Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5633.pdf: 1339694 bytes, checksum: c96c2cb2d5b7dcda944ea18353c62f47 (MD5) Previous issue date: 2013-08-02 / The Meat tenderness, a trate of economic importance in animal production, is influenced by the intensity of the degradation of myofibrillar proteins in post-mortem. The &#956;-calpain is the main enzyme responsible for meat tenderness of skeletal muscle, and, conversely, the calpastatin, which is encoded by the CAST gene, acts as endogenous inhibitor of calpain and thus decreases the extent of proteolysis in skeletal muscle. Polymorphisms in CAST were associated with enzyme activity and shear force, indicating the great importance of the study of CAST gene regulation. It is known that the transcription of most genes is stably suppressed in most tissues and only remains active in their tissue of expression and in certain developmental stages, and that can be controlled by epigenetic events such as methylation of DNA cytosine that is identified by sequencing of bisulfite-treated DNA. The aim of this study was to evaluate if there was preferential expression, of tissue, genotype and stage of development for the CAST gene in liver, muscle and skin of fetuses and muscle and liver of homozygous and heterozygous adult cattle for the A> G exon 30/3'UTR polymorphism, evaluated by real-time PCR with SYBR ® fluorophore, and to verify if the differential expression is regulated by the methylation status of promoter region. Differential gene expression analyses were normalized to the reference gene RPS-9. When we analyzed the tissue-specific expression in fetuses, the CAST gene was 2 times more expressed in liver than in skin (p <0.05) and almost two times more expressed in liver than in muscle (p <0.05). It was also found that this gene was 1.83 x up regulated in adult muscle when compared to fetal muscle (p <0.05), showing differential expression in the developmental stage. Differences in expression between genotypes were also found, when comparing the homozygous genotype to the heterozygous genotype (used as calibrator). Fetal samples of muscle and skin of individuals with GG genotype presented higher expression (p <0.05) of CAST gene (2x and 1,74 x, respectively, compared to heterozygous) and muscle of animals with AA genotypes also presented higher expression (1.4x compared to AG). In adult animals, the gene was up regulated in liver and muscle of individuals with GG genotype (2x and 1.63x more than AG, respectively) and was less expressed in the liver of homozygote AA (0,32x less than AG) (p <0.05). The presence of a CpG island in the promoter region of the gene CAST was identified and the methylation status was studied after bisulfite treatment, cloning of the fragment and sequencing of clones. The CpG island was hypomethylated in different tissues: 0.63% of methylated CpG dinucleotides in fetal muscle, 0.43% in fetal liver and 0.61% in adult muscle. According to the different genotypes the island was methylated in 0.61%, 0 49%, 0.60% in animal with AA genotype, 0.81%, 0.35%, 0.34% in AG, 0.4%, 0.45% ,0.9% in GG in fetal muscle, fetal liver and adult muscle respectively. In our results we show that the CpG island is hypomethylated and can allow transcription of the gene but the methylation does not explain the differences in expression within tissues, developmental stage and genotypes of the CAST gene. / A maciez da carne, uma característica de grande interesse econômico, é influenciada pela intensidade da degradação de proteínas miofibrilares no período pós-mortem. A &#956;-calpaína é a principal enzima responsável pelo amaciamento do músculo esquelético, e de maneira oposta, a calpastatina que é codificada pelo gene CAST, atua como inibidor endógeno das calpaínas e, portanto, diminui a taxa e extensão da proteólise no músculo esquelético. Polimorfismos no gene CAST já foram associados à atividade da enzima e à força de cisalhamento, indicando a grande importância no estudo da regulação desse gene. Sabe-se que a transcrição da maior parte dos genes é reprimida estavelmente na maioria dos tecidos e só permanece ativa nos seus tecidos de expressão e em determinados estádios do desenvolvimento, e que isso pode ser controlado por eventos epigenéticos como a metilação de citosinas do DNA, passível de identificação