Le maintien d'un potentiel de membrane de repos négatif est à la base de l'excitabilité neuronale. Ce potentiel négatif est généré par un courant de fuite de potassium induit par les canaux potassiques à deux domaines pore (K2P). Ils se sont révélés impliqués dans de nombreux mécanismes physiologiques et physiopathologiques tels que la dépression, la neuroprotection contre les ischémies, l'anesthésie, la migraine et la perception de la douleur. L'hétéromultimérisation est un mécanisme couramment utilisé dans la nature pour augmenter la diversité fonctionnelle des complexes protéiques. Par exemple, avec 15 gènes classés en 6 sous-familles, les canaux K2P pourraient générer 120 combinaisons et, en théorie, chacune d’elles possèderait des caractéristiques bien distinctes. Ici, nous avons d’abord étudié la capacité des membres de la même sous-famille K2P (sous-famille TREK) à s’assembler pour former des hétéromères fonctionnels dotés de nouvelles propriétés. En alliant l’optopharmacologie, une technique de précipitation de molécules uniques (SiMPull) et une technique de co-localisation à l’échelle de la molécule unique à la membrane plasmique, nous avons déterminé l’existence ainsi que la stœchiométrie des complexes créés entre TREK1, TREK2 et TRAAK. Nous avons caractérisé fonctionnellement les hétérodimères et avons constaté qu'ils formaient tous des canaux sélectifs au potassium rectifiant vers l'extérieur avec une sensibilité à la tension et aux pH variables. Ayant constaté que l’hétéromérisation est possible dans la même sous-famille, nous nous demandons si cela peut être fait entre membres de familles différentes et quelles pourraient en être les conséquences pathophysiologiques. Nous avons trouvé que TREK1 et TREK2 sont capable d’hétéromériser avec le canal plus distant TRESK, un canal K2P impliqué dans la migraine. Chez l'homme, la mutation TRESK-MT, une délétion de 2 paires de base (F139WfsX24) qui induit la formation de TRESK-MT1, un dominant négatif de TRESK, a été corrélé à la migraine. De manière surprenante, nous avons découvert que cette délétion induit un site alternatif de traduction (fsATI), menant à la formation d’un second fragment de TRESK, TRESK-MT2 qui s’assemble spécifiquement avec TREK1 et TREK2. Cet assemblage induit l’extinction des courants TREK, ce qui va augmenter l’excitabilité des neurones trijumeaux, une composante clé dans l’induction de la migraine, à l’origine du phénotype migraineux observé. Ensemble, ces résultats démontrent que l’hétéromérisation des canaux K2P n’est pas rare et doit être considérée pour comprendre leurs fonctions pathophysiologiques. Enfin, les analyses génétiques des mutations liées à des pathologies devraient désormais prendre en compte les fsATI. / Maintenance of a negative resting membrane potential underlies the basis of neuronal excitability. This negative potential is generated by a potassium leak current mediated by two-pore-domain potassium channels (K2P). Over the years, they have been shown to be involved in many physiological and pathophysiological mechanisms such as depression, neuroprotection, anesthesia, migraine and pain perception. Heteromultimerization is a mechanism commonly used to increase the functional diversity of protein complexes. For example, with 15 genes classified in 6 subfamilies, the K2P channel family can potentially generates 120 combinations and, in theory, each of them would show different functional properties. Here, we first investigated the ability of the members from the same K2P subfamily (TREK subfamily) to assemble and form functional heteromeric channels with novel properties. Using single molecule pulldown (SiMPull) from HEK cell lysates, subunit counting in the plasma membrane of living cells and opto-pharmacology, we show that the TREK channel members TREK1, TREK2, and TRAAK readily co-assemble. We functionally characterized the heterodimers and found that all combinations form outwardly rectifying potassium-selective channels but with variable voltage sensitivity and pH regulation. Having found that heteromerization is possible within the same subfamily we wonder if it can happen between members from different subfamilies with lower sequence homology and what could be the pathophysiological consequences. We found that TREK1 and TREK2 are able to heterodimerize with the distantly-related TRESK, a two-pore-domain K+ channel implicated in migraine. Notably, in humans, TRESK-MT, a 2 bp frameshift mutation (F139WfsX24), which induced the formation of TRESK-MT1 a dominant negative for TRESK, was found to perfectly segregate with typical migraine in a large pedigree. Strikingly, we found that the 2 bp frameshift mutation induced an alternative translation initiation (fsATI) which leads to the translation of a second TRESK fragment, termed TRESK-MT2. We show that by co-assembling with and inhibiting TREK1 and TREK2, TRESK-MT2 increases trigeminal sensory neuron excitability, a key component of migraine induction, leading to a migraine-like phenotype. Together these findings demonstrate that K2P heteromerization is not rare and needs to be considered to understand their pathophysiological functions and that genetic analysis of disease-related mutations should consider fsATI as a distinct class of mutations.

