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O controle da superfície química em colunas capilares abertas é de fundamental importância para atingir um alto desempenho na análise cromatográfica, sendo muito estudada ao longo das décadas de 70 e 80, mas tendo pouco destaque nos últimos anos por parte dos pesquisadores. A atividade da superfície de uma coluna capilar é causada por grupos silanol (Si-OH) e impurezas como metais, por exemplo. A presença destes grupos silanol faz com que alguns compostos sofram adsorção, principalmente pela formação de pontes de hidrogênio, originando picos com longas caudas no cromatograma. Por isso, a eliminação dos sítios ativos faz-se necessária quando uma amostra apresenta interação com a superfície da coluna. Esta desativação pode ser feita por meio de agentes silanizantes que reagem com os grupos hidroxila. Visto que a maioria dos artigos publicados sobre este assunto envolve colunas de vidro, o presente trabalho estudou os efeitos de cada fase do pré-tratamento de tubos aplicado para as colunas atuais de sílica fundida, verificando os agentes silanizantes HMDS, DPTMDS e TPDMDS que seriam mais adequados para suportar as fases estacionárias OV-73 e OV-17. Também se avaliou o uso de filmes finos de 0,01 , 0,05 e 0,10 ?m de polietileno glicol (PEG) como alternativa para a desativação da parede interna do capilar, o qual mostrou resultados satisfatórios de estabilidade e inatividade. / The control of the inner surface in open tubular capillary columns has fundamental importance to reach a high performance in gas chromatography analysis. It was very studied during 1970´s and 1980´s, but has not interested the researches along last years, not excluding also, the possibility of commercial secrets regarding column preparation. The activity on the surface of capillary column is mainly caused by silanol groups (Si-OH) and impurities such as metal ions and water. These groups favours reversible and irreversible adsorption of polar compounds, which results in tailed peak shapes and incomplete elution from the column. Therefore, the elimination of the active sites is necessary. The deactivation procedures are based on blocking of silanol groups by means of chemical reaction. This present work studied the effects of the surface pretreatment steps applied to fused silica capillary columns. Some silylating agents such as HMDS, DPTMDS and TPDMDS were valued. The coating behavior using OV-73 and OV-17 stationary phases was studied too. Film thickness of 0,01 , 0,05 and 0,10 ?m of poly(ethylene glycol) (PEG) was applied as alternative procedure, showing good stability and column deactivation.

O controle da superfície química em colunas capilares abertas é de fundamental importância para atingir um alto desempenho na análise cromatográfica, sendo muito estudada ao longo das décadas de 70 e 80, mas tendo pouco destaque nos últimos anos por parte dos pesquisadores. A atividade da superfície de uma coluna capilar é causada por grupos silanol (Si-OH) e impurezas como metais, por exemplo. A presença destes grupos silanol faz com que alguns compostos sofram adsorção, principalmente pela formação de pontes de hidrogênio, originando picos com longas caudas no cromatograma. Por isso, a eliminação dos sítios ativos faz-se necessária quando uma amostra apresenta interação com a superfície da coluna. Esta desativação pode ser feita por meio de agentes silanizantes que reagem com os grupos hidroxila. Visto que a maioria dos artigos publicados sobre este assunto envolve colunas de vidro, o presente trabalho estudou os efeitos de cada fase do pré-tratamento de tubos aplicado para as colunas atuais de sílica fundida, verificando os agentes silanizantes HMDS, DPTMDS e TPDMDS que seriam mais adequados para suportar as fases estacionárias OV-73 e OV-17. Também se avaliou o uso de filmes finos de 0,01 , 0,05 e 0,10 ?m de polietileno glicol (PEG) como alternativa para a desativação da parede interna do capilar, o qual mostrou resultados satisfatórios de estabilidade e inatividade. / The control of the inner surface in open tubular capillary columns has fundamental importance to reach a high performance in gas chromatography analysis. It was very studied during 1970´s and 1980´s, but has not interested the researches along last years, not excluding also, the possibility of commercial secrets regarding column preparation. The activity on the surface of capillary column is mainly caused by silanol groups (Si-OH) and impurities such as metal ions and water. These groups favours reversible and irreversible adsorption of polar compounds, which results in tailed peak shapes and incomplete elution from the column. Therefore, the elimination of the active sites is necessary. The deactivation procedures are based on blocking of silanol groups by means of chemical reaction. This present work studied the effects of the surface pretreatment steps applied to fused silica capillary columns. Some silylating agents such as HMDS, DPTMDS and TPDMDS were valued. The coating behavior using OV-73 and OV-17 stationary phases was studied too. Film thickness of 0,01 , 0,05 and 0,10 ?m of poly(ethylene glycol) (PEG) was applied as alternative procedure, showing good stability and column deactivation.