por sequenciamento de DNA tratado com bissulfito. Os objetivos deste estudo foram avaliar se ocorre expressão preferencial de tecido, de genótipo e de estádio do desenvolvimento para o gene CAST em fígado, músculo e pele de fetos e músculo e fígado de animais adultos em bovinos homozigotos e heterozigotos para o polimorfismo A>G no éxon 30/3 UTR por meio de PCR em tempo real com o fluoróforo SYBR®. Além disso, foi verificado se a expressão diferencial do gene é regulada pelo status de metilação no seu promotor. Todas as expressões foram normalizadas para o gene referência RPS-9. Em fetos o gene CAST foi duas vezes mais expresso (p<0,05) em fígado do que em pele e quase duas vezes mais expresso (p<0,05) em fígado do que em músculo. Também foi encontrado aumento na expressão do gene de 1,83 x (p<0,05) em músculo adulto quando comparado a músculo fetal, evidenciando expressão diferencial de estádio de desenvolvimento. Quando analisadas as diferenças de expressão entre genótipos, comparando o genótipo homozigoto com o genótipo heterozigoto (usado como calibrador) foi encontrado, em amostras de fetos, um aumento de expressão (p<0,05) do gene CAST em músculo e pele de indivíduos GG (2x e 1,74x, respectivamente, em relação a heterozigotos) e músculo de indivíduos AA (1,4x em reação a AG). Em amostras de animais adultos, o gene foi mais expresso em fígado e músculo de indivíduos GG (2x e 1,63x mais que AG, respectivamente) e foi menos expresso (p<0,05) em fígado de indivíduos homozigotos AA (0,32x menos que AG). Foi identificada a presença de uma ilha CpG na região promotora do gene CAST e foi realizado tratamento do DNA com bissulfito, a clonagem do fragmento e o sequenciamento de clones. A ilha CpG mostrou-se hipometilada nos diferentes tecidos: 0,63% de dinucleotídeos CpG metilados em músculo fetal, 0,43% em fígado fetal e 0,61% em músculo adulto; e nos diferentes genótipos: 0,61%, 0,49% e 0,60% em AA, 0,81%, 0,35%, 0,34% em AG, 0,4%, 0,45% e 0,9% em GG em músculo fetal, fígado fetal e músculo adulto respectivamente. Assim a hipometilação da ilha CpG pode permitir a transcrição do gene, mas não explica as diferenças de expressão entre tecidos, estádio de desenvolvimento e genótipo para o genes CAST.

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The animals were genotyped using either the Illumina BovineHD Beadchip (777k) or the GGP-Indicus Chip (77k). SNPs were excluded when Call Rate < 90%, then the imputation from the GGP to the HD Chip was performed using the FImput’s software. To study the different quality control protocols and their influence in GWAS, 590,915 markers were used. The effect of different QCs were verified using 16 protocols with three thresholds for MAF (MAF < 0.01; < 0.05 and < 0.10) and HWP (p < 0.01; < 0.0001 and < 0.00001) and their possible combinations. GWASs were performed using the PD3/EMMAx method with the remaining markers of each QC. For GWAS performed for pathway analysis, 369,007 markers were used after SNPs were excluded when Call rate < 90%, HWP p < 0.01 and MAF < 0.01. Group of slaughter and sex were included as fixed effects. Significant markers (p < 0.0001) were found in all analysis, in which the chromosomes with more significant SNPs of the different QCs were 3, 17, 20, 21, 25 and 27, and in the pathway study were located on chromosomes 3, 13, 17, 20, 21 and 25 explaining great proportion of variation, indicating possible QTLs associated with meat tenderness in those genomic regions. The analyses of different QCs showed that there is an effect of quality control over GWAS, and the filter for MAF influenced the results more broadly. A pathway enrichment analysis based on SNPs from GWAS was performed using FatiGO’s procedure. 