaient en fonction du cancer et régulaient la migration cellulaire dépendante du canal SK3. De plus, nous avons montré que la localisation de ces complexes KCa/Ca2+ dans les radeaux lipidiques était importante pour leur régulation et leur fonction. Ainsi, la délocalisation de ces complexes hors des radeaux lipidiques par des alkyl-phospholipides est un moyen permettant de moduler la migration des cellules exprimant le canal SK3 et le développement de métastases. / In most cases of cancer, metastasis and not the primary tumor per se is the main cause of mortality. To establish secondary growth in distant organs cancer cells must develop an enhanced propensity to migrate. The key objective of this thesis proposes that some actors of Ca2+ signaling (Orai, and TRPC, STIM) coupled to SK3 channel would form complexes that play a critical role in cell migration of various cancers (breast, colon and prostate). Furthermore we showed that the localization of these channels complexes in lipid-rafts is essential to their regulation and function. Thus, the delocalization of these complexes of lipid-raft outside by alkyl-phospholipids could be a new way to modulate the SK3/Ca2+ dependent cell migration and metastasis development.

Les anticorps monoclonaux (AcM) anti-CD20 sont essentiels pour le traitement du lymphome non hodgkinien et de la leucémie lymphoïde chronique (LLC). Les AcM agissent soit en activant directement la signalisation apoptotique dans les cellules cibles, soit via le système immunitaire. Dans une étude préclinique, nous avons montré que le traitement avec AcM anti-CD20, rituximab et GA101, induit l'expression de la protéine early growth response 1 (EGR-1) (Dalle et al., 2011). EGR-1 est un facteur de transcription régulé par le calcium (Ca2+) et CD20 est impliqué dans la régulation du flux calcique transmembranaire. Nous avons donc étudié le rôle d'EGR-1 et du flux Ca2+ dans l'activité cytotoxique des AcM anti-CD20. Nous avons montré qu'EGR-1 est rapidement induit suite à l'exposition au rituximab et à GA101. La baisse de l'expression d'EGR-1 par shRNA a supprimé l'effet cytotoxique du GA101 à la fois in vitro et in vivo, indiquant qu'EGR-1 est requis pour la mort cellulaire médiée par CD20. De plus, la surexpression d'EGR-1 augmente la sensibilité au GA101 in vitro et in vivo. En outre, nos résultats indiquent que les AcM anti-CD20 induisent un flux Ca2+. Le blocage du flux Ca2+ par inhibiteurs de canaux calciques (ICC) a aboli l'induction d'EGR-1 ainsi que l'efficacité du GA101 in vivo et ex vivo dans des échantillons de LLC. Plus important, nos données indiquent que les patients recevant des ICC ont une moins bonne réponse au traitement par les AcM anti-CD20. En conclusion, nous avons identifié EGR-1 comme potentiel biomarqueur pour prédire la réponse à la thérapie anti-CD20 et démontré que les ICC ont un impact négatif sur l'efficacité des AcM anti-CD20 chez les patients / Anti-CD20 monoclonal antibodies (mAbs) are an essential component of the treatment of patients with non-Hodgkin's lymphoma and chronic lymphocytic leukemia (CLL). They mediate their antitumor effects by activating the immune system or by direct apoptotic signaling in target cells. In a previous preclinical study, we showed that treatment with anti-CD20 mAbs, rituximab and GA101, resulted in upregulated expression of early growth factor 1 (EGR-1) (Dalle et al. 2011). EGR-1 is a calcium (Ca2+) regulated transcription factor and CD20 is hypothesized to regulate transmembrane Ca2+ flux. Therefore, we aimed to assess the role of EGR-1 and Ca2+ flux in the cytotoxic activity of anti-CD20 mAbs. We have shown that EGR-1 expression is rapidly upregulated in CD20+ cells following rituximab and GA101 exposure. Decreasing EGR-1 expression by shRNA abolishes the direct cytotoxic effect of GA101 both in vitro and in vivo, indicating that EGR-1 is required for CD20-mediated cell death. Additionally, the overexpression of EGR-1 enhances the cytotoxic activity of GA101 both in vitro and in vivo. Furthermore, our results indicate that anti-CD20 mAbs induce calcium influx. Blocking the Ca2+ flux with calcium channel blockers (CCB) abolishes EGR-1 induction and impaires the GA101 efficacy in vivo and ex vivo in CLL blood samples. More importantly, our data indicate that patients receiving CCBs and anti-CD20 therapy have worst progression free survival and overall survival. In conclusion we have identified EGR-1 as a potential biomarker to predict response to anti-CD20 therapy. We demonstrated that co-treatement with CCBs negatively impacts the outcome of patients receiving anti-CD20 mAbs

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L’ion calcium est un second messager qui intervient dans de nombreux processuscellulaires dont la prolifération, la différenciation et l’apoptose. Ainsi, l’homéostasiecalcique constitue un point central de régulation de la signalisation cellulaire. En effet, laconcentration calcique cytosolique de calcium subit des oscillations, qui suivant leuramplitude ou leur fréquence, vont être capables d’activer spécifiquement certains facteursde transcription. La régulation de ces oscillations implique entre autres les ATPases de typeSERCA (Sarco/Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase) qui accumulent le calcium dansle réticulum endoplasmique. L’objectif de ce travail de thèse a été l’étude des SERCAs aucours de la différenciation lymphocytaire B et dans