Les canaux ioniques sont exprimés dans tous les types cellulaires, des plantes à l’Homme, où ils sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques. Parmi ces canaux, les canaux potassiques à deux domaines pore ou K2P forment des dimères qui produisent des courants de fond, contrôlant le potentiel de repos de la membrane et ainsi l’excitabilité cellulaire. De ce fait, ils jouent un rôle dans de nombreuses fonctions physiologiques et pathophysiologiques telles que la respiration, la nociception ou la dépression et sont de plus en plus considérés comme des cibles thérapeutiques intéressantes pour le traitement de ces pathologies. La structure de ces canaux est une caractéristique importante à considérer pour le développement de nouveaux médicaments mais les mécanismes et les régulations qui contrôlent leur activité sont peu connus.Durant mon doctorat, nous avons démontré que les canaux K2P, en particulier les sous-familles THIK et TREK, peuvent s’assembler avec un autre canal de la même sous-famille pour former un hétérodimère fonctionnel. Nous avons tout d’abord prouvé que les canaux interagissent physiquement en combinant biochimie, immunocytochimie, FRET ainsi que l’électrophysiologie. De manière intéressante, les hétérodimères ont des conductances, des régulations et une sensibilité aux agents pharmacologiques différentes de celles des canaux homodimères.Ces études montrent que la famille des canaux K2P est plus étendue et diversifiée que ce qu’il avait été attendu. La combinaison de ces canaux au sein de la même sous-famille permet de créer de nouveaux canaux fonctionnels aux propriétés originales et donc de nouvelles cibles thérapeutiques / Potassium channels are highly conserved among organisms, from plants to humans, where they are involved in several functions. Among them, the two pore domain potassium channels or K2P channels are dimers that produce background channels to control membrane resting potential and thus cell excitability. They are involved in physiological functions and diseases such as breathing, nociception or depression. They are now more and more considered as important therapeutic targets for the development of new drugs targeting these diseases. Structure-function relationship of ion channels is an important feature for the drug design but we only know little about mechanisms and regulations that control the activity of K2P channels.During my PhD, we showed that K2P channels and particularly subunits of THIK and TREK subfamilies channels can also form functional heterodimers with other subunits of the same subfamily. We first proved that subunits physically interact combining biochemistry, immunocytochemistry, FRET and electrophysiology. Interestingly, heterodimers display specific conductances, regulations and pharmacology compared to homodimers.These studies showed that the diversity and number of K2P channel conductances are larger than expected. In conclusion, mixing among subunits from the same subfamily form new channels with unique properties and so new therapeutic targets

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les nucléotides cycliques (NC) apparaissent comme des régulateurs majeurs du tonus vasculaire. Produits dans les cellules musculaires lisses (CMLs) par les cyclases, les NC agissent par l’intermédiaire des protéines effectrices qui modulent de nombreux mécanismes régulateurs de la vasomotricité. Les phoshodiestérases (PDEs) qui dégradent les NC assurent le contrôle spatiotemporel de leur réponse biologique. L’objectif de mon travail était de préciser les mécanismes par lesquels le tonus artériel est contrôlé par certaines PDEs. J’ai réalisé cette exploration en utilisant des artères coronaires ou mésentériques de rat, en situation physiologique puis dans un modèle d’insuffisance cardiaque (IC) chronique.Dans la première partie de mon travail, nous nous sommes intéressés au mécanisme par lequel les PDE3 et PDE4 régulent le tonus de l’artère coronaire.Par une approche expérimentale plus intégrée de réactivité vasculaire sur artère coronaires isolées, nous avons montré l’importance du canal potassique BK(Ca) dans l’effet relaxant des inhibiteurs de PDE3 et PDE4. De plus, nous avons constaté une contribution différentielle de ces canaux selon le mode de stimulation de la génération d’un NC, l’AMPc. A l’échelle de la CML, notre étude a permis de suggérer l’existence d’un signalosome impliquant les PDE3/PDE4 et du canal potassique BK(Ca), indiqué par