Phosphorylcholine (PC) based phospholipid bilayers have been explored as coating materials for various substrates due to their inherent resistance to non-specific protein adsorption. Phospholipids have been used for coatings in capillary electrophoresis (CE) to suppress electroosmotic flow (EOF) and to obtain better separation of proteins. Here, a series of investigations geared towards developing highly stable phospholipid based biomimetic stationary phases for chromatographic separations was performed.Fluid phospholipid bilayers lack the desired chemical and physical stability to serve as long-term coatings. In this work, highly stable phospholipid coatings generated via crosslinking polymerization of bis-SorbPC monomers were investigated. Reproducible EOF and migration times for model proteins were obtained for coated capillaries that were kept at room temperature for up to two months. Furthermore, the effects of surfactants, pH and capillary inner diameter (i.d.) on the stability of the lipid coating were investigated.In an alternate approach, stabilized phospholipid coatings for capillary electrophoresis were investigated via formation of hybrid monolayers. The capillary surface was chemically modified with a cyano group followed by deposition of phospholipid monomers. In this approach, marked enhancements in coating stability were attained with commercially available reagents. The hybrid coating was utilized for protein separations and gave efficiencies comparable to non-stabilized lipid coated capillaries.Fused silica capillaries were modified with phospholipid bilayers that were chemically tuned to introduce specific affinity binding agents, while minimizing nonspecific protein adsorption to the capillary wall. The wall of fused silica was functionalized with DOGS-NTA-Ni2+ lipid to present binding sites inside the capillary for 6xHis-tagged proteins. Fluorescence microscopy and changes in electrophoretic mobility were used to follow the interaction of the model proteins with the functionalized silica surface.The structural similarity of lipid vesicles to cell membranes made them attractive in developing stationary phases for both liquid chromatography and capillary electrophoresis to study interactions between analytes and phospholipid membranes. Stabilized PLB coated silica microspheres were prepared via polymerization of lipid monomers and displayed enhanced stability to extended storage and organic solvent. These highly stable microspheres, while minimizing nonspecific protein adsorption, were also functionalized with DOGS-NTA-Ni2+ and effectively bind 6xHis-EGFP proteins.

Apesar de seu início promissor, a miniaturização da cromatografia líquida tem se desenvolvido de forma lenta devido à dificuldade em adquirir colunas e equipamentos adequados à técnica. Nos últimos anos, o interesse nesta área da cromatografia tem sido crescente em decorrência das inúmeras vantagens proporcionadas pelo uso de colunas com diâmetro interno reduzido. Ainda que as colunas capilares se encontrem disponíveis comercialmente, sua produção em laboratório pode reduzir custos. Vários parâmetros de grande importância na cromatografia, como o tempo de retenção dos analitos e a pressão do sistema, sofrem variações quando a temperatura da coluna é alterada. Em cromatografia líquida capilar, a aplicabilidade da programação de temperatura é uma alternativa viável, uma vez que a distribuição de calor no interior das colunas ocorre de maneira rápida e uniforme. Os detectores espectrométricos de massas são considerados os mais adequados a esta técnica, pois permitem o monitoramento de compostos presentes em amostras pouco concentradas. Em decorrência do alto custo e indisponibilidade destes em alguns laboratórios, as pesquisas instrumentais nesta área têm empregado detectores mais simples, como os baseados na absorção de luz ultravioleta. Contudo o diâmetro interno reduzido das colunas capilares e, por consequência, o baixo volume de injeção da amostra tornam necessário que as celas de detecção sejam apropriadamente dimensionadas para que não ocorra excessivo alargamento dos picos cromatográficos. Desta maneira, o presente trabalho visa o desenvolvimento de colunas empacotadas e monolíticas, bem como a produção de celas de detecção adequadas ao uso em sistemas destinados à cromatografia líquida capilar. O estudo de algumas variáveis de empacotamento permitiu a obtenção de colunas com excelente eficiência. As fases estacionárias monolíticas foram confeccionadas pelo método sol-gel e utilizadas para promover separações bastante rápidas. Uma das celas de detecção produzidas obteve ótimo desempenho quando comparada a duas celas comerciais comumente empregadas em sistemas miniaturizados. A programação de temperatura foi aplicada durante a separação de tetraciclinas e esteróides, sendo estas análises obtidas com maior rapidez quando comparadas às realizadas sob condições isotérmicas. / In spite of its promising start, the miniaturization of liquid chromatography has developed slowly due to the difficulties in obtaining appropriate columns and equipments suitable to this technique. In recent years, interest in this area of chromatography has been increasing due to the several advantages afforded by the use of columns with reduced internal diameter. Although the capillary columns are commercially available, its in-house production can reduce costs. Several parameters of great importance in chromatography, such as the retention time of analytes and the pressure of the system vary widely when the column temperature is changed. In capillary liquid chromatography the applicability of temperature programming is a viable alternative since the heat distribution across the column occurs quickly