22,365 annotated genes, including 1,010 significant genes were used. Thus, 22 GO terms and two IP entries were deemed enriched. Several of these functional categories, such as protein tyrosine and serine/threonine kinase activity, calcium ion binding and growth factors can be related to WBSF in Polled Nellore cattle. These results help to elucidate the metabolic pathways related to this trait, which is of extreme economic and social importance to Brazil as Nellore is the dominant beef cattle breed in the country. / O Brasil tem um dos maiores rebanhos bovinos comerciais do mundo, mas a qualidade da carne é altamente variável. O rebanho nacional é em grande parte composto de raças Bos indicus, que em geral têm carne menos macia do que o gado Bos taurus, diminuindo o valor do produto. Objetivou-se nesse estudo identificar regiões genômicas e vias biológicas relevantes associadas com a maciez da carne em bovinos da raça Nelore Mocho. Além disso, objetivou-se também avaliar diferentes protocolos de controle de qualidade dos SNPs e as possíveis influências nos resultados de GWAS. Os dados consistiram em valores de WBSF do músculo Longissimus dorsi, após maturação de sete dias, de 427 animais Nelore Mocho. Os animais foram genotipados em marcadores SNP Illumina BovineHD Beadchip (777k) ou Chip GGP-Indicus (77k). Todos os SNPs passaram por um Call Rate de 90% para posterior imputação utilizando o software FImput. Para averiguar os diferentes protocolos de qualidade e suas influências no GWAS foram utilizados 590.915 marcadores. Os efeitos dos diferentes QCs foram verificados utilizando 16 protocolos com três limiares para MAF (MAF < 0,01;< 0,05 e < 0,10) e HWP (p < 0,01; < 0,0001 e < 0,00001) e suas possíveis combinações. Os GWASs foram realizados utilizando método P3D/EMMAx com os marcadores restantes de cada QC. No GWAS realizado para posterior análise das vias utilizou-se 369.007 marcadores após a exclusão de SNPs baseada nos filtros Call Rate < 90%, HWP p < 0,01 e MAF < 0,01. Grupo de abate e sexo foram incluídos no modelo como efeitos fixos. Marcadores significativos (p < 0,0001) foram localizados em todas as análises, e os cromossomos com maior quantidade de SNPs significativos dos diferentes QCs foram 3, 17, 20, 21, 25 e 27. No estudo de vias foram localizados SNPs significativos nos cromossomos 3, 13, 17, 20, 21 e 25, que explicaram maior proporção da variação, indicando que existem QTLs associados à maciez da carne nessas regiões do genoma. As análises dos diferentes QCs evidenciaram efeito do controle de qualidade dos SNPs sobre o GWAS e o filtro para MAF influenciou de maneira mais ampla os resultados. Foi realizada uma análise de enriquecimento de vias baseando-se nos SNPs do GWAS, utilizando o procedimento FatiGO. Apenas os genes com no mínimo um SNP significativo (p < 0,01) foram considerados. Foram utilizados 22.365 genes anotados, incluindo 1.010 genes significativos. Um total de 22 termos GO e duas entradas IP foram consideradas enriquecidas com genes significamente associados com a maciez da carne. Várias dessas categorias funcionais como atividade da proteína tirosina quinase e serina/treonina quinase, ligantes ao íon cálcio e fatores de crescimento, podem estar relacionadas com WBFS em bovinos da raça Nelore Mocho. Estes resultados ajudam elucidar as vias relacionadas com essa característica de extrema importância econômica para o Brasil, já que o Nelore é a raça de gado de corte dominante no país.

O consumo alimentar residual (CAR) é uma medida de eficiência alimentar independente do crescimento e do peso à maturidade. O melhoramento genético para CAR pode reduzir o custo de alimentação de bovinos, porém uma melhor compreensão dos processos biológicos relacionados ao CAR é necessária. Além disso, associações entre CAR e qualidade de carcaça têm sido pouco investigadas em raças zebuínas. Desta forma, o objetivo com este estudo foi avaliar o metabolismo protéico, a composição corporal, as características de carcaça e a qualidade de carne em bovinos zebuínos com alto e baixo CAR. Adicionalmente, foi testada a hipótese da existência de interações entre CAR e peso vivo ao abate para características de carcaça e composição corporal. Setenta e dois novilhos da raça Nelore (16 a 21 meses de idade, 334±19 kg de peso vivo inicial [PV]) foram mantidos em confinamento e alimentados ad libitum (74,5% NDT; 14,3%PB) por 70 dias. O consumo de matéria seca (CMS) e o ganho médio de peso (GMD) diários foram medidos individualmente. Os 12 novilhos com maior CAR e os 12 com menor CAR foram classificados como grupos de alto e baixo CAR, respectivamente (fase de seleção) e foram alimentados até quando alcançassem pesos vivo ao abate de 460, 490, 520 e 550 kg (fase de terminação). Antes do abate, foi realizada colheita total de urina para a determinação da excreção diária de 3-metil-histidina e da taxa fracional de degradação miofibrilar. A composição química