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S100A12 porcina é um membro da família das proteínas S100, um grupo de pequenas proteínas ligantes de cálcio caracterizado pela presença de dois motivos “EF-hand”. Estas proteínas estão envolvidas em diversos eventos celulares, como a regulação da fosforilação protéica, atividade enzimática, tamponamento de Ca+2, processos inflamatórios e a polimerização de filamentos intermediários. Adicionalmente, algumas dessas proteínas podem ligar Zn+2, o qual pode afetar a ligação do íon Ca+2, particularmente para as proteínas S100. Neste trabalho, a seqüência gênica que codifica a proteína S100A12 porcina foi obtida por meio da construção de um gene sintético usando códons preferenciais para E.coli, permitindo a produção recombinante de grandes quantidades da proteína. Um estudo termodinâmico da estabilidade estrutural foi realizado, assim como a interação da proteína recombinante com íons divalentes usando técnicas de dicroísmo circular (CD) e fluorescência extrínseca. A desnaturação e renaturação induzidas por uréia ou temperatura indicam que se trata de um processo reversível e que a ligação dos íons Zn+2 e ou Ca+2 à rS100A12 aumenta sua estabilidade. A interação da sonda ANS com a proteína na presença de seus ligantes expõe superfícies hidrofóbicas podendo assim facilitar sua interação com macromoléculas alvo. Analisados em conjunto, os resultados obtidos indicam que S100A12 porcina é capaz de assumir diferentes conformações as quais podem estar correlacionadas com sua função fisiológica. / Porcine S100A12 is a member of S100 family, a small acidic calcium-binding proteins group characterized by the presence of two EF-hand motifs. These proteins are involved in many cellular events as the regulation of protein phosphorylation, enzymatic activity, Ca+2 homeostasis, inflammatory processes and intermediate filament polymerization. In addition, some of these proteins can bind Zn+2, which can affect the binding of Ca+2 particularly to S100 proteins. In this study, the gene sequence encoding S100A12 was obtained by the synthetic gene approach using E. coli codon bias allowing the recombinant production of large amounts of the protein. We report here a thermodynamic study on the structural stability of this recombinant protein and its interaction with divalent ions using circular dichroism and extrinsic fluorescence. The folding/unfolding induced by urea or temperature indicated a reversible process and the binding of Zn+2 or Zn+2 and Ca+2 to S100A12 increasing its stability. The interaction of the ANS probe with the protein in the ligant presence can lead to exposition of hydrofobic regions allowing its interaction with target macromolecules. Taken together, the results indicated that porcine S100A12 may assume different conformations that could be correlated to its physiological function.

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Les neurones sont des cellules excitables capables de coder et transmettre l’information sous forme d’oscillations du potentiel membranaire. Cette activité électrique est produite par une modification des flux ioniques transmembranaires. Les neurones constituent un exemple d’oscillateur cellulaire dont la dynamique non linéaire permet l’apparition d’une activité électrique complexe. Dans ce système, les ions calciques sont des messagers intracellulaires importants. Ils servent de médiateur entre un signal électrique et un signal chimique, par une modulation de l’activité enzymatique de certaines protéines. Ils interviennent dans de nombreuses fonctions neuronales, dont l’excitabilité électrique. Un des mécanismes mis en place par les neurones pour contrôler l’homéostasie du calcium intracellulaire provient de protéines cytoplasmiques capables de lier les ions calciques. Ces protéines jouent un rôle de « tampon » du calcium. Cependant, toutes leurs fonctions n’ont pas encore été mises en évidence. C’est l’objectif de notre travail. Nous avons voulu comprendre le rôle joué par une protéine « tampon » particulière, la calrétinine, sur le mode de décharge électrique d’un neurone où elle est exprimée en abondance, le grain cérébelleux. Pour cela, nous avons utilisé une approche théorique et expérimentale. <p>Au niveau théorique, nous avons élaboré un modèle mathématique de l’activité électrique du grain cérébelleux, prenant en compte la chélation du calcium intracellulaire. Il permet de clarifier le rôle de la chélation du calcium intracellulaire sur les oscillations du potentiel membranaire. La modélisation de l’activité électrique du grain cérébelleux repose sur le formalisme développé par Hodgkin et Huxley pour l’axone géant de calmar. Dans ce contexte, l’application de la conservation de la charge au circuit équivalent de la membrane cellulaire fournit un système d’équations différentielles ordinaires, non linéaires. Dès lors, notre modèle nous a permis d’étudier l’impact des variations de la concentration de chélateur calcique sur les oscillations du potentiel membranaire. Nous avons ainsi pu constater qu’une diminution de la concentration en chélateur calcique induisait une augmentation de l’excitabilité électrique du grain cérébelleux, sans altérer le régime d’oscillations. Par contre, en augmentant fortement la concentration en chélateur calcique, nous avons montré que le grain cérébelleux changeait de dynamique oscillatoire, montrant des transitions d’un mode de décharge périodique régulier vers des oscillations en salve du potentiel membranaire.