la technique de Proximity Ligation Assay. En accord avec cette hypothèse, le contrôle des BK(Ca) par ces PDEs a pu être mis en évidence par la technique du Patch-Clamp. De manière intéressante, la contribution du couplage fonctionnel entre le canal BKCa et les PDE3 et PDE4 n’a pas été retrouvée dans les artères isolées de rats atteints d’IC. Ceci pourrait être expliqué par une diminution de l’expression des canaux BK(Ca) ainsi que, au moins partiellement, par une raréfaction de leur localisation à proximité de la PDE4B.Dans la deuxième partie de mon travail nous avons exploré les rôles des PDE3, PDE4 et de la PDE2 en particulier, dans la régulation du tonus de l’artère mésentérique de rats atteints d’IC, en comparaison aux rats contrôles. En effet, la contribution de la PDE2 est suggérée par la capacité d’un inhibiteur sélectif de cette enzyme à diminuer la réponse des artères isolées à une stimulation vasocontractante. Nous avons ensuite exploré les effets de cet inhibiteur dans d’autres types de réponses impliquant les NC.L’ensemble de ces travaux ajoute un niveau de complexité à la compréhension des mécanismes de la régulation de la vasomotricité des artères de résistance par les PDEs. Les altérations de cette voie de signalisation que nous avons mises en évidence dans l’IC pourraient contribuer à la dysfonction vasculaire qui accompagne la maladie. / Cyclic nucleotides (CN) appears to be important regulator of vascular tone. Produced in smooth muscle cells (SMCs) by cyclases, CN act through activation of key effectors involved in the regulation of vascular tone. Phoshodiesterases (PDEs), which degrade CN, provide spatiotemporal control of their biological responses. The aim of my work was to understand how vascular tone is controlled by some PDEs and how it is altered during heart failure (HF). For this, I used rat coronary and mesenteric arteries.In the first part of my work, we were interested in defining the contribution of PDE3 and PDE4 in the regulation of coronary tone. Using vascular reactivity technique, we demonstrate the importance of large-conductance Ca2+-activated potassium channel (BK(Ca)) channel in the relaxant effect of PDE3 and PDE4 inhibitor. Moreover, their contribution was different depending on the mode of cAMP production, a type of CN. At the cellular level, Proximity Ligation Assay experiments suggest the existence of a signalosome that involves PDE3/PDE4 andBK(Ca). According to this result, the control of BK(Ca) activity by these PDEs was demonstrated using the Patch-Clamp technique. Interestingly, the contribution of the functional coupling involving the BK(Ca) and PDE3/PDE4 is lost during HF. This may be explained by the decrease of BK(Ca) expression and [BK(Ca)-PDE4B] duplex signal in coronary arteries isolated from HF rat.In the second part of my work, we investigated the role of PDE3, PDE4 and PDE2 particularly, in the regulation of rat mesenteric artery tone during HF. In fact, PDE2 selective inhibitor, decreased the contractile response of isolated arteries. Then, we investigated the effect of PDE2 inhibition in other pathway that involve CN.Our findings underline the complexity of PDEs in the regulation of resistance artery tone. During HF, some CN signaling pathway are impaired leading to vascular dysfunction which can aggravate the pathology.

Le but de cette étude était d'élucider les mécanismes biochimiques qui régulent les canaux K$\sp+$ de type (GK$\rm\sb{Ca}),$ impliqués dans le contrôle du tonus des muscles lisses des voies respiratoires (MLVR). Des mesures pharmacologiques ont permis de démontrer que le 3-morpholino-sydnonimine (SIN-1) relaxe des fragments de bronches de rat précontractées par 0.2 $\mu$M carbachol, de façon concentration-dépendante. Par contre, lorsque la contribution de la conductance potassique (GK) est éliminée, en présence de 135 mM KCl dans le milieu extracellulaire ou lorsque la guanylate cyclase soluble (GCs) est inhibée par 10 $\mu$M de bleu de méthylène (BM), l'effet relaxant du SIN-1 est moins efficace, ce qui suggère que le monoxyde d'azote (NO$\sp\cdot)\sp*$ pourrait activer plusieurs effecteurs pour induire son effet relaxant via deux voies: une voie dépendante du GMPc et une autre qui serait indépendante de ce messager. Un autre objectif envisagé était de démontrer que le NO avait un effet relaxant indépendant du GMPc, et qu'il pourrait être dû, en partie, à une activation directe des GK$\rm\sb{Ca}.