and uniformly. Mass spectrometric detectors are considered the most suitable for this technique since they allow the monitoring of compounds in low concentrated samples. Due to the high cost and unavailability of these instruments in some laboratories, instrumental research in this area has been using the simpler detectors, such as those based on the absorption of ultraviolet light. However, the reduced internal diameter of capillary columns and, consequently, the low injection volume of sample imply an appropriate dimensioning of the detection cell, so that excessive broadening of chromatographic peaks is avoided. Thus, this work aims with the development of monolithic and packed columns, as well as the production of suitable cells for the use in detection systems for capillary liquid chromatography. The study of some packing variables allowed to obtain columns with excellent efficiency. Monolithic stationary phases were prepared by sol-gel process and were used to promote very fast separations. One of the obtained detection cells produced good performance when compared to two commercial cells commonly used in miniaturized systems. Temperature programming was applied for the separation of tetracyclines and steroids, at higher speed when compared to those obtained under isothermal conditions.

Apesar de seu início promissor, a miniaturização da cromatografia líquida tem se desenvolvido de forma lenta devido à dificuldade em adquirir colunas e equipamentos adequados à técnica. Nos últimos anos, o interesse nesta área da cromatografia tem sido crescente em decorrência das inúmeras vantagens proporcionadas pelo uso de colunas com diâmetro interno reduzido. Ainda que as colunas capilares se encontrem disponíveis comercialmente, sua produção em laboratório pode reduzir custos. Vários parâmetros de grande importância na cromatografia, como o tempo de retenção dos analitos e a pressão do sistema, sofrem variações quando a temperatura da coluna é alterada. Em cromatografia líquida capilar, a aplicabilidade da programação de temperatura é uma alternativa viável, uma vez que a distribuição de calor no interior das colunas ocorre de maneira rápida e uniforme. Os detectores espectrométricos de massas são considerados os mais adequados a esta técnica, pois permitem o monitoramento de compostos presentes em amostras pouco concentradas. Em decorrência do alto custo e indisponibilidade destes em alguns laboratórios, as pesquisas instrumentais nesta área têm empregado detectores mais simples, como os baseados na absorção de luz ultravioleta. Contudo o diâmetro interno reduzido das colunas capilares e, por consequência, o baixo volume de injeção da amostra tornam necessário que as celas de detecção sejam apropriadamente dimensionadas para que não ocorra excessivo alargamento dos picos cromatográficos. Desta maneira, o presente trabalho visa o desenvolvimento de colunas empacotadas e monolíticas, bem como a produção de celas de detecção adequadas ao uso em sistemas destinados à cromatografia líquida capilar. O estudo de algumas variáveis de empacotamento permitiu a obtenção de colunas com excelente eficiência. As fases estacionárias monolíticas foram confeccionadas pelo método sol-gel e utilizadas para promover separações bastante rápidas. Uma das celas de detecção produzidas obteve ótimo desempenho quando comparada a duas celas comerciais comumente empregadas em sistemas miniaturizados. A programação de temperatura foi aplicada durante a separação de tetraciclinas e esteróides, sendo estas análises obtidas com maior rapidez quando comparadas às realizadas sob condições isotérmicas. / In spite of its promising start, the miniaturization of liquid chromatography has developed slowly due to the difficulties in obtaining appropriate columns and equipments suitable to this technique. In recent years, interest in this area of chromatography has been increasing due to the several advantages afforded by the use of columns with reduced internal diameter. Although the capillary columns are commercially available, its in-house production can reduce costs. Several parameters of great importance in chromatography, such as the retention time of analytes and the pressure of the system vary widely when the column temperature is changed. In capillary liquid chromatography the applicability of temperature programming is a viable alternative since the heat distribution across the column occurs quickly and uniformly. Mass spectrometric detectors are considered the most suitable for this technique since they allow the monitoring of compounds in low concentrated samples. Due to the high cost and unavailability of these instruments in some laboratories, instrumental research in this area has been using the simpler detectors, such as those based on the absorption of ultraviolet light. However, the reduced internal diameter of capillary columns and, consequently, the low injection volume of sample imply an appropriate dimensioning of the detection cell, so that excessive broadening of chromatographic peaks is avoided. Thus, this work aims with the development of monolithic and packed columns, as well as the production of suitable cells for the use in detection systems for capillary liquid chromatography. The study of some packing variables allowed to obtain columns with excellent efficiency. Monolithic stationary phases were prepared by sol-gel process and were used to promote very fast separations. One of the obtained detection cells produced good performance when compared to two commercial cells commonly used in miniaturized systems. Temperature programming was applied for the separation of tetracyclines and steroids, at higher speed when compared to those obtained under isothermal conditions.