<p>Au niveau expérimental, nous avons vérifié les résultats prévus par le modèle théorique. Nous avons ainsi montré que des grains de souris transgéniques déficientes en calrétinine présentaient une excitabilité électrique accrue par rapport aux grains contrôles.<p>Puis, en restaurant un niveau de chélation calcique normal dans ces grains, par perfusion intracellulaire de chélateur calcique, nous montrons qu’ils retrouvent un niveau d’excitabilité normal. Ensuite, nous avons introduit dans des grains cérébelleux de souris sauvages, une forte concentration en chélateur calcique exogène. Conformément aux résultats théoriques, nous avons pu observer des transitions vers des oscillations en salve du potentiel membranaire. Enfin, nous avons montré que l’absence de calrétinine affecte les paramètres morphologiques du grain cérébelleux des souris transgéniques déficientes en calrétinine.<p>En conclusion, ces résultats suggèrent que le mode de décharge des cellules excitables peut être modulé d’une façon importante par les protéines liant le calcium. De ce fait, des changements dans le niveau d’expression et/ou dans la localisation subcellulaire des protéines liant le calcium pourraient aussi jouer un rôle critique dans la régulation de processus physiologiques contrôlés par l’excitabilité membranaire. De plus, les mécanismes que nous avons mis en évidence pourraient être à l’origine d’un nouveau principe de régulation de la signalisation dans les circuits neuronaux et pourraient jouer un rôle fonctionnel dans le contrôle du codage de l’information et de son stockage dans le système nerveux central. / Doctorat en sciences, Spécialisation physique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Chronic kidney disease (CKD) and acute kidney injury (AKI) are major public health problems. It is important to be able to identify those at high risk of adverse outcome, CKD progression and associated cardiovascular disease. The aim of the thesis was to study novel promising biomarkers, their relationship to kidney function, chronic inflammation and/or cardiovascular risk - placental growth factor (PlGF), pregnancy associated plasma protein A (PAPP-A), matrix metalloproteinase 2 (MMP-2), matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), soluble receptor for advanced glycation end products (sRAGE), calcium binding protein S100A12 or extracellular newly identified RAGE binding protein (EN-RAGE), and high mobility group box protein-1 (HMGB-1) in patients with renal diseases including CKD, haemodialysis (HD), AKI patients, and healthy controls for comparison. First study revealed that PlGF is elevated in patients with decreased renal function. Second study demonstrated the association of MMP-2 and PAPP-A with proteinuria in patients with CKD. Moreover, serum MMP-2, MMP-9 and PAPP-A levels significantly differed in patients with various nephropathies. EN-RAGE levels are not elevated in patients with CKD, but are related to inflammatory status. PAPP-A, EN-RAGE and HMGB-1 levels are significantly elevated, but sRAGE and PlGF...

Chronic kidney disease (CKD) and acute kidney injury (AKI) are major public health problems. It is important to be able to identify those at high risk of adverse outcome, CKD progression and associated cardiovascular disease. The aim of the thesis was to study novel promising biomarkers, their relationship to kidney function, chronic inflammation and/or cardiovascular risk - placental growth factor (PlGF), pregnancy associated plasma protein A (PAPP-A), matrix metalloproteinase 2 (MMP-2), matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), soluble receptor for advanced glycation end products (sRAGE), calcium binding protein S100A12 or extracellular newly identified RAGE binding protein (EN-RAGE), and high mobility group box protein-1 (HMGB-1) in patients with renal diseases including CKD, haemodialysis (HD), AKI patients, and healthy controls for comparison. First study revealed that PlGF is elevated in patients with decreased renal function. Second study demonstrated the association of MMP-2 and PAPP-A with proteinuria in patients with CKD. Moreover, serum MMP-2, MMP-9 and PAPP-A levels significantly differed in patients with various nephropathies. EN-RAGE levels are not elevated in patients with CKD, but are related to inflammatory status. PAPP-A, EN-RAGE and HMGB-1 levels are significantly elevated, but sRAGE and PlGF...