l’épithélium du plexus choroïde ; ceci,afin de mieux comprendre le profil d’expression de ces pompes et les mécanismes derégulation impliqués.Au cours de la différenciation de lignées de leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) nousavons observé que l’expression de l’isoforme SERCA2 restait stable ou augmentaitlégèrement alors que celle de l’isoforme SERCA3 était toujours fortement induite, pouvantatteindre des niveaux observés dans les cellules lymphoïdes matures. Nous avons égalementobservé que l’inhibition de l’activité des SERCAs altère la différenciation cellulaire qui estdépendante de la voie des PKC. Ces données indiquent que SERCA3 pourrait être utiliséecomme marqueur de la différenciation lymphocytaire B. Une régulation de l’expression desSERCAs a également été mise en évidence au cours de la différenciation de l’épithélium duplexus choroïde normal ou tumoral. SERCA3 est fortement exprimée dans l’épithéliumnormal, mais on retrouve une baisse ou une perte de son expression dans l’épithéliumtumoral, cette baisse est corrélée à la perte de la différenciation selon le grade des tumeurs.L’étude de l’expression des SERCAs dans les cellules primaires du plexus choroïde traitépar des agents cyto-différenciateurs (acides gras à chaîne courte), montre que ladifférenciation est associée à une surexpression de SERCA3. SERCA3 peut donc égalementêtre un marqueur de la différenciation de l’épithélium du plexus choroïde.L’ensemble de ce travail a montré que la différenciation cellulaire est associée à la régulationde protéines impliquées dans la régulation de l’homéostasie calcique : les SERCAs. On peutainsi proposer SERCA3 comme un nouveau marqueur phénotypique utile pour l’analyse dela différenciation du plexus choroïde normale et néoplasique, ainsi que pour celle de ladifférenciation lymphoïde pré-B leucémique. / Cellular calcium is involved in a multitude of biological processes including thecontrol of cell proliferation, differentiation and programmed cell death, and constitutestherefore a keconcentration calcique cytosolique de calcium subit des oscillations, qui suivant leuramplitude ou leur fréquence, vont être capables d’activer spécifiquement certains facteursde transcription. La régulation de ces oscillations implique entre autres les ATPases de typeSERCA (Sarco/Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase) qui accumulent le calcium dansle réticulum endoplasmique. L’objectif de ce travail de thèse a été l’étude des SERCAs aucours de la différenciation lymphocytaire B et dans l’épithélium du plexus choroïde ; ceci,afin de mieux comprendre le profil d’expression de ces pompes et les mécanismes derégulation impliqués.Au cours de la différenciation de lignées de leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) nousavons observé que l’expression de l’isoforme SERCA2 restait stable ou augmentaitlégèrement alors que celle de l’isoforme SERCA3 était toujours fortement induite, pouvantatteindre des niveaux observés dans les cellules lymphoïdes matures. Nous avons égalementobservé que l’inhibition de l’activité des SERCAs altère la différenciation cellulaire qui estdépendante de la voie des PKC. Ces données indiquent que SERCA3 pourrait être utiliséey element in cell signaling. Calcium levels vary in a dynamic mannerdepending on the state of activation of the cell, and can display oscillations the amplitudeand frequency of which can convey specific signals to various transcription factors.Sarco/Endoplasmic Reticulum Calcium ATPases (SERCA enzymes) accumulate calciumfrom the cytosol into the endoplasmic reticulum (ER). By modulating the spatiotemporalcharacteristics of calcium signals and oscillations, SERCA pumps constitute an importantand unique point of control of calcium-dependent cell activation. In this work weinvestigated SERCA expression during early B lymphoid differentiation and in normal,tumoral and hyperplastic choroid plexus epithelial cells.We have shown that SERCA3 expression is markedly increased during thepharmacologically induced differentiation of immature B acute lymphoblastic leukemiacells, whereas the expression of the simultaneously expressed SERCA2 isoform is notmodified significantly. SERCA3 expression during this differentiation process can reachlevels observed in mature B lymphoid cells, and is dependent on the activation of proteinkinase C. Moreover, the direct pharmacological inhibition of SERCA-dependent calciumtransport interferes with the differentiation process.Our investigations on the choroid plexus show, that whereas SERCA3 is highly expressedin normal choroid plexus epithelium, expression is strongly decreased in benign choroidplexus tumors and is lost in carcinoma, whereas expression is retained in hyperplasia. Inaddition, treatment of primary normal choroid plexus epithelial cells by short chain fattyacid-type cell differentiation-inducing agents in vitro leads to the induction of SERCA3expression.Our observations when taken together indicate that ER calcium homeostasis is remodeledduring the differentiation of immature B lymphoid cells and in the choroid plexus due to theinduction of SERCA3 expression. We show that a cross-talk exists between SERCA functionand the control of differentiation in B cells, that SERCA3 constitutes a new phenotypicmarker for the study of early B cell differentiation, and that the lack of SERCA3 expressionmay be useful for the identification of choroid plexus tumors.