Orientador: Carla Beatriz Grespan Bottoli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T03:14:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sato_MarianaRobertoGama_D.pdf: 4595333 bytes, checksum: 8882cf8d1d6576b19fd550c9d1d84f8b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O desenvolvimento da cromatografia líquida capilar (CLC), como uma alternativa à cromatografia líquida de alta eficiência, tem se destacado no âmbito da miniaturização, uma tendência geral em instrumentação analítica para separações cromatográficas. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar fases estacionárias monolíticas para uso em CLC, empregando monolitos poliméricos orgânicos baseados em metacrilatos hidrofóbicos e hidrofílicos. O preparo das fases estacionárias monolíticas foi realizado in situ, ou seja, o recheio foi moldado no interior das colunas capilares de 150 µm de diâmetro interno. Foram empregados os monômeros butil metacrilato, lauril metacrilato e trimetilolpropano trimetacrilato no preparo de fases estacionárias monolíticas para separações no modo fase reversa; o polietileno glicol dimetacrilato foi empregado no preparo de fases estacionárias para separações no modo HILIC. As condições de preparo das fases estacionárias monolíticas foram comparadas e envolveram a aplicação de diferentes métodos de iniciação da reação de polimerização, como iniciação por radiação UV e iniciação térmica. O simples entrecruzamento de um monômero multifuncional e a polimerização controlada via radical livre também foram aplicados como métodos de preparo dos materiais monolíticos. As fases estacionárias monolíticas foram caracterizadas por técnicas físicas, como microscopia eletrônica de varredura e porosimetria por sorção de nitrogênio; as colunas preparadas foram avaliadas cromatograficamente pela técnica de CLC. As fases estacionárias monolíticas mostraram eficiência cromatográfica de até 47000 pratos m-1 para a separação de alquilbenzenos no modo fase reversa e de até 45000 pratos m-1 para a separação de acrilamidas no modo HILIC / Abstract: The development of capillary liquid chromatography (CLC), as alternative to high performance liquid chromatography, has emerged in miniaturization studies, a common trend in analytical instrumentation for chromatographic separations. The goal of this work was to develop and characterize monolithic stationary phases for use in CLC, using organic polymer monoliths based on hydrophobic and hydrophilic methacrylates. Stationary phases were prepared in situ by molding of the material inside the capillary columns of 150 µm of internal diameter. The monomers butyl methacrylate, lauryl methacrylate and trimethylolpropane trimethacrylate was employed to prepare monolithic stationary phases for separations by reversed phase; polyethylene glycol was used to prepare monolithic stationary phases for separations by HILIC mode. The preparation conditions were compared and involved the application of different initiation methods for polymerization reactions, such as initiation by UV radiation and initiation by heating. The single crosslinking of multifunctional monomer and controlled free-radical polymerization were also applied as preparation methods of monolithic materials. The monolithic stationary phases were characterized by physical techniques as scanning electronic microscopy and nitrogen sorption porometry; the columns prepared were chromatographic evaluated by CLC. Stationary phases showed chromatographic efficiency up to 47000 plates m-1 for the separation of alkylbenzenes in reversed phase mode and up to 45000 plates m-1 for the separation of acrylamides by HILIC mode / Doutorado / Quimica Analitica / Doutora em Ciências

Essa dissertação de mestrado descreve o desenvolvimento de hardwares de colunas para cromatografia líquida capilar. O processo de desenvolvimentos desses dispositivos é descrito gradativamente e os pontos fortes e as limitações de cada modelo de hardware são discutidos. O melhor modelo de hardware desenvolvido apresentou produção simples, fácil conexão ao sistema cromatográfico e resistência a pressões superiores a 900 bar. Sucessivamente ao estabelecimento de um modelo de hardware apropriado, os efeitos dos materiais do hardware na eficiência das colunas foram avaliados. Poucos estudos relatam a influência do hardware nas separações em escala capilar, de forma que essa dissertação contribui para o preenchimento dessa lacuna. Capilares de aço inoxidável e sílica fundida e frits de aço inoxidável e fibra de vidro foram avaliados. Colunas com eficiências superiores a 100.000 pratos por metro foram produzidas. / This master\'s dissertation describes the development of hardware for capillary liquid chromatography columns. The development process of the devices is described gradually and the strengths and limitations of each model of hardware are discussed. The best-developed hardware model presented easy production, practice connection to the chromatographic system and resistance to pressures greater than 900 bar. After the establishment of an appropriate hardware model, the effects of hardware materials on the efficiency of the columns were evaluated. Few studies report the influence of the hardware on capillary scale separations; therefore, this dissertation contributes to fill this gap. Capillaries of stainless steel and fused silica and frits of stainless steel and glass fiber were evaluated. Columns with efficiencies greater than 100,000 plates per meter were produced.