$ Les tests pharmacologiques montrent que 100 nM de charybdotoxine (ChTX), un inhibiteur spécifique des GK$\rm\sb{Ca},$ changent la sensibilité des MLVR au SIN-1 lorsque la GCs est inhibée, ce qui indique que les GK$\rm\sb{Ca}$ pourraient être activées directement par le NO. Ces résultats ont été confirmés au niveau moléculaire, suite à la reconstitution des canaux dans les BLP. Le SIN-1 (NO), mais pas ses métabolites, active les GK$\rm\sb{Ca}$ avec une EC$\sb{50}$ évaluée à 30 $\mu$M SIN-1. Afin de vérifier le mode d'activation direct des GK$\rm\sb{Ca}$ par le NO, des expériences ont été réalisées en présence de 5 mM DTT, un agent réducteur qui empêche le NO d'activer les GK$\rm\sb{Ca},$ seulement lorsqu'il est ajouté du côté intracytoplasmique (trans) du canal. Ces résultats tendent à prouver que l'activation directe des GK$\rm\sb{Ca}$ des MLVR, résulterait d'une interaction du NO avec les groupements des chaînes latérales d'acides aminés, situés sur les boucles intracellulaires de la sous-unité $\alpha,$ selon un mécanisme de nitrosylation**. En revanche, le DTT n'est plus capable de renverser l'effet du NO, ce qui suggère l'implication de d'autres groupements autres que les SH avec lesquels interagit le NO. En conclusion, cette étude a permis de montrer, pour la première fois, que le NO pourrait augmenter la P$\rm\sb{o}$ des canaux K$\sp+$ de type GK$\rm\sb{Ca}$ des MLVR par un mécanisme indirect (phosphorylation) catalysée par la PKG en présence du GMPc et par une interaction directe (nitrosylation) avec la sous-unité $\alpha$ du canal, sans altérer la conductance ni la sensibilité du canal au Ca$\sp{2+}$ et au voltage, ce qui fait de ce type de canal un effecteur sensible et efficace dans le contrôle de la relaxation des MLVR Le NO dans un milieu biologique se trouve dans un état radicalaire NO actif. $\sp{**}$nitrosylation est un terme qui désigne l'interaction covalente entre le NO et les groupements SH des protéines. [Symboles non conformes]

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Differentes études ont montré que la sensibilité au Ca2+ du canal KCa3.1, un canal potassique indépendant du voltage, était conférée par la protéine calmoduline (CaM) liée de façon constitutive au canal. Cette liaison impliquerait la région C-lobe de la CaM et un domaine de $\ikca$ directement relié au segment transmembranaire S6 du canal. La CaM pourrait égalment se lier au canal de façon Ca2+ dépendante via une interaction entre un domaine de KCa3.1 du C-terminal (CaMBD2) et la région N-lobe de la CaM. Une étude fut entreprise afin de déterminer la nature des résidus responsables de la liaison entre le domaine CaMBD2 de KCa3.1 et la région N-lobe de la CaM et leur rôle dans le processus d'ouverture du canal par le Ca2+. Une structure 3D du complexe KCa3.1/CaM a d'abord été générée par modélisation par homologie avec le logiciel MODELLER en utilisant comme référence la structure cristalline du complexe SK2.2/CaM (PDB: 1G4Y). Le modèle ainsi obtenu de KCa3.1 plus CaM prévoit que le segment L361-S372 dans KCa3.1 devrait être responsable de la liaison dépendante du Ca2+ du canal avec la région N-lobe de la CaM via les résidus L361 et Q364 de KCa3.1 et E45, E47 et D50 de la CaM. Pour tester ce modèle, les résidus dans le segment L361-S372 ont été mutés en Cys et l'action du MTSET+ (chargé positivement) et MTSACE (neutre) a été mesurée sur l'activité du canal. Des enregistrements en patch clamp en configuration ``inside-out`` ont montré que la liaison du réactif chargé MTSET+ au le mutant Q364C entraîne une forte augmentation du courant, un effet non observé avec le MTSACE. De plus les mutations E45A et E47A dans la CaM, ont empêché l'augmentation du courant initié par MTSET+ sur le mutant Q364C. Une analyse en canal unitaire a confirmé que la liaison MTSET+ à Q364C cause une augmentation de la probabilité d'ouverture de KCa3.1 par une déstabilisation de l'état fermé du canal. Nous concluons que nos résultats sont compatibles avec la formation de liaisons ioniques entre les complexes chargés positivement Cys-MTSET+ à la position 364 de KCa3.1 et les résidus chargés négativement E45 et E47 dans la CaM. Ces données confirment qu'une stabilisation électrostatique des interactions CaM/KCa3.1 peut conduire à une augmentation de la probabilité d'ouverture du canal en conditions de concentrations saturantes de Ca2+. / The Ca2+ sensitivity of the voltage-insensitive calcium activated potassium channel of intermediate conductance KCa3.1 is conferred by