corporal foi estimada pelo método de diluição isotópica utilizando óxido de deutério. A maciez objetiva da carne e a atividade de proteases cálcio-dependentes foram determinadas no músculo Longissimus. Na fase de seleção, novilhos com baixo CAR tiveram menores CMS, conversão alimentar, CAR e ganho de gordura sobre a garupa que novilhos com alto CAR, mas nenhuma diferença foi observada no GMD, no PV final, na gordura subcutânea e na área do Longissimus. Na fase de terminação, nenhuma interação foi observada entre CAR e PV ao abate. Não houve diferenças entre animais mais e menos eficientes quanto ao peso e rendimento de carcaça, gordura renal, pélvica e inguinal, vísceras, área de Longissimus, gordura subcutânea, marmorização, aparas e porção comestível. Novilhos com baixo CAR apresentaram menos gordura sobre o trato gastrintestinal (TGI) que novilhos com alto CAR. Não foram observadas diferenças quanto ao índice de fragmentação miofibrilar, força de cisalhamento e atividade do sistema calpaína. As taxas fracionais de degradação, síntese e acréscimo protéico foram similares entre os grupos de CAR. Novilhos Nelore com baixo CAR depositaram menos gordura subcutânea na carcaça em pesos vivos entre 340 e 460 kg. Em pesos mais elevados (460-550 kg), as características de carcaça e a composição corporal não foram influenciadas pelo CAR, mas indivíduos menos eficientes apresentaram maior massa de gordura visceral. A seleção de bovinos zebuínos para baixo CAR pode diminuir a ingestão de alimentos e melhorar sua eficiência alimentar, sem comprometer a qualidade da carne. / Residual feed intake (RFI) is a feed efficiency trait that is independent of growth rate and mature weight. Genetic improvement in RFI may reduce the costs of feeding cattle, however a better understanding of biological processes underlying variation in RFI is necessary. Moreover, associations between RFI and carcass quality have been poorly investigated in Zebu breeds. Therefore, this study aimed to evaluate protein metabolism, body composition, carcass traits and meat quality in high- and low-RFI Zebu cattle. In addition, the hypothesis that there are interactions between RFI and harvest body weight for carcass traits and body composition was investigated. Seventy-two Nellore steers (16 to 21 month-old, 334±19 kg initial body weight [BW]) were fed a finishing ration (74.5% TDN, 14.3%CP) on an ad libitum basis, for 70 days. Daily dry matter intake (DMI) and body weight gain (ADG) were measured individually. The 12 lowest and the 12 highest RFI steers were classed as low- and high-RFI groups, respectively (selection phase), and were fed until reaching slaughter BW of 460, 490, 520 and 550 kg (finishing phase). Before slaughter, total urine was collected for determination of daily 3-methylhistidine excretion and myofibrillar protein breakdown rates. Body chemical composition was estimated by the isotope dilution method using deuterium oxide. Objective tenderness and Ca+2-dependent protease activities were measured on Longissimus muscle. In the selection phase, low-RFI steers had lower DMI, feed:gain, RFI, and ultrasound rump fat thickness gain than high-RFI cattle, but no differences were observed for ADG, final BW, ultrasound fat thickness and Longissimus area. In the finishing phase, no interactions were observed between RFI and slaughter BW. No differences between more and less efficient cattle were observed for hot carcass weight, dressing percentage, kidney, pelvic and inguinal fat, visceral mass, Longissimus area, backfat thickness, marbling score, trimmings and retail product yield. Low-RFI steers presented less fat on the gastrointestinal tract (GIT) than high-RFI cattle. No differences were observed for myofibrillar fragmentation index, Warner-Bratzler shear force and calpain system activities. Fractional rates of protein degradation, synthesis and accretion were similar between high- and low-RFI cattle. Low-RFI Nellore steers may store less subcutaneous carcass fat at body weights ranging from 340 and 460 kg. At higher body weights (460-550 kg), carcass traits and body composition are not affected by RFI, but least efficient cattle present greater visceral fat mass. Breeding zebu cattle for improved RFI may decrease feed intake and improve feed efficiency without compromising meat quality.