Essa dissertação de mestrado descreve o desenvolvimento de hardwares de colunas para cromatografia líquida capilar. O processo de desenvolvimentos desses dispositivos é descrito gradativamente e os pontos fortes e as limitações de cada modelo de hardware são discutidos. O melhor modelo de hardware desenvolvido apresentou produção simples, fácil conexão ao sistema cromatográfico e resistência a pressões superiores a 900 bar. Sucessivamente ao estabelecimento de um modelo de hardware apropriado, os efeitos dos materiais do hardware na eficiência das colunas foram avaliados. Poucos estudos relatam a influência do hardware nas separações em escala capilar, de forma que essa dissertação contribui para o preenchimento dessa lacuna. Capilares de aço inoxidável e sílica fundida e frits de aço inoxidável e fibra de vidro foram avaliados. Colunas com eficiências superiores a 100.000 pratos por metro foram produzidas. / This master\'s dissertation describes the development of hardware for capillary liquid chromatography columns. The development process of the devices is described gradually and the strengths and limitations of each model of hardware are discussed. The best-developed hardware model presented easy production, practice connection to the chromatographic system and resistance to pressures greater than 900 bar. After the establishment of an appropriate hardware model, the effects of hardware materials on the efficiency of the columns were evaluated. Few studies report the influence of the hardware on capillary scale separations; therefore, this dissertation contributes to fill this gap. Capillaries of stainless steel and fused silica and frits of stainless steel and glass fiber were evaluated. Columns with efficiencies greater than 100,000 plates per meter were produced.

Several novel polymer monoliths for the analysis of peptides and proteins were synthesized using polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) as crosslinker. Photo-initiated copolymerization of polyethylene glycol methyl ether acrylate and PEGDA yielded an inert monolith that could be used for size exclusion liquid chromatography of peptides and proteins. This macroscopically uniform monolith did not shrink or swell in either water or tetrahydrofuran. More importantly, it was found to resist adsorption of both acidic and basic proteins in aqueous buffer without any organic solvent additives. A strong cation-exchange polymer monolith was synthesized by copolymerization of 2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic acid (AMPS) and PEGDA. A ternary porogen (water, methanol and ethyl ether) was found suitable to prepare a flow-through monolith with moderate pressure drop in aqueous buffer. The resulting monolith showed excellent ion exchange capillary liquid chromatography of peptides using a simple salt gradient. Extremely narrow peaks were obtained for the analysis of synthetic peptides, natural peptides and a protein digest. A peak capacity of 179 was achieved. Although the poly(AMPS) monolith demonstrated extraordinary performance, one main drawback of this monolith was its relatively strong hydrophobicity. A decrease in hydrophobicity was achieved by using more hydrophilic monomers (e.g., sulfoethyl methacrylate or vinyl sulfonic acid). The most hydrophilic poly(vinyl sulfonic acid) monolith provided high resolution cation-exchange liquid chromatography of protein standards and lipoproteins. Use of the new PEGDA biocompatible crosslinker over the conventional ethylene glycol dimethacrylate crosslinker for the preparation of polymer monoliths was found to be advantageous for the analysis of biological compounds in several chromatography modes.