calmodulin (CaM) constitutively bound to the membrane-proximal region of the channel intracellular C-terminus. A study was performed to investigate the nature of the residues involved in the CaM/KCa3.1 interactions and determine how these interactions could modulate the channel gating properties. A 3D-structure of the KCa3.1/CaM complex was first generated by homology modeling with MODELLER using as template the crystal structure of SK2.2/CaM complex (PDB: 1G4Y). The resulting structural model of KCa3.1 plus CaM predicts that the segment L361-S372 in KCa3.1 should be responsible for the Ca2+-dependent binding of the channel to the CaM-N lobe, with residues L361 and Q364 facing residues E45, E47 and D50 of CaM. To test this model residues in L361-S372 segment were substituted by Cys and the action of MTSET+ (positive charged) and MTSACE (neutral charged) measured on channel activity. Inside-out patch clamp recordings showed that the binding of the charged MTSET+ reagent to the Q364C mutant resulted in a strong current increase, an effect not seen with the neutral MTSACE. The mutations E45A and E47A in CaM prevented the current increase initiated by MTSET+ on the Q364C mutant. A single channel analysis confirmed that the binding of MTSET+ to Q364C caused an increase in the channel open probability by a destabilization of the channel closed state. Altogether, our results are compatible with the formation of ionic bonds between the positively charged Cys-MTSET+ complex at position 364 in KCa3.1 and the negatively charged E45 and E47 residues in CaM, and confirm that an electrostatic stabilization of the CaM/KCa3.1 interactions can lead to an increase in the channel open probability at saturating Ca2+.

Les encéphalites limbiques à autoanticorps anti-CASPR2 sont des atteintes du système nerveux central caractérisées par des troubles de la mémoire et des crises d’épilepsie. La protéine CASPR2 (Contactin-associated protein-like 2), avec son partenaire TAG-1, est connue pour son rôle dans le rassemblement des canaux potassiques voltage-dépendants (Kv1.1 et Kv1.2) dans la région juxtaparanodale des nœuds de Ranvier ; régions essentielles pour la conduction rapide des messages nerveux. Par ailleurs, de plus en plus d’études suggèrent un rôle de CASPR2 dans la plasticité synaptique et l’excitabilité neuronale, en lien avec les symptômes observés chez les patients présentant des anticorps anti-CASPR2. Cependant, le rôle pathogénique des anticorps anti-CASPR2 dans les encéphalites limbiques reste loin d’être compris. Au cours de ma thèse, j’ai souhaité améliorer la connaissance des mécanismes pathologiques des anticorps anti-CASPR2 de patient dans l’encéphalite limbique auto-immune. Pour cela, j’ai déterminé les caractéristiques biologiques des anticorps anti-CASPR2, suggérant un rôle direct des anticorps sur la fonction de CASPR2 en ciblant les domaines N-terminaux de la protéine. De plus, j’ai identifié deux mécanismes d’action potentiels des anticorps anti-CASPR2 sur l’interaction entre CASPR2 et TAG-1 et sur l’expression des canaux Kv1.2 en surface. Ces travaux impliquent d’avantage les anticorps anti-CASPR2 dans la pathogénicité des encéphalites limbiques auto-immunes / Anti-CASPR2 autoimmune limbic encephalitis is a central nervous system disorder characterized by memory disorders and epilepsy. CASPR2 (Contactin-associated protein-like 2) with its partner TAG-1, is known for its role in the clusterisation of voltage-dependent potassium channels (Kv1.1 and Kv1.2) in the juxtaparanodal region of node of Ranvier; which are essential for the rapid conduction of nerve signals. In addition, an increasing number of studies suggest a role of CASPR2 in synaptic plasticity and neuronal excitability, in relation with the symptoms observed in patients with anti-CASPR2 antibodies. However, the pathogenic role of anti-CASPR2 antibodies in limbic encephalitis remains far from clear. During my thesis I wished to improve our understanding of the mechanisms mediated by anti-CASPR2 antibodies in limbic encephalitis. To this end, I determined the biological characteristics of anti-CASPR2 antibodies, suggesting a direct role of antibodies on CASPR2 function by targeting its N-terminal domains. Furthermore, I identified two potential mechanisms of anti-CASPR2 antibodies on CASPR2/TAG-1 interaction and on Kv1.2 cell surface expression. These works further implicate anti-CASPR2 antibodies in the pathogenicity of autoimmune limbic encephalitis